具有穩(wěn)定的枯草桿菌蛋白酶的液體自動(dòng)餐具清洗洗滌劑組合物的制作方法
【專利說明】具有穩(wěn)定的枯草桿菌蛋白酶的液體自動(dòng)餐具清洗洗藻劑組 合物
[0001] 對(duì)序列表的引用
[0002] 本申請(qǐng)包含一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。該計(jì)算機(jī)可讀形式通過引用結(jié)合在 此。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及枯草桿菌蛋白酶在液體自動(dòng)餐具清洗（ADW)洗涂劑中的穩(wěn)定性。 陽004] 背景 陽0化]通常用一定含量的助洗劑配制液體自動(dòng)餐具清洗（ADW)洗涂劑。該配制品可W包 括強(qiáng)馨合助洗劑（例如，含憐助洗劑，如憐酸鹽和麟酸鹽），并且它還可W包括其他助洗劑 (例如，弱助洗劑或沉淀助洗劑，如碳酸鋼、碳酸氨鋼和巧樣酸鋼）。典型地，不用任何陰離 子型表面活性劑配制液體ADW洗涂劑，但是它們可含有或可不含非離子型表面活性劑。 [0006] 當(dāng)配制一種液體餐具清洗（ADW)洗涂劑時(shí)，令人希望的是包括一種枯草桿菌蛋白 酶類型的蛋白酶，W便改善蛋白質(zhì)污物的去除。然而，枯草桿菌蛋白酶在洗涂劑中的儲(chǔ)存穩(wěn) 定性存在著問題。 陽007] WO94/29428披露了包含酶和酶穩(wěn)定系統(tǒng)的液體ADW洗涂劑，運(yùn)些洗涂劑不含含 憐助洗劑。WO94/04651和WO2009/118375披露了包含蛋白酶和作為可逆蛋白酶抑制劑的 膚醒的液體洗涂劑。 陽00引概述
[0009] 諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將一種強(qiáng)馨合助洗劑滲入一種液體ADW洗涂劑中趨向于使 得任何存在的枯草桿菌蛋白酶不穩(wěn)定，但是滲入一種膚醒對(duì)于枯草桿菌蛋白酶在包含一種 強(qiáng)馨合助洗劑的液體ADW洗涂劑中的穩(wěn)定特別有效。
[0010] 因此，本發(fā)明提供了一種液體（餐具清洗洗涂劑）組合物，包括：
[0011] a) -種強(qiáng)馨合助洗劑，
[001引b) -種枯草桿菌蛋白酶，W及
[0013] C)-種枯草桿菌蛋白酶抑制劑，該抑制劑是一種膚醒或其亞硫酸氨鹽加合物或一 種膚甲基酬，其中該甲基可任選地被面素取代，并且其中該膚可任選地具有一個(gè)N端保護(hù) 基團(tuán)；
[0014] 其中該組合物實(shí)質(zhì)上不含陰離子型表面活性劑。
[0015] 本發(fā)明的其他方面和實(shí)施例在說明書和實(shí)例下是顯而易見的。
[0016] 詳細(xì)說明
[0017] 枯草桿菌蛋白酶
[0018] 在本發(fā)明的上下文中，枯草桿菌蛋白酶家族巧C3.4.21.62)應(yīng)理解為如下文獻(xiàn) 所述：西仁（Siezen)等人，蛋白質(zhì)工程（Protein化即g. )4(1991)719-737 ;和西仁等人，蛋 白質(zhì)科學(xué)（ProteinScience) 6 (1997) 501-523。如文中所描述的，枯草桿菌蛋白酶家族可W 劃分為3個(gè)亞組，即I-SU"真正的"枯草桿菌蛋白酶）、I-S2(高堿性蛋白酶）W及細(xì)胞內(nèi) 枯草桿困蛋白酶。
[0019] 枯草桿菌蛋白酶的實(shí)例是來源于芽抱桿菌的那些，如枯草桿菌蛋白酶lentus、遲 緩芽抱桿菌、枯草桿菌蛋白酶Novo、嘉：t伯枯草桿菌蛋白酶（subtilisinCarlsberg)、地 衣芽抱桿菌、枯草桿菌蛋白酶BPN'、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147W及枯草桿 菌蛋白酶168(描述于WO89/06279中）W及蛋白酶PD138(W0 93/18140)。另外的實(shí)例 描述于WO98/020115、WO01/44452、WO01/58275、WO01/58276、WO03/006602W及WO 04/099401 中。
[0020] 有用的變體的實(shí)例描述于WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116W及WO 98/34946中，尤其是在一個(gè)或多個(gè)W下位置中具有取代的變體：3、4、9、15、27、36、57、68、 76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、 170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252W及 274,使用 BPN'編號(hào)。更優(yōu)選地，運(yùn)些枯草桿菌酶變體可W包括W下突變：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、 *360、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,RS103A、V104I,Y,N、 S106A、G118V，R、H120D，N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、 V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN' 編號(hào)）。
[0021] 可商購的枯草桿菌蛋白酶的實(shí)例包括Kannase?、Everlase?、Primase?、 Duralase?、Esperase?、Alcalase?、Durazym?、Savinase?、Ovozyme?、Liquanase?、 Coronase?、F*olarzyme?、？5^"日36抓^及Clear-LensTMpro;Blaze? (諾維信公司（Novozymes A/S))。其他可商購的蛋白酶包括Ronozyme?P;ro、Maxatase?、Maxacal?、Maxapem?、 Opticle曰n?、Proper曰se?、Pur曰feet?、Pur曰feetOx?、PursfsctPrime?、Excell曰se?、 FN2?、FN3?W及FN4?(可從杜邦公司值upont)獲得）。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，該枯草桿菌蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶309或枯草桿菌 蛋白酶BPN'、或任何運(yùn)些的變體。優(yōu)選地，該枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列與SEQIDNO: 1 或SEQIDN0:4的氨基酸序列具有至少70%的序列一致性，優(yōu)選地至少75%，更優(yōu)選地至 少80%，更優(yōu)選地至少85%，更優(yōu)選地至少90 %，更優(yōu)選地至少95 %、96%、97 %、98%、 99%，并且最優(yōu)選地100%的序列一致性。在一個(gè)實(shí)施例中，該枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序 列是沈QIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3 或沈QIDN0:4。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施例中，引入SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:4的氨基酸序列中的氨基酸取 代、缺失和/或插入的數(shù)目多達(dá)10個(gè)，例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè) 或10個(gè)；或多達(dá)5個(gè)，例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)。運(yùn)些氨基酸變化可W具有微小性 質(zhì)，即，不會(huì)顯著地影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30個(gè) 氨基酸的小缺失；小的氨基-或簇基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸殘基；多達(dá)20-25 個(gè)殘基的小接頭膚；或便于通過改變凈電荷或另一種功能來純化的小延伸，如聚組氨酸段 (tract)、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0024] 保守取代的實(shí)例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸及組氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸（谷氨酷胺和天冬酷胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、異亮氨酸及鄉(xiāng)氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘 氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸）。一般不會(huì)改變特異性活性的氨基酸取代是本 領(lǐng)域已知的并且例如由H.諾伊拉特化化urath)和R.L.希爾巧.L.Hill)，1979,在蛋白 質(zhì)（TheProteins),學(xué)術(shù)出版社，紐約中描述。常見的取代是Ala/Se;r、Val/Ile、Asp/Glu、 Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/ Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/GluW及Asp/Gly。
[0025]可W根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變（坎寧漢 (Cunnin曲am)和威爾斯（Wells) ,1989,科學(xué)（Science) 244:1081-1085)來鑒定多膚中的必 需氨基酸。在后一項(xiàng)技術(shù)中，在分子中的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變，并且測(cè)試所得 突變分子的枯草桿菌蛋白酶活性W鑒定對(duì)分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。還參見，希爾頓 化ilton)等人，1996,生物化學(xué)雜志（J.Biol.Chem.) 271:4699-4708。也可W結(jié)合假定接觸 位點(diǎn)氨基酸的突變，通過如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記等技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，來 對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析，從而確定枯草桿菌蛋白酶的活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用。參 見，例如，德弗斯（deVos)等人，1992,科學(xué)（Science) 255:306-312 ;史密斯（Smith)等人， 1992,分子生物學(xué)雜志（J.Mol.Biol. )224:899-904;烏樂達(dá)維爾（Wlodaver)等人，1992,歐 洲生化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)（陽BSLett. )309:59-64。還可W從與相關(guān)多膚的比對(duì)來推斷鑒定 必需氨基酸。
[00%] 可W做出單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用誘變、重組和/或改組 的已知方法進(jìn)行測(cè)試，隨后進(jìn)行相關(guān)篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森巧ei化aar-Olson) 和薩奧爾（Sauer) ,1988,科學(xué)（Science) 241:53-57 ;博維度owie)和薩奧爾，1989,美國國 家科學(xué)院院刊（Proc.化tl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156 ;W0 95/17413;或WO95/22625所 披露的那些?？蒞使用的其他方法包括易錯(cuò)PCR、隧菌體展示（例如，洛曼化owman)等人， 1991，生物化學(xué)度iochemistry) 30:10832-10837 ;美國專利號(hào) 5, 223, 409 ;W0 92/06204)W 及區(qū)域定向誘變（德比什爾值erbyshire)等人，1986,基因（Gene)46:145;內(nèi)爾（Ner)等 人，1988,DNA7:127)。
[0027] 兩個(gè)氨基酸序列之間的關(guān)聯(lián)度通過參數(shù)"序列一致性"來描述。出于本發(fā)明 的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件燈he化ropean MolecularBiologyOpenSoftwareSuite),賴斯巧ice)等人，2000,遺傳學(xué)趨勢(shì)（Trends Genet.) 16:276-277)(優(yōu)選5. 0. 0版或更新版本）的尼德爾（Needle)程序中所實(shí)施的尼德 爾曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德爾曼）和Wunsch(翁施），1970,分 子生物學(xué)雜志（J.Mol.Biol. )48:443-453)來確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。所 使用的參數(shù)是空位開放罰分10,空位延伸罰分0. 5,W及邸L0SUM62度L0SUM62的EMBOSS版 本）取代矩陣。尼德爾標(biāo)注的"最長(zhǎng)的一致性"的輸出（使用-非簡(jiǎn)化選項(xiàng)獲得）被用作 百分比一致性，并且如下計(jì)算：
[002引（一致的殘基X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）。
[0029] 任選的另外的酶
[0030] 除了枯草桿菌蛋白酶之外，該組合物能可任選地包括一種或多種另外的洗涂劑 酶，例如，5種、4種、3種、2種或1種另外的酶。運(yùn)些另外的酶可W包括另外的蛋白酶、脂肪 酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、果膠酸裂解酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳 聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、過水解酶、漆酶、過氧化物酶和/或面代過氧化物酶。優(yōu)選地，該 另外的酶是一種淀粉酶。
[0031]一般而言，一種或多種所選酶的性質(zhì)應(yīng)與選定的洗涂劑相容（即，最適抑，與其他 酶和非酶成分的相容性，等等），并且該一種或多種酶應(yīng)W有效量存在。 陽〇扣]胎化酶巧巧質(zhì)酶
[0033] 適合的脂肪酶和角質(zhì)酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白 質(zhì)工程化的突變體。實(shí)例包括來自嗜熱真菌屬（Thermomyces)的脂肪酶，例如來自如 在EP258068和EP305216中描述的疏棉狀嗜熱絲抱菌燈.Ianuginosus)(之前命名 為柔毛腐質(zhì)霉）；來自腐質(zhì)霉屬的角質(zhì)酶，例如在WO96/13580中描述的特異腐質(zhì)霉； 一種假單胞菌屬脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌化alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌 (P.pseudoalcaligenes)巧P218272)、洋蔥假單胞菌（P.