專利名稱：一種漆酶及其制備方法與專用生產(chǎn)菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物酶學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種漆酶及其制備方法與專用生產(chǎn)菌株。

背景技術(shù)：
漆醇(p-diphenol oxygen oxidoreductase, EC 1. 10. 3. 2.)是一禾中藍(lán)色、含有多 個銅離子的酚氧化酶，能催化酚類物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)。漆酶氧化的底物包括酚類及其衍 生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。目前通過不斷研究，漆酶可氧化的非酚底 物范圍還在不斷擴大。漆酶(laccase)可降解木質(zhì)素中的酚類和非酚類結(jié)構(gòu)，在木質(zhì)素的 生物降解中發(fā)揮著重要的作用；另外，由于木質(zhì)素中的許多化學(xué)鍵普遍存在于芳香族化合 物中，而漆酶對木質(zhì)素的降解又是氧化性的和非特異性的，這就使得漆酶也能降解芳香族 化合物。漆酶能把分子氧直接還原為水，在沒有H2O2存在下，可催化有機污染物的氧化。漆 酶又能使木素類多酚物質(zhì)以游離基方式進行氧化聚合，替代傳統(tǒng)木材工業(yè)合成樹脂膠粘劑 或其它化學(xué)品，用無污染、低能耗的酶學(xué)的方法取代污染嚴(yán)重的化學(xué)方法，把污染消除在源 頭。因此，漆酶在生物技術(shù)和環(huán)境保護方面有著巨大的應(yīng)用潛力。白腐菌能夠產(chǎn)生漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)和錳氧化物酶(MnP)等，是目前能 夠?qū)⒛举|(zhì)素徹底降解為二氧化碳和水的唯一生物。其產(chǎn)生的漆酶比木質(zhì)素過氧化物酶和錳 過氧化物酶更具有熱穩(wěn)定性。因此，這一生物類群引起了世界生物學(xué)家的極大興趣。白腐菌中的血紅密孔菌被認(rèn)為是研究漆酶的理想菌株。然而，現(xiàn)有已知的菌株其 漆酶活性較低。因此，漆酶的高產(chǎn)菌株的研究迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種漆酶及其制備方法與專用生產(chǎn)菌株。本發(fā)明提供的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001，已于2009年03月 05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北 京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCC Na 2932。菌株MK2001是從海南腐木上分離，并且通過土豆汁培養(yǎng)基(PDA)篩選培養(yǎng)獲得。 該菌是一種需氧菌，最適生長溫度為30°C，發(fā)酵培養(yǎng)時分泌漆酶到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的另一目的在于提供所述血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus) MK200ICGMCC Na 2932在制備漆酶中的應(yīng)用。所述應(yīng)用是將血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus) MK2001 CGMCC Na 2932 在有 氧及避光條件下發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度可為30 士 1°C。所述發(fā)酵培養(yǎng)用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源、氮源和無機組分。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源可包括但不限于以下一種或幾種麥芽糖、蔗糖和葡萄糖， 所述碳源優(yōu)選用麥芽糖。這三種糖作為碳源時菌株生長速度差別不大，但用麥芽糖作碳源 時，比蔗糖和葡萄糖作碳源時產(chǎn)生的漆酶活性高。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源可包括但不限于酒石酸銨；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的無機組分包括硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣和氯化鈷。在實際應(yīng)用中，還可加入營養(yǎng)成分如維生素B” B2, B6等。在培養(yǎng)基中加入小麥麩 皮，漆酶產(chǎn)量可以提高2-3倍。加入玉米粉，漆酶的產(chǎn)量會進一步得到提高。所述IL發(fā)酵培養(yǎng)基具體由下列物質(zhì)組成，麥芽糖10-20g;酒石酸銨l_3g， KH2PO4 1. 32-1. 34g ；NaH2PO4 ‘ 12H20 0. 38-0. 4g ；MgSO4 ‘ 7H20 0. 4-0. 6g ；琥珀酸鈉 (CH2COONa)2 · 6H20 1. 17-1. 19g ；FeSO4 · 7H20 0. 0314-0. 0316g ；CaCl2 · 2H20 0. 09-0. Ilg ； MnSO4 · H2O 0. 034-0. 036g ；CH3COONa · 3H20 0. 407-0. 409g ；CoCl2 · 6H20 0. 05-0. 07g ； ZnSO4 ·7Η20 0. 027-0. 029g ；CuSO4 ·5Η20 :0· 167-0. 169g ；小麥麩皮 7-8 克；玉米粉24_26g ； Tween—80 0.9-1.Iml ；VitaminBl 9. 5-10. 5 μ g ；VitaminB24. 5-5. 5 μ g；VitaminB6 4. 5-5. 5 μ g，其余為水。
所述發(fā)酵培養(yǎng)第3-5天向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2，5- 二甲基苯胺，所述2，5- 二甲基 苯胺的終濃度為10 μ M。發(fā)酵培養(yǎng)完成后，可用常規(guī)分離方法從培養(yǎng)基中分離出漆酶，包括以下步驟離心 分離、超濾濃縮、硫酸銨分級沉淀、離子交換柱、凝膠過濾柱和冷凍分離干燥技術(shù)。通過這些 步驟可以去除大部分的雜蛋白和幾乎全部的色素。發(fā)酵培養(yǎng)ΜΚ2001 CGMCC Na 2932得到的漆酶也屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的另一目的在于提供所述ΜΚ2001 CGMCC Na 2932在酚類及其衍生物、芳胺 及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物降解中的應(yīng)用，在造紙制漿生物漂白和廢水處理中的應(yīng) 用，在木材加工替代化學(xué)膠合劑中的應(yīng)用，在染料降解中的應(yīng)用或在土壤修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一目的在于提供本發(fā)明的漆酶在酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、 芳香羧酸及其衍生物降解中的應(yīng)用，在造紙制漿生物漂白和廢水處理中的應(yīng)用，在木材加 工替代化學(xué)膠合劑中的應(yīng)用，在染料降解中的應(yīng)用或在土壤修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的漆酶制備方法簡單方便，本發(fā)明所提供的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)ΜΚ2001 CGMCC Na 2932經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，得到的漆酶酶活可高達300U/ml。該漆酶 可廣泛應(yīng)用于酚類、芳胺、芳香羧酸及其衍生物的生物降解中；還可應(yīng)用在造紙制漿生物漂 白、土壤修復(fù)、廢水處理和染料降解中，并且還可以在木材加工中替代化學(xué)膠合劑。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。實施例1、發(fā)酵培養(yǎng)血紅密孔菌MK2001制備漆酶一、發(fā)酵培養(yǎng)血紅密孔菌MK2001固體種子培養(yǎng)基含2g/100ml瓊脂的麥芽汁培養(yǎng)基平板。發(fā)酵培養(yǎng)基麥芽糖15g，酒石酸銨 2g，KH2PO4 1. 33g，NaH2PO4 · 12H20 0. 39g， MgSO4 · 7H20 0. 5g,琥珀酸鈉(CH2COONa) 2 · 6H20 1. 18g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 0315g, CaCl2 · 2H200. lg, MnSO4 · H2O 0. 035g, CH3COONa · 3H20 0. 408g, CoCl2 · 6H20 0. 06g, ZnSO4 · 7H20 0. 028g, CuSO4 · 5H20 0. 168g,小麥麩皮 7. 5g,玉米粉 25g, Tween-80 lml, VitaminB1 10 μ g, VitaminB2 5 μ g，VitaminB6 5 μ g，加水至 1L，然后經(jīng) 8 磅高壓濕熱滅菌 30分鐘。將MK2001接種至固體種子培養(yǎng)基，在30°C下培養(yǎng)6-8天。取菌落最邊沿的菌塊(直徑lcm，10塊)，接種到500ml三角瓶內(nèi)的經(jīng)高壓濕熱滅菌過的IOOml發(fā)酵 培養(yǎng)基上，在30°C和240rpm下?lián)u床中暗培養(yǎng)，第四天加入誘導(dǎo)物2，5 二甲基苯胺(2， 5-Dimethy lani line)，使之終濃度為10 μ M，培養(yǎng)12天。收集發(fā)酵液，按照下述方法測定漆 酶活性，培養(yǎng)得到的漆酶活性為300U/ml。本發(fā)明中漆酶活力的測定是用2，2’ -連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (英文簡稱 ABTS) {2,2' -azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulphonate]}來測定的。一 個酶活力單位U的定義在下述條件下，每分鐘內(nèi)催化1 μ M底物的酶量。酶活力的計算公式為U = Α· V/(ε · L · Τ) ·
在以上的公式中，A表示紫外分光光度計吸收值的變化，V表示反應(yīng)體系的體積 (單位:mL)，ε = 3. 6 X IO4M · cnT1 = 36 ( μ mo 1/ml) · cnT1，為氧化型 ABTS 的摩爾消光系 數(shù)，L為比色皿的光徑(單位cm)，T為反應(yīng)的時間(單位分鐘)。本發(fā)明中酶活力測定條件為反應(yīng)體積V = ImL,比色皿的光徑L = O. 5cm,反應(yīng)時 間T = 30秒，反應(yīng)溫度為30°C。其中ImL反應(yīng)體系內(nèi)含有的500 μ L的50mM的酒石酸緩沖 液(pH = 4)，390 μ L的水，100 μ L的500 μ M的ABTS，10 μ L的發(fā)酵液，選用波長為420nm。 如果發(fā)酵液含有漆酶活力太高，可適當(dāng)稀釋。二、提取漆酶1、制備粗漆酶制劑將步驟二收集到的發(fā)酵液進行離心，除去發(fā)酵沉淀物，取上清液真空抽濾，獲得抽 濾液，然后將抽濾液經(jīng)PLGC膜(10000D)超濾，進行初步濃縮。隨后采用兩步硫酸銨沉淀法 沉淀，第一步用35g/100ml的飽和硫酸銨4°C攪拌沉淀，IOOOOrpm離心1小時，棄沉淀，留上 清；第二步用第一步所得的上清液加80g/100ml的飽和硫酸銨4°C溫和攪拌沉淀，4°C靜至 2小時以上，然后IOOOOrpm離心1小時，棄上清，留沉淀。將第二步得到的沉淀用兩倍體積 的IOOmM磷酸鉀緩沖液(pH 5. 7)溶解，然后進行透析，透析液為IOmM的磷酸鉀緩沖液(pH 是 5. 7)。2、分離純化漆酶取上述步驟二中1得到的經(jīng)透析過的粗酶濃縮液用于離子交換柱層析。離子 交換介質(zhì)選用DEAE Sepharose F. F.，緩沖液為20mM的組氨酸緩沖液(pH6. 0)，洗脫液 為0. 1-0. 6M NaCl的組氨酸洗脫液，流速為ImL/分鐘。凝膠過濾層析介質(zhì)選用S印hadex G-100,洗脫液為水，流速為0. 5mL/分鐘，然后將含漆酶的洗脫液冷凍干燥濃縮得漆 酶，-20°C低溫保存。實施例2、菌株MK2001對水稻秸稈進行木質(zhì)素降解預(yù)處理實驗250ml三角瓶酶解作用體系包括漆酶1800U，水稻秸稈0. 4g，0. IM酒石酸緩沖液 15ml (pH4. 0)，補充無菌水至20mL。預(yù)處理溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm/min，處理時間分 別為24小時、48小時、72小時。木質(zhì)素測定方法為范氏法，實驗重復(fù)3次，處理結(jié)果24小 時木質(zhì)素降解33. 9%,48小時木質(zhì)素降解了 54. 5%,72h小時木質(zhì)素降解了 56. 3%。此實施例對水稻秸稈進行木質(zhì)素降解預(yù)處理實驗，實驗結(jié)果表明MK2001漆酶可 有效降解水稻秸稈中木質(zhì)素成分。所述菌株MK2001產(chǎn)生的漆酶用于纖維素乙醇工藝中農(nóng) 作物秸稈的生物預(yù)處理，降解木質(zhì)素組分，提高纖維素的利用率，達到生產(chǎn)纖維素乙醇的目 的。
實施例3、菌株MK2001對多環(huán)芳烴中的蒽和苯并[a]芘兩類化合物降解處理實驗分別取酶液各4. 5ml置于15ml具塞棕色試劑瓶中，加入0. 5ml蒽和苯并[a]芘的乙腈溶液，使反應(yīng)體系的乙腈含量達到10% (體積百分比)，擰緊瓶塞，搖勻，置于暗室培養(yǎng) 24h(28°C)，然后加入5ml乙腈終止反應(yīng)，此時乙腈含量為55% (體積百分比)。振蕩Ih后 (28°C,15000rpm)高速離心，過0. 22 μ m濾膜，采用HPLC進行樣品測定。對照用純水代替酶 液，其它步驟相同。同時利用Trametesversicolor來源的漆酶(漆酶(Tv))作為一組處理 對照。本發(fā)明提供的P. sanguineus漆酶與漆酶(Ps)等同。實驗作用體系為l)lmg/L蒽+lmg/L苯并[a]芘；2) lmg/L蒽+lmg/L苯并[a] 芘 +ZUmr1 漆酶(Ps) ；3) lmg/L 蒽 +lmg/L 苯并[a]芘 +ZUmr1 漆酶(Ps)+ImMABTS ；4) Img/ L 蒽 +lmg/L 苯并[a]芘 +ZUmr1 漆酶(Tv) ；5) lmg/L 蒽 +lmg/L 苯并[a]芘 +ZUmr1 漆 酶(Tv)+ImM ABTS。實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果表明在未添加ABTS時，酶活為ZUml—1的 P. sanguineusMK2001漆酶對lmg/L蒽和苯并[a]芘的降解率分別為16. 6%和6. 0%，顯著 大于T. versicolor漆酶的2. 和0. 1%。當(dāng)添加ImM ABTS時，P. sanguineus漆酶對蒽和 苯并[a]芘降解率顯著增加，達到19. 8%和34. 4%，顯著大于T. versicolor漆酶的7. 0% 和 27. 0%。實驗結(jié)果表明不管是否存在ABTS，P. sanguineus漆酶與Τ. versicolor漆酶對蒽 和苯并[a]芘的降解效果相比，P. sanguineus漆酶具有更為強大的氧化能力；ABTS是漆酶 的底物又是提高漆酶氧化能力的調(diào)節(jié)物質(zhì)，其存在可大大增加漆酶的轉(zhuǎn)化效率。因此，菌株MK2001產(chǎn)生的漆酶可以用于整治廢水和污染土壤，修復(fù)被多環(huán)芳烴、 聯(lián)氯苯酚等污染物的污染。
權(quán)利要求
血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC № 2932。
2.權(quán)利要求1 所述血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC Na 2932 在制備漆酶中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是將所述血紅密孔菌 (Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC Na 2932 在有氧及避光條件下發(fā)酵培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源、 氮源和無機組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源包括下述至少一 種物質(zhì)麥芽糖、蔗糖和葡萄糖，優(yōu)選為麥芽糖；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源包括酒石酸銨；所 述發(fā)酵培養(yǎng)基的無機組分包括硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣和氯化 鈷。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述IL發(fā)酵培養(yǎng)基由下列物質(zhì)組 成，麥芽糖:10-20g ；酒石酸銨:l-3g, KH2PO4 1. 32-1. 34g ；NaH2PO4 · 12Η20 :0· 38-0. 4g ； MgSO4 · 7Η20 :0· 4-0. 6g ；琥珀酸鈉(CH2COONa)2 ‘ 6H20 1. 17-1. 19g ；FeSO4 ‘ 7H20 0. 0314-0. 0316g ；CaCl2 · 2H20 0. 09-0. Ilg ；MnSO4 · H2O 0. 034-0. 036g ；CH3COONa · 3H20 0. 407-0. 409g ；CoCl2 · 6H20 0. 05-0. 07g ；ZnSO4 · 7H20 0. 027-0. 029g ；CuSO4 · 5H20 0. 167-0. 169g ；小麥麩皮 7-8 克；玉米粉24_26g ；Tween-80 0. 9-1. Iml ；VitaminB1 9. 5-10. 5μ g ；VitaminB2 4. 5-5. 5μ g ；VitaminB6 4. 5-5. 5 μ g,其余為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)第3-5天向發(fā)酵培 養(yǎng)基中加入2，5- 二甲基苯胺，所述2，5- 二甲基苯胺的終濃度為10 μ Μ。
8.—種漆酶，是發(fā)酵培養(yǎng)血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCCNa 2932 得到的。
9.權(quán)利要求1 所述血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus) MK2001 CGMCC Na 2932 在酚 類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物降解中的應(yīng)用，在造紙制漿生物漂白 和廢水處理中的應(yīng)用，在木材加工替代化學(xué)膠合劑中的應(yīng)用，在燃料降解中的應(yīng)用或在土 壤修復(fù)中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述漆酶在酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物降 解中的應(yīng)用，在造紙制漿生物漂白和廢水處理中的應(yīng)用，在木材加工替代化學(xué)膠合劑中的 應(yīng)用，在燃料降解中的應(yīng)用或在土壤修復(fù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種漆酶及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株，涉及微生物發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的菌株為血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC №2932。本發(fā)明所提供的漆酶，是發(fā)酵血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001CGMCC № 2932得到的。本發(fā)明所提供的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001CGMCC № 2932經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液漆酶酶活高達300U/ml，該漆酶可廣泛應(yīng)用于酚類、芳胺、芳香羧酸及其衍生物的生物降解，造紙制漿生物漂白、廢水處理和染料降解中，并且還可以在木材加工中替代化學(xué)膠合劑。
文檔編號B09C1/10GK101880632SQ20091008351
公開日2010年11月10日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者李偉, 郭林 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所