一種醋酸去氨加壓素的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及多肽合成中的純化方法領(lǐng)域，特別涉及一種醋酸去氨加壓素的純化方 法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 醋酸去氨加壓素（desmopressin，1-去氨基-8-D-精氨酸，DDAVP)是合成的天然精 氨酸加壓素的結(jié)構(gòu)類似物，通過對1位半胱氨酸Cys脫氨及8位采用D-Arg置換L-Arg后衍 生得到的。該藥在血液中穩(wěn)定性增加，半衰期延長，較血管加壓素和賴氨加壓素具有更強和 更持久的抗利尿活性，且加壓的副作用比精加壓素降低400-800倍，同樣也可激活血液因 子VID和纖溶酶原活性，該藥適用于中樞性尿崩癥、多尿、多飲、夜間遺尿癥、血友病A、馮?威 利布蘭德病以及控制出血和手術(shù)前預(yù)防出血等，其藥效更強，副作用小，是一種極具市場前 景的藥物，肽鏈結(jié)構(gòu)式如下：
醋酸去氨加壓素的合成方法主要有固相合成法和液相合成法，目前固相合成方法應(yīng)用 廣泛，具體方法為：氨基酸在固相載體上逐一偶聯(lián)獲得線性肽，然后通過用適當(dāng)?shù)难趸瘎┭?化獲得去氨加壓素粗肽，這種方法克服了液相合成方法耗時、操作繁雜、收率低、不易產(chǎn)業(yè) 化的缺點，但是在固相合成的方法中粗肽純化成為影響產(chǎn)品最終質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如何在 保證產(chǎn)品收率前提下，獲得優(yōu)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)級別的產(chǎn)品(所有雜質(zhì)含量均在0. 1%以下)用于藥物生 產(chǎn)，是每個藥物生產(chǎn)企業(yè)期待的目標(biāo)。
[0004] 目前關(guān)于醋酸去氨加壓素的文獻報道主要集中在其合成方法和制劑加工上，對于 純化的方法，目前的專利文獻有CN201310399955. 4 -種醋酸去氨加壓素的純化方法，該文 獻中公開了采用聚合物反相填料柱（Unips?10-100, 50mm*250mm)，以0. 3%的醋酸/水為A 相，乙腈為B相，按體積分數(shù)設(shè)置梯度，初始狀態(tài)流動相B為5%，保持2分鐘，然后在5分鐘 內(nèi)將B相比例增至25%，然后在30分鐘內(nèi)將B相比例增至40%，分部收集洗脫餾分，經(jīng)過干 燥獲得純品的方法，但其中只控制了雜質(zhì)des-Gln4-去氨加壓素含量達到0. 1%以下，在合 成過程中的其它雜質(zhì)未見報道。
[0005] CN101372504B-種純化去氨加壓素的方法公開了采用兩步純化和一步轉(zhuǎn)鹽三步 獲得醋酸去氨加壓素的方法。第一步純化采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以磷酸二 氫鉀和氫氧化鈉配成的緩沖液（pH=5. 0-7. 0)為A相，純乙腈為B相，梯度洗脫純化。第二 步純化以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，以0. 1-10%的冰醋酸水溶液為A相，純乙腈為B 相，梯度洗脫純化；轉(zhuǎn)鹽采用陰離子樹脂將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉(zhuǎn)化成醋酸鹽。該方法路線 長，而且離子樹脂會吸附大量產(chǎn)物，致使成品收率較低，該專利雖報道了成品的純度在99% 以上，但對具體的雜質(zhì)含量并未做出說明。
[0006] 專利CN201210551550. 3公開了為了獲得高純度醋酸去氨加壓素精肽，先對合成 過程中的中間體線性粗肽以0. 1%的TFA/水為A相，0. 05%~2% (V/V)TFA/乙腈為B相進 行初步純化后再進行氧化反應(yīng)獲得醋酸去氨加壓素粗品；后續(xù)又采用〇. 1~〇. 4% (V/V)磷 酸三乙胺水溶液為A相（PH=3. 0~6. 8)，乙腈為B相進行純化；并以0. 1%-0. 5% (V/V)的醋 酸銨水溶液為A1相（PH=5. 0~6. 5)，以0. 05~0. 2% (V/V)的醋酸/水為A2相，乙腈為B 相，對上述溶液進行轉(zhuǎn)鹽獲得醋酸去氨加壓素精肽。該方法為獲得高純度的精肽，從中間體 到產(chǎn)品共經(jīng)過3次純化和1次轉(zhuǎn)鹽，不僅增加了純化的成本，而且經(jīng)純化后線性肽溶液由于 體積變大，再進行氧化時導(dǎo)致獲得的產(chǎn)品濃度低；本專利實施例中公開了經(jīng)該方法獲得的 醋酸去氨加壓素精肽純度為99. 5~99. 85%，且其中仍含有含量大于0. 1%的雜質(zhì)。
[0007] 在現(xiàn)有醋酸去氨加壓素的合成過程中會產(chǎn)生脫酰胺、消旋、缺失肽等多種雜質(zhì)， 根據(jù)歐洲藥典EP7.0報道的已知雜質(zhì)中[5-Asp]-去氨加壓素、[4-Glu]-去氨加壓素、 [8-L-Arg]-去氨加壓素、[9-Gly]-去氨加壓素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與產(chǎn)品相近且不易純化，而目 前醋酸去氨加壓素純化方法研究中還無法達到精肽產(chǎn)品所含上述雜質(zhì)含量均小于〇. 1%的 目標(biāo)。為此，本發(fā)明主要研究了，如何在保證收率前提下，使精肽產(chǎn)品的純度大于99. 5%，并 使所含[5-Asp]-去氨加壓素、[4_Glu]_去氨加壓素、[8-L-Arg]-去氨加壓素、[9_Gly]_去 氨加壓素四種雜質(zhì)的含量均小于〇. 1%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種使用反相高效制備液相色譜純化醋酸去氨加壓素的 方法，該方法通過在硫酸銨/水溶液-乙腈和醋酸/水-乙腈兩種流動相體系中經(jīng)純化、 轉(zhuǎn)鹽獲得優(yōu)質(zhì)醋酸去氨加壓素。本發(fā)明具體要求為：提供一種醋酸去氨加壓素的純化方 法，在保證產(chǎn)品收率的前提下，使其純度大于99. 5%，并且使雜質(zhì)[5-Asp]-去氨加壓素、 [4-Glu]-去氨加壓素、[8-L-Arg]-去氨加壓素、[9-Gly]-去氨加壓素的含量均小于0. 1%。
[0009] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案： 一種醋酸去氨加壓素的純化方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟1 :將醋酸去氨加壓素粗品用乙腈/水溶液進行溶解，然后用〇. 45ym濾膜過濾獲 得粗品溶液。
[0010] 步驟2 :以50mmol/L的硫酸銨水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，在C18反相 填料柱上進行梯度洗脫。
[0011] 步驟3 :以醋酸的水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，在C18反相填料柱上進行梯 度洗脫。
[0012] 作為優(yōu)選，步驟1中醋酸去氨加壓素粗品溶于體積比濃度為3%~10%的乙腈水溶 液中。
[0013] 作為優(yōu)選，驟1中醋酸去氨加壓素粗品溶解后溶液的濃度為5~15mg/ml。
[0014] 作為優(yōu)選，步驟2中流動相A硫酸銨溶液用酸調(diào)節(jié)pH值為1. 8~2. 0。
[0015] 進一步優(yōu)選的，步驟2中流動相A硫酸銨水溶液調(diào)節(jié)pH值用酸為硫酸、醋酸、磷酸 一種或幾種。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟2中梯度洗脫過程為：將色譜柱先用5%的B相平衡后上樣，進樣后 先用15%B相等度洗脫，再用15%~18%B相梯度洗脫，分段收集目的峰。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟3中流動相A中醋酸的濃度為0.2%~0.5% (V/V)。
[0018] 進一步優(yōu)選的，步驟3中流動相A中醋酸的濃度為0.25%~0.4% (V/V)。
[0019] 作為優(yōu)選，步驟3中梯度洗脫過程為：將色譜柱用5%B相平衡后上樣，先用5%~ 18%B相梯度洗脫，再用18%~24%B梯度洗脫，分段收集目的峰。
[0020] 作為優(yōu)選，純化所用C18反相填料色譜柱規(guī)格(柱子直徑*長度）為5cm*25cm、 10cm*25cm或 15cm*25cm〇
[0021] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是： 1、 本發(fā)明提供的醋酸去氨加壓素純化方法，通過兩步使用反相高效制備液相色譜實現(xiàn) 了對醋酸去氨加壓素的純化與轉(zhuǎn)鹽，該方法操作簡單易行； 2、 獲得的醋酸去氨加壓素純度尚，廣品中雜質(zhì)[5_Asp]-去氨加壓素、[4_Glu]_去氨加 壓素、[8-L-Arg]-去氨加壓素、[9-Gly]-去氨加壓素的含量均降至0. 1%以下，產(chǎn)品可達到 優(yōu)質(zhì)藥用級別。
[0022] 3、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明工藝操作簡單，所用試劑、原料價格低廉易得，純化成 本低，產(chǎn)品純度高，利于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0023] 圖1示實施例1中醋酸去氨加壓素粗品經(jīng)乙腈水溶解后HPLC譜圖 圖2示實施例1中醋酸去氨加壓素粗品經(jīng)反相純化后HPLC譜圖 圖3示實施例1中醋酸去氨加壓素粗品經(jīng)反相轉(zhuǎn)鹽后HPLC譜圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面用具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施范圍內(nèi)；所有類似的替換和改動如改變?nèi)軇舛?、流動相比例及洗脫梯度等，均在本發(fā)明 的保護范圍內(nèi)。
[0025] 在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即可得到本發(fā)明各較 佳實例。
[0026] 實施例1: 樣品處理：將醋酸去氨加壓素的粗品固體碾碎，用5%的乙腈水溶液按照5mg/ml的濃度 溶解粗肽，溶解完全后用〇.45ym濾膜過濾，收集濾液備用。說明書附圖1為樣品溶于乙腈 的HPLC譜圖，此時樣品純度為87. 7075%，樣品中含有多種雜質(zhì)。
[0027] 純化條件：色譜條件：色譜柱：C18反相色譜柱；柱子直徑和長度為：5Cm*25cm;流 動相：A相為50mmol硫酸銨水溶液，硫酸調(diào)節(jié)pH值為1. 81 ;B相為乙腈，流速為50ml/min， 檢測波長為220nm。
[0028] 純化過程：將色譜柱用5%B平衡10分鐘后上樣，上樣量為300ml(1. 5g)。進樣后 先用15%B等度洗脫5分鐘后，再將B相濃度從15%逐漸提高到18%梯度洗脫40分鐘，分段 收集目的峰。將純度大于99%，所含雜質(zhì)小于0. 2%的餾分合并，在水溫30°C的條件下進行 減壓旋蒸濃縮，除去乙腈后備用。說明書附圖2為經(jīng)反相純化后HPLC譜圖，經(jīng)純化后的樣 品純度為99. 855%，且只含有兩種雜質(zhì)。 轉(zhuǎn)鹽條件：色譜條件：色譜柱：C18反相色譜柱，柱子直徑和長度為：5cm*25cm。流動相A為0. 25%醋酸水溶液，流動相B為乙腈，流速為50ml/min，檢測波長220nm。
[0029] 轉(zhuǎn)鹽過程：將色譜柱用5%B平衡后將上述濃縮液壓入制備柱中，上樣后將B相濃度 從5%提高到18%梯度洗脫5分鐘，然后將B相濃度從18%提高到24%B梯度洗脫30分鐘， 分段收集目的峰。
[0030] 將純度大于99. 5%，雜質(zhì)小于0. 1%的餾分合并后，在30°C的水溫條件下進行旋蒸 濃縮至約50mg/ml后轉(zhuǎn)移入西林瓶中，冷凍干燥后即可得到說明書附圖3中純度99. 9749% 的醋酸去氨加壓素1. 22g，所含雜質(zhì)[9-Gly]-0H含量0. 0251%，純化收率81. 3%。
[0031] 實施例2: 樣品處理：將醋酸去氨加壓素的粗品固體碾碎，用3%的乙腈水溶液按照10mg/ml的濃 度溶解粗肽，溶解完全后用〇. 45ym濾膜過濾，收集濾液備用。
[0032] 純化條件：色譜條件：色譜柱：C18反相色譜柱；柱子直徑和長度為：l〇Cm*25cm。 流動相：A相為50mmol硫酸銨水溶液，硫酸調(diào)節(jié)pH值為1. 88 ;流動相B為乙腈。流速為 300ml/min，檢測波長為 220nm。
[0033] 純化過程：將色譜柱用5%B平衡15分鐘后上樣，上樣量為600ml(6g)。進樣后先 用15%B等度洗脫7分鐘后，再將B相濃度從15%逐漸提高到18%梯度洗脫50分鐘，分段收 集目的峰。將純度大于99%，所含雜質(zhì)小于0. 2%的餾分合并，在水溫30°C的條件下進行減 壓旋蒸濃縮，除去乙腈后備用。
[0034] 轉(zhuǎn)鹽條件：色譜