去氨加壓素的合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種去氨加壓素的合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 去氨加壓素是天然精氨加壓素的結(jié)構(gòu)類似物，系對天然激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行兩處 改動而得，即1-半胱氨酸脫去氨基和以8-D-精氨酸取代8-L-精氨酸。去氨加壓素的肽 序結(jié)構(gòu)為：Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pr〇-D_Arg-Gly-NH2 (其中 Mpa 與 Cys 通過二硫鍵成 環(huán))。
[0003] 去氨加壓素主要用于治療中樞性尿崩癥、夜間遺尿及血友病等，也用于腎尿液濃 縮功能的測試，還可用作術(shù)后止血。
[0004] 隨著Fmoc固相肽合成方法的日益發(fā)展和制備工藝的日漸成熟，目前，多肽合成 中，固相合成逐漸取代液相合成。對于去氨加壓素的合成，主要采用的合成方法是Fmoc 固相多肽合成策略，氨基酸單體偶聯(lián)的相應(yīng)固相合成在有機溶劑中進行。例如申請?zhí)枮?201210336044. 2的中國專利申請和中國專利CN101372505中記載的方法。
[0005] 在現(xiàn)有技術(shù)的固相合成方法中，每一個氨基酸單體的偶聯(lián)均需在有機溶劑（DMF) 中進行，而且，合成過程中還需用有機溶劑多次洗滌產(chǎn)物，也要消耗大量有機溶劑（DMF等)。 這不僅生產(chǎn)成本高，還嚴重污染環(huán)境，不利于產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。
[0006] 此外，現(xiàn)有技術(shù)的Fmoc固相肽合成策略，需要用哌啶(六氫吡啶）的DMF溶液脫除 臨時保護基團Fmoc，脫除過程中容易產(chǎn)生一些殘基，從而導(dǎo)致許多副反應(yīng)的發(fā)生，這就需要 在氨基酸單體偶聯(lián)成肽鏈時對肽序中的側(cè)鏈官能團進行保護以避免發(fā)生副反應(yīng)，這也會增 加成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種去氨加壓素的合成方法，所述合成方法包括：
[0008] 1)制備去氨加壓素線性肽肽樹脂：首先將氨基酸單體PG-Gly-OH和偶聯(lián)劑與 水混合均勻，靜置，所得混合物隨后在脫除保護基的固相載體上反應(yīng)，得到PG-Gly-固相 載體，然后脫除PG，得到H-Gly-固相載體；重復(fù)上述步驟，氨基酸單體和Mpa依次偶聯(lián) 在H-Gly-固相載體上，偶聯(lián)順序為依次偶聯(lián)PG-D-Arg-〇H、PG-Pro-OH、PG-Cys (Trt)-OH、 PG-Asn-〇H、PG-Gln-〇H、PG-Phe-〇H、PG-Tyr-〇H、Mpa，所述 PG 為水溶性氨基保護基；由此得 到式（I)的去氨加壓素線性肽肽樹脂Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-固相載 體⑴；
[0009] 2)制備去氨加壓素環(huán)肽肽樹脂：氧化得自步驟1)的去氨加壓素線性肽肽樹脂，得 到式（II)的去氨加壓素環(huán)肽肽樹脂
[0010]
[0011] 3)制備去氨加壓素：裂解得自步驟2)的去氨加壓素環(huán)肽肽樹脂，得到式（III)的 去氨加壓素
[0012]
[0013] 在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述PG為水溶性氨基保護基，其包括 Pms、Esc、Sps。在本發(fā)明合成方法的一個更優(yōu)選實施方案中，所述PG為Esc。
[0014] 在本發(fā)明合成方法的一個實施方案中，氨基酸與固相載體的摩爾比為1:1-20:1。
[0015] 在本發(fā)明合成方法的一個實施方案中，偶聯(lián)劑選自EDC · HC1、HONB、DIPEA、TBTU 或其混合物。在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述偶聯(lián)劑為EDC · HC1、HONB和 DIPEA的混合物，其與固相載體的摩爾比各自獨立地均為1. 5:1-8:1。
[0016] 在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，水中含有表面活性劑，其選自陰離子 表面活性劑、陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑。在本發(fā)明合成方法的一個更優(yōu)選實施 方案中，使用非離子表面活性劑，在本發(fā)明合成方法的一個最優(yōu)選實施方案中，使用聚氧乙 烯醚類非離子表面活性劑，其與水的摩爾比為3:2000-30:2000。
[0017] 在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，水中除含有表面活性劑外，還含有助 溶劑。所述助溶劑優(yōu)選為DMS0,其與水的摩爾比為25:2000-350:2000。
[0018] 在本發(fā)明合成方法的一個更優(yōu)選實施方案中，僅在偶聯(lián)Esc-Cys(Trt)-OH和 Mpa (Trt)-OH時，在水中加入助溶劑DMSO。
[0019] 在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，固相載體選自Fmoc-Rink-PEG Amide 樹脂(例如購自天津南開和成科技有限公)、Fmoc-Rink - PEG-Amide AM樹脂(例如購自美國 SIGMA)、Fmoc-RinkAmide-PEGA樹脂(例如購自德國Merck)。在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選 實施方案中，使用Fmoc-Rink-PEG Amide樹脂，固相載體的替代度為0. 2~I. 2mmol/g。
[0020] 在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，步驟1)的靜置時間為2-10分鐘。
[0021] 在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，步驟1)的偶聯(lián)反應(yīng)時間為1-8小時。
[0022] 在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，步驟1)的脫除保護基Esc的步驟進行 1-6次，每次反應(yīng)1-6分鐘。
[0023] 在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，步驟2)的氧化使用選自如下的氧化 劑進行：碘、雙氧水。在本發(fā)明合成方法的一個更優(yōu)選實施方案中，步驟2)的氧化使用碘進 行，碘與固相載體的摩爾比為1:1-20:1。在本發(fā)明合成方法的一個最優(yōu)選實施方案中，碘以 與選自如下溶劑的混合物的形式提供：DMF、甲醇、二氯甲烷混合物，所述溶劑與固相載體的 摩爾比為60:1-800:1。
[0024] 在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，步驟3)的裂解使用選自如下的裂解 液進行：TFA、苯甲硫醚、TIS或其兩種或多種的混合物；或者TFA、苯甲硫醚、TIS或其兩種或 多種與水的混合物。在本發(fā)明合成方法的一個更優(yōu)選實施方案中，裂解液使用TFA和/或 TIS與水的混合物，其中TFA、TIS、水的體積比為TFA:TIS:水=90-95:0-5:0-5。應(yīng)理解，所 述體積比為試劑的純度在95%-100%之間時的體積比，如試劑純度不在所述純度范圍內(nèi)，則 可根據(jù)相應(yīng)試劑的純度變化其用量。
[0025] 在本發(fā)明合成方法的一個優(yōu)選實施方案中，還包括：
[0026] 4)純化：對得自步驟3)的去氨加壓素進行純化。
[0027] 本發(fā)明的去氨加壓素合成方法采用水中固相合成的方法且使用水溶性氨基保護 基保護氨基酸的氨基，無需使用有機溶劑，不僅節(jié)約成本，而且對環(huán)境無害。
[0028] 本發(fā)明的去氨加壓素合成方法無需對肽序中的部分側(cè)鏈官能團(如Arg、Asn、Gln、 Tyr的側(cè)鏈）進行保護，操作簡單、后處理容易、成本低、環(huán)保、收率高，具有可觀的經(jīng)濟實用 價值，同時在多肽藥物設(shè)計合成領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0029] 本文使用如下縮略語：
[0030]
[0031]
[0032] 除另有說明外，本發(fā)明的方法步驟在常溫常壓下進行。
[0033] 除另有說明外，本發(fā)明提及的原料為本領(lǐng)域已知的常規(guī)試劑，均為市售可得的。
[0034] 本發(fā)明提供一種去氨加壓素的合成方法，所述合成方法包括：
[0035] 1)制備去氨加壓素線性肽肽樹脂：首先將氨基酸單體PG-Gly-OH和偶聯(lián)劑與 水混合均勻，靜置，所得混合物隨后在脫除保護基的固相載體上反應(yīng)，得到PG-Gly-固相 載體，然后脫除PG，得到H-Gly-固相載體；重復(fù)上述步驟，氨基酸單體和Mpa依次偶聯(lián) 在H-Gly-固相載體上，偶聯(lián)順序為依次偶聯(lián)PG-D-Arg-〇H、PG-Pro-OH、PG-Cys (Trt)-OH、 PG-Asn-〇H、PG-Gln-〇H、PG-Phe-〇H、PG-Tyr-〇H、Mpa，所述 PG 為水溶性氨基保護基；由此得 到式（I)的去氨加壓素線性肽肽樹脂Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-固相載 體⑴；
[0036] 2)制備去氨加壓素環(huán)肽肽樹脂：氧化得自步驟1)的去氨加壓素線性肽肽樹脂，得 到式（II)的去氨加壓素環(huán)肽肽樹脂
[0037]
[0038] 3)制備去氨加壓素：裂解自步驟2)的去氨加壓素環(huán)肽肽樹脂，得到式（III)的去 氨加壓素
[0039]
[0040] 應(yīng)理解，式（II)和式（III)的結(jié)構(gòu)為示意性的，意指在氧化過程中Mpa與Cys成 環(huán)。
[0041] 步驟 1)
[0042] 氨基酸單體為本領(lǐng)域已知的氨基酸單體，可由市場上購得，例如購自北京慧搏安 康科技發(fā)展有限公司，也可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的方法制得。具體而言，本發(fā)明的氨基酸單體 意指構(gòu)成本發(fā)明的去氨加壓素的氨基酸單體，具體為甘氨酸（GLy)、精氨酸(Arg)、脯氨酸 (Pro)、半胱氨酸（Cys)、天冬酰胺（Asn)、谷氨酰胺（Gin)、苯丙氨酸（Phe)、酪氨酸（Tyr)。優(yōu) 選地，所述PG為水溶性氨基保護基，其包括例如Pms、Sps、Esc，優(yōu)選例如Esc。氨基由水溶 性氨基保護基保護的氨基酸為市售可得的，或可由本領(lǐng)域已知的方法制備。在本發(fā)明合成 方法的一個實施方案中，使用Esc保護氨基酸單體的氨基，保護方法為：Esc-〇su與氨基裸 露的氨基酸單體在有機溶液例如DMF中反應(yīng)，從而分別得到純度> 95%的氨基由Esc保護 的氨基酸單體：Esc_Gly-〇H、Esc-D-Arg-〇H、Esc_Pr〇-〇H、Esc-Cys (Trt)-OH、Esc-Asn-OH、 Esc_Gln-〇H、Esc-Phe-〇H、Esc-Tyr-OH0
[0043] 氨基酸與固相載體的摩爾比為1:1-20:1，優(yōu)選1:1-15:1，更優(yōu)選1:1-10:1。
[0044] 偶聯(lián)劑可為本領(lǐng)域已知的偶聯(lián)劑，例如可為EDC · HC1、HONB、DIPEA、TBTU或其混 合物，其用量可根據(jù)本領(lǐng)域的常用量確定。優(yōu)選使用多種偶聯(lián)劑，例如使用EDC · HC1、H0NB 和DIPEA，此情況下，EDC · HCl、HONB和DIPEA可同時加入或不同時加入，優(yōu)選不同時加入， 例如先加入EDC · HC1、Η0ΝΒ，再加入DIPEA。在使用EDC · HC1、HONB和DIPEA的情況下，其 與固相載體的摩爾比各自獨立地均為1. 5:1-8:1，優(yōu)選2:1-7:1，更優(yōu)選2. 2:1-6. 4:1。
[0045] 水的用量不作特別地限定，只要能夠使加入其中的物質(zhì)完全溶解即可。例如，水與 固相載體的摩爾比可為10:1，優(yōu)選8:1。
[0046] 優(yōu)選地,水中可含有表面活性劑,所述表面活性劑可為本領(lǐng)域已知的任何水溶性 表面活性劑，例如陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑，優(yōu)選非離子 表面活性劑，更優(yōu)選聚