衍生自b型肝炎病毒核蛋白精氨酸密集區(qū)的抗菌勝肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于抗菌勝肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 因廣泛使用傳統(tǒng)抗生素而造成病原體抗藥性提升，是全球所重視的問(wèn)題，因此迫 切需要研發(fā)更多有效的治療并克服抗藥性問(wèn)題?？咕鷦匐模ˋntimicrobial peptides，AMP) 是一種新的抗生素種類(lèi)，具有新穎作用模式及卓越的治療效果。一般來(lái)說(shuō)，抗菌勝肽含有 10~50個(gè)氨基酸，整體帶有正電并具有雙極性結(jié)構(gòu)（amphipathic structure)。大部份的 抗菌勝肽可直接與細(xì)菌膜鍵結(jié)，并藉由使細(xì)胞膜瓦解或是攻擊細(xì)胞內(nèi)的成分而致死。最重 要的是，抗菌勝肽對(duì)抗藥性病原體是有效的，此種性質(zhì)使得近幾十年作為新型抗生素的抗 菌勝肽被大量研究。
[0003] 先前未有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)衍生自B型肝炎病毒核蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc)的勝肽擁有抗菌活性。B型肝炎病毒核蛋白（21KDa)為病毒復(fù)制所必需，其 在N端（第1至149個(gè)氨基酸殘基）包含一蛋白殼（capsid)組裝區(qū)域，且在C端（第150 至183個(gè)氨基酸殘基）有一個(gè)精氨酸密集區(qū)（arginine-rich domain，ARD) (Birnbaum et al. (1990) J Virol 64:3319-3330 ;Nassal M(1992) J Virol 66:4107-4116)。ARD 含有 16 個(gè)精氨酸，分成4個(gè)精氨酸密集群（ARD I、II、III、IV)，并具有鍵結(jié)至核苷酸的功能。當(dāng)其 鍵結(jié)至HBV前基因體RNA或是聚陰離子時(shí)，HBc可組裝為一穩(wěn)定的蛋白殼。此外，ARD包含 HBc核蛋白與粒子的核輸出與輸入的重要訊號(hào)。我們意外地發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)HBcl~183的大腸 桿菌比表現(xiàn)HBcl~149的大腸桿菌其生長(zhǎng)慢得多（此結(jié)果尚未發(fā)表），而這現(xiàn)象的原因文 獻(xiàn)上并沒(méi)有任何報(bào)告提出一個(gè)合理的解釋。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一目的是關(guān)于一醫(yī)藥組成物，包含：
[0005] (a) -有效量的一單離勝肽，其中該單離勝肽包含B型肝炎病毒核蛋白 (hepatitis B virus core protein，HBc)的精氨酸密集駿基端區(qū)域（arginine-rich carboxy-terminal region)，并表現(xiàn)一抗菌活性；以及
[0006] (b) -藥學(xué)上可接受的載體。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是關(guān)于一醫(yī)藥組成物，包含：
[0008] (a) -有效量的一單離勝肽，該單離勝肽包含B型肝炎病毒核蛋白的一片段，該片 段包含一個(gè)以上的精氨酸密集區(qū)（ARD)，是選自由下列（i)、（ii)及（iii)所組成的群組：
[0009] (i) HBc ARD I ~IV ;
[0010] (ii)HBc ARD I ~III ;
[0011] (iii)HBc ARD II ~IV ;
[0012] 其中該單離勝肽具有一抗菌活性；以及
[0013] (b) -藥學(xué)上可接受的載體。
[0014] 本發(fā)明另一目的是關(guān)于一種醫(yī)藥組成物包含一有效量的一單離勝肽，該單離勝肽 包含一衍生自B型肝炎病毒核蛋白的C端區(qū)域的精氨酸密集序列，其中該單離勝肽的特征 在于具有一抗菌活性。
[0015] 本發(fā)明又一目的是關(guān)于一種如前所述的醫(yī)藥組成物用于殺死及/或抑制一微生 物的生長(zhǎng)及/或增殖的用途，是經(jīng)由前述醫(yī)藥組成物與該微生物接觸。
[0016] 本發(fā)明又一目的是關(guān)于一種如前所述的醫(yī)藥組成物用于殺死及/或抑制一 需要的個(gè)體內(nèi)一微生物的生長(zhǎng)及/或增殖的用途，或用于治療受一微生物感染的一個(gè) 體。該個(gè)體可為感染金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)或克雷伯氏肺炎桿菌 (K. pneumonia)〇
[0017] 后述較佳實(shí)施方式的說(shuō)明與后附的圖式使得本案的目的變得顯而易見(jiàn)，本發(fā)明的 變體與修飾可能有些許不同，但不脫離本發(fā)明所揭露新穎概念的精神與范疇。
[0018] 后附圖式說(shuō)明本發(fā)明一或多個(gè)實(shí)施方式，并且與說(shuō)明書(shū)的說(shuō)明一同用于解釋本發(fā) 明原理。只要有可能，于所有圖中同樣的標(biāo)號(hào)是關(guān)于一實(shí)施方式的相同或類(lèi)似元件。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1顯示為測(cè)試抗菌能力的不同HBc ARD的氨基酸序列。下方呈現(xiàn)不同的磷酸化 勝肽與R替代成A的變異勝肽，是在HBcl47~183的ARD-III與ARD-IV有總共4個(gè)Arg 替代成Ala。
[0020] 圖2顯示HBcl47~183抗綠膿桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、大腸桿菌以及金黃色葡 萄球菌的殺傷動(dòng)力學(xué)。細(xì)菌以HBcl47~183 (lx MBC)處理。于指定的時(shí)間點(diǎn)（每隔20分 鐘）量測(cè)細(xì)菌的存活率。樣本以三重復(fù)方式量測(cè)。
[0021] 圖3顯示FITC-HBcl47~183勝肽于細(xì)菌上的位置。將近IO7CFU的綠膿桿菌 TCC9027、ATCC27853 (A 及 B)、克雷伯氏肺炎桿菌 ATCC13884 (C)、大腸桿菌 ATCC25922 (D)、 以及金黃色葡萄球菌 ATCC19636、ATCC25923 與 ATCC 29213 (E、F 與 G)與 HBcl47-183 (0? 5x MBC) -起培養(yǎng)1小時(shí)。細(xì)菌經(jīng)清洗、固定并以DAPI染色（藍(lán)色）。影像以共焦顯微鏡拍攝。
[0022] 圖4顯示HBc 147~183可能的殺菌機(jī)制。㈧綠膿桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、大腸 桿菌以及金黃色葡萄球菌經(jīng)由HBcl47~183的SYTOX Green染劑攝入。每分鐘記錄以熒 光測(cè)量的數(shù)據(jù)。（B)綠膿桿菌經(jīng)由0. 5、1與2 y M的HBcl47~183與HBcl53~176的細(xì)胞 膜穿透化劑量依賴(lài)曲線。2iiM的蜜蜂毒素迷力挺（melittin)作為正控制組。樣本以三重 復(fù)方式測(cè)量。（C)HBcl47~183的DNA鍵結(jié)活性。HBcl47~183與pSUPER質(zhì)體DNA以指 定的N/P比（0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1、2及3)混合30分鐘。DNA的流動(dòng)性以凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)評(píng) 估。
[0023] 圖5顯示LPS與LPS抗體于HBcl47~183的殺菌活性的劑量反應(yīng)作用。綠膿桿菌 及大腸桿菌來(lái)源的LPS及LPS抗體與綠膿桿菌及HBcl47~183 (lx MBC)混合3小時(shí)。細(xì) 菌置于MH瓊脂上以測(cè)量存活率。樣本以三重復(fù)方式測(cè)量。
[0024] 圖6顯示ARD勝肽HBc 147~183在數(shù)個(gè)不同的體外鍵結(jié)分析中，可鍵結(jié)至LPS與A 月旨。每個(gè)分析中，樣本以三重復(fù)方式量測(cè)。（A)草圖顯示勝肽LPS與勝肽A脂鍵結(jié)的體外分 析，以及LPS/A脂的競(jìng)爭(zhēng)分析。（B)恒定量的LPS與卵白素偶聯(lián)微球上漸增濃度的生物素化 ARD HBc 147 ~183 勝肽（0、0.004、0.02、0. 1、0.5 與 2.5yM) -起培養(yǎng)。以 LAL ELISA 分析 量測(cè)懸浮液中未鍵結(jié)的LPS。將EU值以一不含勝肽的控制組標(biāo)準(zhǔn)化。HBcl47~1838p (含 有8個(gè)磷酸化的氨基酸）亦作為一控制組勝肽，因其與LPS的鍵結(jié)微弱。（C)微珠鍵結(jié)的 LPS經(jīng)由胰蛋白酶瓊脂糖消化隔夜而釋放至懸浮液中。以LAL ELISA分析懸浮液中自由的 LPS。懸浮液中被釋放的LPS的量是與微珠上ARD勝肽HBcl47~183的量成比例。（D)恒 定量的A脂分別與增加濃度的HBcl47~183以及HBcl47~1838P培養(yǎng)。以LAL ELISA試 劑檢測(cè)懸浮液。這里的結(jié)果與先前發(fā)現(xiàn)一致，是A脂可直接鍵結(jié)至HBcl47~183。（E)LPS/ A脂競(jìng)爭(zhēng)分析。恒定量的LPS (I y g)涂布于ELISA盤(pán)上的每一孔，然后與一含有IOnM恒定 量的HBcl47-183與增加濃度的A脂的反應(yīng)混合物培養(yǎng)。A脂的增加以劑量依賴(lài)的方式降低 盤(pán)上鍵結(jié)ARD勝肽HBc 147~183的量。
[0025] 圖7顯示ARD勝肽HBcl47~183的細(xì)胞毒性分析。（A)以10 %人類(lèi)紅血球細(xì)胞 (RBC)測(cè)量HBcl47~183與迷力挺的溶血活性。與迷力挺相較，未顯示HBcl47~183具有 溶血活性。（B)Huh7、IfepG2、Vero以及HEK293細(xì)胞與不同濃度（0至100 y M)的HBcl47~ 183與迷力挺于37°C培養(yǎng)1小時(shí)。對(duì)細(xì)胞存活率的影響以MTT分析測(cè)定。迷力挺用于作為 一正控制組。未檢測(cè)到HBcl47~183對(duì)于細(xì)胞存活率的影響，而迷力挺則顯示強(qiáng)烈的細(xì)胞 毒性。（C)腎臟細(xì)胞Vero與HEK293以CFSE染色并于第0天植入。第1天時(shí)細(xì)胞以不同濃 度（0至100 yM)的HBcl47~183培養(yǎng)1小時(shí)。以流式細(xì)胞儀評(píng)估第1天及第3天的細(xì)胞 增殖。與空的控制組（mock control)實(shí)驗(yàn)相似，在Vero與HEK293細(xì)胞上未有顯著作用。 于第7A~C圖的樣本是以三重復(fù)的方式分析。（D)利用3周大ICR公小鼠評(píng)估ARD勝肽 HBcl47~183的體內(nèi)細(xì)胞毒性。小鼠腹膜內(nèi)注射勝肽（10與20mg/體重kg)。所有的小鼠 于7天后仍存活。
[0026] 圖8顯示體內(nèi)ARD勝肽HBcl47~183抗金黃色葡萄球菌的保護(hù)活性試驗(yàn)。（A) 3 周大ICR公小鼠接受致命濃度的金黃色葡萄球菌ATCC 19636，然后分為5組不同的時(shí)間點(diǎn)。 于每一時(shí)間點(diǎn)（n = 5)收集、稀釋血液樣本，并將其覆于BHI瓊脂上。第二天計(jì)算細(xì)菌的 數(shù)目。觀察到接種后2小時(shí)血液中有最大細(xì)菌量。數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)表示。 (B)如前所述以致命濃度的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)的ICR小鼠，分別在接種后1、1. 5或2小 時(shí)以腹膜內(nèi)注射ARD勝肽（10mg/kg)治療。每組包含10只小鼠。以PBS治療的控制組小 鼠全數(shù)（100% )于第一天死亡，而以ARD勝肽于接種后1、1. 5或2小時(shí)治療的小鼠，7天后 存活率分別為100%、70%與40%。（C)如前所述，ICR小鼠腹膜內(nèi)接種金黃色葡萄球菌，隨 即腹膜內(nèi)注射PBS(n = 5)或于接種后1小時(shí)腹膜內(nèi)注射10mg/kg ARD勝肽（n = 5)。接 種后4小時(shí)，收集血液、肝臟及脾臟。肝臟及脾臟樣本經(jīng)均質(zhì)化、稀釋?zhuān)⑴c血液樣本一同覆 于BHI瓊脂上。于隔日計(jì)算細(xì)菌量。與用PBS治療的小鼠相較，ARD勝肽的治療能有效降 低血液、肝臟及脾臟中的細(xì)菌量。（D)以PBS治療（空心的圓形、菱形與正方形）與ARD勝 肽HBcl47~183治療（實(shí)心的圓形、菱形與正方形）的小鼠血液、肝臟及胰臟樣本細(xì)菌量 的量化比較。圖中的線表示細(xì)菌量的平均值。**表示于PBS與ARD勝肽HBcl47~183治 療結(jié)果的間的 P〈0. 01 (Mann-Whitney U test) 〇
[0027] 圖9顯示ARD勝肽抗克雷伯氏肺炎桿菌的體內(nèi)抗菌活性的IVIS分析。（A)感染 克雷伯氏肺炎桿菌的小鼠，在接種后1小時(shí)以PBS(n = 5)或10mg/kg ARD勝肽（n = 5)治 療。接種后4小時(shí)，麻醉小鼠并攝影。細(xì)菌量顯示于生物冷光迭加的攝影影像中。假色影 像（False color imaging)將強(qiáng)冷光處以紅色表示，中度冷光處以綠色表示，低冷光處以藍(lán) 色與紫色表示。（B)總光通量以IVIS影像軟件量化。**表示于PBS與ARD勝肽HBcl47~ 183 治療結(jié)果的間的 P〈0.0 l (Mann-Whitney U test) 〇
[0028] 圖10為一顯示HBCARD勝肽的抗菌活性表。
[0029] 圖11為一顯示ARD勝肽HBcl47~183對(duì)于對(duì)黏菌素具有抗藥性與敏感性的綠膿 桿菌與鮑氏不動(dòng)桿菌的抗菌活性的表。
[0030] 圖12顯示人類(lèi)B型肝炎病毒（HBV)核蛋白（HBc)的精氨酸密集區(qū)（ARD)的序列 組合。HBcARD區(qū)域從目前不同地域的病患中分離出來(lái)的不同血清型中，是為高度保守。
[0031] 圖13A~B顯示從靈長(zhǎng)類(lèi)、嚙齒動(dòng)物及禽類(lèi)來(lái)源嗜肝病毒的HBc ARD區(qū)域的序列 組合。HBc ARD序列在人類(lèi)、絨毛猴（wooly monkey)、地松鼠、土撥鼠以及蝙蝠的間是高度 保守的。在HBc ARD的精氨酸（正電荷）群集的次區(qū)域?yàn)锳RD-I、ARD-II、ARD-III、以及 ARD-IV。第13B圖進(jìn)一步顯示在鴨、蒼鷺、鸚鵡、羅斯雁及雪雁的核蛋白C端也有4個(gè)群集 正電荷氨基酸。不論靈長(zhǎng)類(lèi)、嚙齒動(dòng)物及禽類(lèi)嗜肝病毒的間的序列歧異度與演化