用XbaI 和SmaI限制性內(nèi)切酶對(duì)植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PBI121-CabuAP3進(jìn)行雙酶切后，用1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測(cè)，證明CabuAP3基因已經(jīng)與PBI121載體連接在一起。
[0047] 實(shí)施例5將植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PBI121_CabuAP3轉(zhuǎn)入野生型擬南芥和擬南芥 ap3_3突變體中
[0048] 取2yg純化后的PBI121-CabuAP3質(zhì)粒DNA，快速加入至200yL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì) 胞中，吸打混合均勻；冰浴5min，轉(zhuǎn)入液氮，迅速冷凍lmin，快速置于37°C，水浴4min;加 入800yL的LB液體培養(yǎng)基，28°C、250rpm振蕩5h;將菌液轉(zhuǎn)移至LB(50mLLB+50yg/mL Kan+50yg/mLRif)固體選擇培養(yǎng)基中，均勻涂布，在28°C培養(yǎng)l-2d。
[0049] 在長(zhǎng)有單克隆菌落的平板上，挑取有抗性的單克隆菌落。接種到10mL的液體LB 培養(yǎng)基（含有l(wèi)〇yg/mLKan+10yg/mLRif)中，在28°C、200rpm條件下，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜 后，進(jìn)行PCR鑒定，將篩選出來(lái)的PBI121-CabuAP3陽(yáng)性克隆農(nóng)桿菌保存（300yL無(wú)菌甘油 +700yL農(nóng)桿菌菌液）。
[0050] 將含有PBI121-CabuAP3陽(yáng)性克隆農(nóng)桿菌在25mL固體平板培養(yǎng)基（含有25yg/ mLKan+25yg/mLRif)上劃線，倒置培養(yǎng)48h;選取單克隆，接種到10mL的液體LB培養(yǎng)基 (含有l(wèi)〇yg/mLKan+10yg/mLRif)中；在28°C、200rpm條件下，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至0D= 0. 7-0. 8。取lmL的培養(yǎng)菌液均勻涂布在25mL固體平板培養(yǎng)基（含有25yg/mLKan+25yg/ mLRif)上，28°C，倒置培養(yǎng)48h;使用無(wú)菌的玻璃三角棒將固體培養(yǎng)基上的農(nóng)桿菌刮下來(lái)， 將菌塊重懸于含有5%蔗糖和3%511?的1-77的1/21^液體培養(yǎng)基中，使其00 = 0.2，用 于轉(zhuǎn)基因。
[0051] 將成熟的擬南芥種子放在濕潤(rùn)的濾紙上，并置于4°C條件下，浸泡48h，然后播種 到營(yíng)養(yǎng)土（營(yíng)養(yǎng)土：蛭石：珍珠巖=5:4:1)中，在適宜的條件下（溫度22°C，濕度75%，14h 黑暗/l〇h光照循環(huán)）培養(yǎng)；將鑒定的擬南芥ap3-3突變體的純合體拔除，留下野生型擬南 芥和擬南芥ap3-3雜合體；在轉(zhuǎn)基因的前一天，將擬南芥植株澆透水；在浸染前，將待用的 擬南芥植株上的角果剪掉，將花序浸入PBI121-CabuAP3農(nóng)桿菌浸染液中60s左右，用作浸 染轉(zhuǎn)化；罩上黑色封口膜，并保持膜內(nèi)的高溫、高濕環(huán)境，暗培養(yǎng)l-2d后，揭開薄膜；上述方 法侵染3-4次，間隔時(shí)間為7d。
[0052] 實(shí)施例6楸樹CabuAP3基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選和鑒定
[0053] 收獲的CabuAP3轉(zhuǎn)基因擬南芥成熟種子，在種子篩中，將種子處理干凈。置于4°C 冰箱中2周時(shí)間，進(jìn)行春化處理；將種子放入收集管中，向種子中加入900yL無(wú)水乙醇，搖 動(dòng)5min;離心4000rpm，2min;倒掉收集管中的酒精，向收集管中加入900yL70%乙醇，搖 晃5min;離心4000rpm，2min;瞭干種子；均勾鋪在1/2MS培養(yǎng)基（PH= 5. 8,含50yg/mL的 Kan，3%蔗糖和0. 8%瓊脂）平板上。將接種后的平板放入到4°C冰箱，進(jìn)行再春化處理2d; 將春化后的平板置于人工氣候箱中，正常培養(yǎng)。待其長(zhǎng)出4片真葉后，將其移至營(yíng)養(yǎng)土中， 經(jīng)過(guò)煉苗、壯苗后，按照常規(guī)的水肥管理，直至開花。
[0054] 提取CabuAP3轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA，取1小片擬南芥的葉片置于1. 5mL的印pendorf 管中，放入液氮速凍，研磨；加入600yL提取緩沖液，渦旋震蕩后，置于冰上；待所有樣品處 理完后，置于65°C水浴中，溫水浴25min;將樣品從水浴中取出，放置到室溫，待冷卻至室溫 后，加入340yL乙酸鉀溶液，渦旋震蕩，冰浴20min;12000rpm，高速離心lOmin，將上清液 轉(zhuǎn)移至新的eppendorf管中；加等量體積的異丙醇，4°C，12000rpm，高速離心20min，棄上清 液，并立即用冰無(wú)水乙醇（提前l(fā)h將無(wú)水乙醇放入_20°C冰箱）漂洗；沉淀依次用70%、 100%乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50yL無(wú)菌水中。
[0055] 以野生型擬南芥DNA作為對(duì)照，使用載體構(gòu)建的引物CabuAP3_F和CabuAP3_R，對(duì) 轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽(yáng)性植株DNA進(jìn)行PCR篩選。PCR擴(kuò)增程序：94°C4min;94°C45s，57°C45s， 72°C45s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°ClOmin。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10yL，進(jìn)行1 %瓊脂糖凝 膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)。
[0056] 對(duì)轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥ap3_3純合體進(jìn)行表型分析，并在Leica 體式顯微鏡下觀察，對(duì)擬南芥的開花表型進(jìn)行拍照。轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥開花時(shí)，額外長(zhǎng)出 來(lái)了 1個(gè)花瓣，結(jié)果說(shuō)明在轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥中，CabuAP3基因具有調(diào)控?cái)M南芥花瓣數(shù)量 增加的新功能；轉(zhuǎn)基因擬南芥ap3_3突變體在花器官第3輪，長(zhǎng)出了花絲狀結(jié)構(gòu)（圖6)。結(jié) 果說(shuō)明在轉(zhuǎn)基因ap3-3突變體擬南芥中，CabuAP3基因有部分替代AP3基因的功能。該楸 樹CabuAP3基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥材料可用于植物觀賞和育種。
[0057] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種楸樹CabuAP3蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。2. 權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所 不。3. 含有權(quán)利要求2所述編碼基因序列的載體。4. 權(quán)利要求3所述載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟： 將兩端包含酶切位點(diǎn)的楸樹CabuAP3蛋白編碼基因序列構(gòu)建到pmdl8-T載體上， 轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到pmdl8-CabuAP3重組質(zhì)粒，雙酶切pmdl8-CabuAP3重組 質(zhì)粒和PBI121質(zhì)粒，連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后，獲得表達(dá)載體 PBI121-CabuAP3〇5. 含有權(quán)利要求3所述載體的工程菌。6. 用于克隆權(quán)利要求2所述編碼基因序列的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)包括： CabuAP3-F:5' -CTCAAATCTAGAAAATCAATGGCTC-3'; CabuAP3-R:5< -GCGCCCGGGTTCATTTTATTCAAGC-3'。7. -種楸樹CabuAP3基因，其特征在于，其cDNA全長(zhǎng)的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所 不。8. 權(quán)利要求7所述的基因在改造植物花器官中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將權(quán)利要 求7所述基因或權(quán)利要求2所述的編碼基因序列轉(zhuǎn)入植物中。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種楸樹CabuAP3蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？No.1所示，編碼基因序列(CDS)如SEQ？ID？No.2所示，所述楸樹CabuAP3基因的cDNA序列全長(zhǎng)如SEQ？ID？No.3所示。本發(fā)明提供的CabuAP3基因僅在楸樹的花瓣和雄蕊中表達(dá)，而在葉片、萼片和雌蕊中不表達(dá)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將CabuAP3基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入野生型擬南芥和擬南芥ap3-3突變體中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥額外長(zhǎng)出了1個(gè)花瓣，說(shuō)明CabuAP3基因具有調(diào)控轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥花瓣數(shù)量增加的功能，而轉(zhuǎn)基因擬南芥ap3-3突變體長(zhǎng)出了花絲狀結(jié)構(gòu)。利用楸樹CabuAP3基因表達(dá)載體獲得的植物變異材料，可用于植物育種和觀賞，具有很好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C07K14/415, C12N15/84, C12N15/29, C12N15/11, C12N1/21, A01H5/02
【公開號(hào)】CN105111291
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510544023
【發(fā)明人】王軍輝, 景丹龍, 夏燕, 張守攻
【申請(qǐng)人】中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所
【公開日】2015年12月2日
【申請(qǐng)日】2015年8月28日