心lmin后，棄掉收集管中的廢液。加入500yL漂洗液，再重 復(fù)一次；將吸附柱放回空收集管中，13000rpm離心2min，目的是盡量去除漂洗液；取出吸附 柱，放回到空的RNase-freeeppendorf管中，加入50tiL的RNasefreewater室溫放置 lmin，12000rpm離心2min;將第一次洗脫液加入到吸附柱中，再重復(fù)一次。吸取2yL稀釋 后的RNA樣品，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度。
[0033] 2、楸樹花芽totalRNA的 3'RACE實(shí)驗(yàn)
[0034] 吸取的楸樹花芽totalRNA為3'RACE實(shí)驗(yàn)的模板，以3'RACEAdaptor為引物 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成3'狀0￡實(shí)驗(yàn)的第一鏈〇0嫩；取切丨&11?熟2.5 1^，0￡?(：-(1(11120 3yL，3'RACEAdaptor1yL，混勻，在70°C，變性10min;冰浴2min;反應(yīng)結(jié)束后，依次加入 5XM-MLVbuffer2yL，10mMdNTPlyL，RNaseinhibitor0.25yL，M-MLV0.25yL，混勻 后，置于42°C條件下，反應(yīng)60min;70°C條件下，反應(yīng)15min;冰浴2min，然后置于-20°C條件 下，待用。
[0035] 以第一鏈3'RACE逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用高保真EX-taq酶，上游外側(cè)特異性 引物GSPAP3F1:5' -GGGAAGATCCAGATCAAGAGGATAGAGAA-3'和 3'RACEOuterPrimer: 5' -TACCGTCGITCCACTAGTGAITT-3'，進(jìn)行第 1 步PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為 94°C4min;94°C45s， 57°〇458,721€458，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°(：101^11。反應(yīng)結(jié)束后，以第1步0此？〇?產(chǎn)物為模板， 使用高保真EX-taq酶，上游內(nèi)側(cè)引物GSPAP3F2 :5' -GATGCTAAAGITTCCATTATCATGAT-3'和 3 'RACEInnerPrimer: 5 ' -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'，進(jìn)行第 2 步PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件為 94°C4min;94°C45s，57°C45s，72°C45s，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°ClOmin。 反應(yīng)結(jié)束后，通過1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖3)，切下目的片段，按照說明書用瓊脂糖凝 膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接到pmdl8-T載體后，轉(zhuǎn)入toplO大腸桿 菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，進(jìn)行測(cè)序。
[0036] 3、楸樹花芽totalRNA的 5'RACE實(shí)驗(yàn)
[0037] 按照實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)要求，對(duì)楸樹花芽totalRNA中裸露的5'磷酸基團(tuán)進(jìn)行"去 磷酸化反應(yīng)"和"去帽子"反應(yīng)，接著進(jìn)行5'RACEAdaptor接頭的連接反應(yīng)，得到楸樹 的LigatedRNA。吸取LigatedRNA6yL，Random9meter0. 5uL,詈于 70°C條件下，冰 上放置 2min;接著，加入 5XM-MLVbuffer2yL，dNTPlyL，RNAInhibitor0.25yL， M-MLV0.25yL10yL，反應(yīng)程序：30°C10min，42°Clh，70°C15min。反應(yīng)結(jié)束后，可置 于-2(TC。
[0038] 以第一鏈5'RACE逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用高保真LA-taq酶，5'RACEOuter Primer:5'-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3 '和下游外側(cè)特異性引物AP3GSPR1 : 5 ' -CCAACAACCTTCTGGTACTGATC-3 '，進(jìn)行第 1 步PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為 94°C4min; 94°〇458,571€458,721€458，進(jìn)行30個(gè)循環(huán) ；72°(：10111111。反應(yīng)結(jié)束后，以第1步5'狀0￡0此 PCR產(chǎn)物為模板，使用高保真LA-taq酶，5'RACEInnerPrimer: 5'-CGCGGATCCACAGCCTACTGA TGATCAGTCGATG-3'和下游內(nèi)側(cè)引物AP3GSPR2 :5' -ATGTAITCATGAAGCTTCTGAGTAC-3 ' ；進(jìn) 行第2步PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為94°C4min;94°C45s，57°C45s，72°C45s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)； 72°C10min。反應(yīng)結(jié)束后，利用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后（圖3)，切下目的片段，按照說明 書用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。連接到pmdl8-T載體后，轉(zhuǎn)入toplO大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，進(jìn)行測(cè)序。
[0039] 4、使用DNAMAN軟件對(duì)3'RACE和5'RACE實(shí)驗(yàn)的PCR測(cè)序結(jié)果，進(jìn)行分析和拼接， 得到楸樹CabuAP3基因的cDNA序列全長(zhǎng)（SEQIDNo. 3)，其序列圖片見圖1。
[0040] 5、在楸樹CabuAP3基因序列全長(zhǎng)的5'UTR和3'UTR設(shè)計(jì)引物FLAP3F:5'-ACTTCTTC ATCTCCCTCTCATCT-3' 和FLAP3R:5' -AATAACCAAACACAAGITCATCA-3'，反應(yīng)條件為 94°C4min; 94°C45s，56°C45s，72°C45s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C10min。反應(yīng)結(jié)束后，利用1%瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè)后（圖3)，切下目的片段，按照說明書用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn) 物。連接到pmdl8-T載體后，轉(zhuǎn)入toplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，進(jìn)行測(cè)序。對(duì) CabuAP3基因功能區(qū)的⑶S序列進(jìn)行驗(yàn)證。
[0041] 實(shí)施例2 -個(gè)楸樹CabuAP3基因編碼的蛋白序列
[0042] 使用primer5軟件，對(duì)楸樹CabuAP3基因的cDNA序列全長(zhǎng)，進(jìn)行蛋白序列翻譯 (SEQIDNo. 1)，并根據(jù)MADS-box基因特點(diǎn)，楸樹CabuAP3蛋白序列進(jìn)行M區(qū)、I區(qū)、K區(qū)、C 區(qū)以及C區(qū)包含的2個(gè)基序Pi-derived基序和euAP3基序劃分（圖2)。
[0043] 實(shí)施例3楸樹CabuAP3基因的表達(dá)模式分析
[0044] 根據(jù)楸樹CabuAP3基因的cDNA序列全長(zhǎng)，利用〇1igo6. 0軟件設(shè)計(jì)半定量 GCAAACGTG-3'。用PCR對(duì)其特異性進(jìn)行檢測(cè)，在確保PCR特異性擴(kuò)增前提下，方可使 用。以楸樹actin基因?yàn)榘攵吭囼?yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，actin基因的引物為CabuactinF: 5' -TCACACTGGTGTGATGGTTG-3' 和CabuactinR:5' -AGTTCTTCTCCACAGCAGAG-3'。通過幼葉、 萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊的第1鏈cDNA模板量的比例來(lái)調(diào)整檢測(cè)條帶亮度。半定量PCR反應(yīng) 程序：94°C4min;94°C30s，57°C30s，72°C30s，進(jìn)行 25 個(gè)循環(huán)；72°ClOmin。反應(yīng)結(jié)束后， 用含GoldenView的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。在BIO-RADGelDocXR+凝膠成像系統(tǒng) 中進(jìn)行DNA條帶的亮度檢測(cè)，并拍照（圖4)。
[0045] 實(shí)施例4楸樹CabuAP3基因的植物轉(zhuǎn)基因載體PBI121_CabuAP3構(gòu)建
[0046] 采用PCR擴(kuò)增的手段，在楸樹CabuAP3基因的⑶S兩端引入酶切位點(diǎn)。以楸樹 花芽totalRNA逆轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA為模板，以CabuAP3-F(引入XbaI酶切位點(diǎn)）和 CabuAP3_R(引入SmaI酶切位點(diǎn)）為引物，使用高保真EX-taq酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng) 程序：94￡€41^11;941€458,57 1€458,721€458，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°(：1〇111111。反應(yīng)結(jié)束后，吸 取PCR產(chǎn)物10yL，進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)和切膠后，使用瓊脂糖 凝膠DNA回收試劑盒回收。將回收后的PCR產(chǎn)物與pmdl8-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入top10大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆后，送樣測(cè)序。使用DNAMAN軟件對(duì)送樣的序列分析正確后， 提取質(zhì)粒。如圖5所示，使用XbaI和SmaI限制性內(nèi)切酶對(duì)含有目的片段pmdl8-CabuAP3 重組質(zhì)粒和PBI121載體，分別進(jìn)行雙酶切后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用瓊脂糖凝 膠DNA回收試劑盒回收。使用T4DNA連接酶將酶切后的CabuAP3基因與PBI121連接后，轉(zhuǎn)入 toplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PBI121-CabuAP3。進(jìn)一步使