專利名稱：辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)、鑒定及防治技術(shù)的領(lǐng)域，更具體涉及一種辣椒疫病菌分子 檢測(cè)引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(戶/^o; /^om co/wZc/)侵染引起的一種毀滅性病害，該病于 1918年首次在美國(guó)新墨西哥州發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已成為世界各國(guó)辣椒生產(chǎn)上的主要病害(Ristaine et al.，1999)。辣椒疫霉菌寄主范圍廣，除辣椒外，還可侵染茄科和葫蘆科的番茄、茄子、西瓜和 西葫蘆等50多種作物(Tianetal.，2004; Hausbeck， et al., 2004)，其發(fā)生面積廣，危害十分嚴(yán)重， 在適宜發(fā)病條件下，病害大流行可造成寄主作物絕收(Gevensetal.,2007;姜彥全等,2008; 劉學(xué)敏等，2007)。同時(shí)，辣椒疫霉菌是一種土傳病原菌，它可以經(jīng)雨水、土壤、病殘?bào)w等從 發(fā)病區(qū)向未發(fā)病區(qū)傳播，而且其侵染能力強(qiáng)，由其引起的病害多屬于多循環(huán)病害，在較短的 時(shí)間內(nèi)可造成植株死亡、根莖和果實(shí)腐爛。因此，開(kāi)展辣椒疫霉菌檢測(cè)，防止其從發(fā)病區(qū)向 未發(fā)病區(qū)傳播，以及在其發(fā)病初期進(jìn)行診斷檢測(cè)，對(duì)辣椒疫病的及時(shí)控制具有重要意義(Silvar， etal,2005)。
自從發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉菌以來(lái)，各國(guó)研究人員便對(duì)其檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行研究，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是 采用選擇性培養(yǎng)基從土壤、植物組織或水體中分離菌株，再對(duì)這些菌株的形態(tài)等進(jìn)行鑒定， 來(lái)確定是否存在辣椒疫霉菌，或者用肉眼和借助顯微鏡技術(shù)對(duì)發(fā)病癥狀進(jìn)行判定是否由辣椒 疫霉菌引起的病害。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不僅費(fèi)時(shí)、準(zhǔn)確度低，而且要求檢測(cè)人員要有豐富的經(jīng) 驗(yàn)，最重要一點(diǎn)是它不能滿足病害防治中制定最佳防治時(shí)期的需求，因此傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方 法已不能滿足現(xiàn)代植物病理學(xué)研究的需要，因其很容易錯(cuò)過(guò)病害防治的最佳時(shí)期(Kelly， et al.， 2006; Schena， et al., 2008)。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行特異、靈敏的快速分子檢測(cè)的 成功例子己越來(lái)越多(Li etal，2003)。國(guó)內(nèi)外有學(xué)者利用基于ITS堿基序列設(shè)計(jì)引物對(duì)辣椒疫 霉菌的分子檢測(cè)開(kāi)展研究(Silvar et al., 2005; Zhang, et al.， 2006)，但是ITS在病原菌的近緣種 之間變化很小，從ITS序列上設(shè)計(jì)引物很難將兩個(gè)相以性高的種區(qū)分開(kāi)(Martin and Tooley， 2003)，很難從ITS序列上對(duì)它們進(jìn)行區(qū)分(Brasier et al,2004)。因此要對(duì)辣椒疫霉菌進(jìn)行高靈 敏性和特異檢測(cè)，應(yīng)從疫霉菌其它基因上設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)。已有研究表明，疫霉菌屬中的YPT1基因(ras-related protein)含有多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，多個(gè)外顯子具有保守性，而這些 內(nèi)含子在不同種之間具有多變性，非常適合于設(shè)計(jì)引物進(jìn)行疫霉屬卵菌近緣種的分子檢測(cè)， 區(qū)分不同種的疫霉菌(Schenaeta1，2006)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物及其應(yīng)用，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中辣椒疫病 菌的生物學(xué)檢測(cè)方法所需周期長(zhǎng)、目前辣椒疫病菌分子檢測(cè)測(cè)方法特異性差，靈敏度低的問(wèn) 題，提供一種辣椒疫病菌的特異分子檢測(cè)引物，方法結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏 度高，可用于帶菌的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測(cè)，同時(shí)可用于田間辣椒疫病的 早期診斷和病菌的監(jiān)測(cè)和鑒定，此技術(shù)對(duì)于辣椒疫霉菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測(cè)，確定 病害防治最佳時(shí)期具有十分重要的意義。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的包括下列步驟
1. 根據(jù)辣椒疫病YPT基因序列的特異性，設(shè)計(jì)了對(duì)辣椒疫病菌具有特異擴(kuò)增作用的一 對(duì)PCR引物，即特異分子檢測(cè)引物的序列為
上游引物PCA1F: 5'- GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA -3， 下游引物PCA2R: 5'- ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT -3，，
2. 辣椒疫病菌特異分子檢測(cè)體系的建立
(1) 被辣椒疫病菌、辣椒疫病菌感染的植物組織或存在辣椒疫病菌的土壤中提取DNA;
(2) PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系25pl，包括2.5pl 10xPCR反應(yīng)緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和10ng模板 DNA， d.d.H20補(bǔ)足25pl， PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2min; 94。C變性lmin,60。C退火 30 sec ，72。C延伸lmin共35個(gè)循環(huán)；72 。C延伸10 min。
① 當(dāng)在用于植株組織中存在辣椒疫病菌時(shí)，采用CTAB法提取辣椒疫病菌的DNA，按如 下的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系25^1，包括 2.5^1 10xPCR反應(yīng)緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引 物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和lOng模板DNA, d.d.H20補(bǔ)足25^1， PCR反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性2min; 94。C變性lmin， 60。C退火30sec， 72。C延伸lmin共35個(gè)循環(huán)；72 °C 延伸10min。
② 當(dāng)在土壤樣品中存在辣椒疫病菌條件下，采用土壤DNA提取法(步驟見(jiàn)具體實(shí)施例4) 提取土壤中辣椒疫病菌的DNA，按如下的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系25^il，包括2.5^1 10xPCR反應(yīng)緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCAIF和PCA2R各0.5nmol/L和lOng模板DNA， d.d.H20補(bǔ) 足25pl， PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2min; 94'C變性lmin， 60。C退火30 sec， 72'C延 伸lmin共35個(gè)循環(huán)；72 'C延伸10 min。
(3) 然后將8(ilPCR產(chǎn)物用重量濃度1.5。/。瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫外 燈下根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。
(4) 如果能特異性地?cái)U(kuò)增出364bp產(chǎn)物時(shí)，即可判斷所述的植株組織或土壤樣品中存在 辣椒疫病菌；否則所述的植株組織或土壤樣品中未存在辣椒疫病菌。
本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)是辣椒疫病菌的高效特異擴(kuò)增的引物序列及其擴(kuò)增方法。為了獲得 辣椒疫病菌的特異引物序列，本發(fā)明以我國(guó)福建、安徽和北京等省的42株辣椒疫病菌和多個(gè) 疫霉屬近緣種以及常見(jiàn)的幾種病原真菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA， 具體方法如下取50mg冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入卯Opl重量濃度2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液(重量濃度2。/。CTAB; 100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0; 20mmol/LEDTA， pH8.0; 1.4 mol/LNaCD禾B 90^1重量濃度10% SDS (十二烷基苯磺酸鈉) 后混勻，于55 6(TC水浴1.5h，每10min振蕩混勻一次，水浴1.5h后離心(12,000rpm)15min，
取上清液加入等體積的酚、氯仿和異戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚氯仿異戊醇的體
積比為25 : 24 : 1,離心(12,000rpm)5 min，取上清液(水相)，加入等體積氯仿抽提一次 (12,000rpm離心5min)，吸上清液，加0.1體積的3mol/LNaAC溶液和2體積的—20。C無(wú)水 乙醇，一20。C下沉淀30min后12，000rpm離心5min，輕輕地倒去上清液，加入700W體積濃 度70%的一20"乙醇進(jìn)行洗滌(稍離心，傾掉上清)，在超凈工作臺(tái)上自然晾干無(wú)酒精味后 用lxTE (10mmol/LTris-HCL， 0.1mmol/LEDTA， pH8.0)溶液進(jìn)行溶解，得到DNA溶液， 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度并稀釋至50ng4U待用。在辣椒疫病菌特異DNA片段序列 的基礎(chǔ)上應(yīng)用ClustalX軟件比對(duì)設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)對(duì)供試菌株和42株辣椒疫病菌的特異性進(jìn) 行PCR驗(yàn)證(具體的反應(yīng)體系是PCR反應(yīng)體系25^1，包括2.5^1 10xPCR反應(yīng)緩沖液，2.0mmol/L Mg2+, 5Opmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和10ng 模板DNA， d.d.H20補(bǔ)足25pd， PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2min; 94。C變性lmin， 60°C 退火30sec， 72'C延伸lmin共35個(gè)循環(huán)；72 'C延伸10min，此特異引物在辣椒疫病菌上特 異性地?cái)U(kuò)增出364bp的產(chǎn)物。這說(shuō)明該引物可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)病植物組織和土樣中辣椒 疫病菌快速可靠的檢測(cè)和鑒定。
本發(fā)明有益效果本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，通過(guò)測(cè)定辣椒疫病菌及其它疫霉 菌的YPT1基因，并進(jìn)行多重比對(duì)分析，針對(duì)辣椒疫病菌的YPT1基因內(nèi)含子特異序列設(shè)計(jì)出了一對(duì)引物，用于帶辣椒疫病菌的植物組織和土壤的高靈敏度快速分子檢測(cè)，建立辣椒疫 霉菌快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)技術(shù)體系。此技術(shù)可應(yīng)用于辣椒疫霉 菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測(cè)，對(duì)于確定病害防治最佳時(shí)期具有重要的作用，為防治策略 的制定提供科學(xué)依據(jù)。
本發(fā)明方法適用于土樣和植物組織中辣椒疫病菌的快速可靠的檢測(cè)和鑒定，對(duì)于農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)中辣椒疫病菌引起的病害的防治具有重要的實(shí)用價(jià)值；本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下 的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和積極效果 .
1、 特異性強(qiáng)本發(fā)明檢測(cè)方法是利用辣椒疫霉菌的YPT1基因具有保守性外顯子和多變 性內(nèi)含子特點(diǎn)，根據(jù)多變性內(nèi)含子特異序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)。已經(jīng)對(duì)源于來(lái)自我國(guó)福建、 安徽、北京等不同地區(qū)的辣椒疫病菌和疫霉菌近緣種及其它卵菌的驗(yàn)證，結(jié)果具有很強(qiáng)的特 異性；
2、 實(shí)用性好本發(fā)明所設(shè)計(jì)出的一對(duì)特異性引物，可用于帶辣椒疫病菌的植物組織和土 壤的高靈敏度快速分子檢測(cè)，因此本方法的實(shí)用性強(qiáng)，可滿足對(duì)帶菌土壤和發(fā)病植物組織中 存在的辣椒疫病菌進(jìn)行快速可靠的檢測(cè)和鑒定的需要；
3、 操作簡(jiǎn)便快速應(yīng)用本發(fā)明方法，對(duì)帶辣椒疫病菌的土樣和植物組織進(jìn)行病菌DNA 提取、PCR擴(kuò)增和常規(guī)的瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，無(wú)需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶 切。 一般整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在8小時(shí)內(nèi)完成。


圖1為本發(fā)明所要檢測(cè)的辣椒疫病菌的特異PCR擴(kuò)增圖。
圖中泳道l和泳道22為100bpladder分子量marker，泳道2-14為辣椒疫病菌，泳道15為 大豆疫病菌，泳道16為致病疫病菌，泳道17為掘氏疫病菌，泳道18為煙草疫病菌，泳道 19為惡疫霉菌，泳道20為黃瓜霜霉菌，泳道21為瓜果腐霉菌。
圖2為本發(fā)明辣椒疫病菌的靈敏性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果圖。
圖中泳道1和15為1 OObp ladder分子量marker，泳道2為1嗎，泳道3為1 OOng，泳道4為1 Ong， 泳道5為lng,泳道6為100pg,泳道7為10pg，泳道8為lpg，泳道9為100fg，泳道10為10fg， 泳道ll為lfg，泳道12為100ag，泳道13為10ag，泳道14為陰性對(duì)照。
圖3為本發(fā)明發(fā)病組織和帶菌土壤的檢測(cè)結(jié)果圖。 圖中泳道1為100bp ladder分子量marker,泳道2為陰性對(duì)照，泳道3， 4， 5， 6為 發(fā)病的辣椒植物組織，泳道7和泳道8為辣椒疫病發(fā)病田土壤。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括辣椒疫病菌的特異檢測(cè)引物，所設(shè)計(jì)的引物及其序列為
PCA1F: 5'國(guó)GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA國(guó)3' PCA2R:: 5'- ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT -3';
利用該引物可從辣椒疫病菌上特異擴(kuò)增出364bp的產(chǎn)物。 以下結(jié)合實(shí)施例具體闡述本發(fā)明 實(shí)施例l:引物對(duì)辣椒疫病菌的特異性擴(kuò)增
1. 辣椒疫病菌的特異檢測(cè)
PCR反應(yīng)體系25^d，包括2.5^1 10xPCR反應(yīng)緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和10ng模板DNA， d.d.H20 補(bǔ)足25pl， PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2min; 94。C變性lmin， 60。C退火30sec， 72°C 延伸lmin共35個(gè)循環(huán)；72 'C延伸10 min。
2. 檢測(cè)結(jié)果
檢測(cè)的特異性除了來(lái)自我國(guó)福建、安徽、江蘇等省份的辣椒疫病菌DNA可特異地?cái)U(kuò) 增出364 bp的產(chǎn)物外，檢測(cè)了卵菌的其它13種疫霉種、霜霉菌、腐霉菌及其它的真菌和細(xì) 菌等菌株DNA均未能擴(kuò)增出任何產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的特異性。 實(shí)施例2:引物對(duì)辣椒疫病菌的靈敏性檢測(cè)
1. DNA濃度稀釋提取的辣椒疫病菌基因組DNA，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，采用系 列濃度稀釋。
2. 辣椒疫病菌的靈敏性檢測(cè)
PCR反應(yīng)體系25^1，包括2.5pl 10xPCR反應(yīng)緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F/PCA2R各0.5pmol/L和lOng模板DNA， d.d.H20補(bǔ)足 25nl， PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2min; 94。C變性lmin， 60。C退火30 sec， 72。C延伸 lmin共35個(gè)循環(huán)；72 。C延伸10 min。
3. 檢測(cè)結(jié)果在25pl反應(yīng)體系中，lpg辣椒疫病菌基因組DNA可獲得明顯擴(kuò)增條帶， 檢測(cè)靈敏度可達(dá)lpg。
實(shí)施例3:發(fā)病植物組織中辣椒疫病菌的檢測(cè)。
1. 樣品采集植物組織樣品采自福建省福州市郊南通鎮(zhèn)蔬菜基地
2. DNA提取及檢測(cè)
發(fā)病植物組織采用CTAB法提取DNA，按上述試劑盒實(shí)施的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25nl，包括2.5^110xPCR反應(yīng)緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCAIF和PCA2R各0.5pmol/L和lOng模板DNA， d.d.H20補(bǔ)足25jil， PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2min; 94。C變性lmin， 60。C退火30 sec， 72。C延伸lmin共 35個(gè)循環(huán)；72'C延伸10min。電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。 3.檢測(cè)結(jié)果
結(jié)果見(jiàn)圖3，見(jiàn)到一條清晰的分子量為364bp的特異條帶，因而判斷發(fā)病組織感染辣椒 疫病菌。
實(shí)施例4: 土壤樣品中辣椒疫病菌的檢測(cè)。
1. 樣品采集土壤樣品采自福建省龍海市浮宮鎮(zhèn)辣椒蔬菜基地
2. DNA提取及檢測(cè)
(1) 從發(fā)病土壤樣品中提取DNA:
取過(guò)篩的土壤冷凍抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細(xì) 粉分裝至1.5ml離心管中，每管加入500 nl重量濃度0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻，12000 卬m離心15min。取上清加入等體積蛋白酶K緩沖液，加終濃度為1(Vg/ml蛋白酶K， 55°C 水浴1-3 h，水浴結(jié)束后，加入1/2體積的7.5 M NH4AC溶液，上下顛倒混勻，12000 rpm離 心15min，吸上清液加2倍體積無(wú)水乙醇—2(TC沉淀(沉淀時(shí)間1.5h)。沉淀結(jié)束后，12000 rpm離心15 min。用體積濃度70%乙醇洗漆沉淀后傾去，室溫晾干。每份樣品所提DNA用 10plTE (或無(wú)菌超純水)溶解，-2(TC保存?zhèn)溆谩?br> (2) 辣椒疫病菌的PCR檢測(cè) 按上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25nl，包括2.5^11 10xPCR反應(yīng)緩沖液，2.0mmol/L
Mg2+， 50nmol/L dNTPs, 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5nmol/L和10ng 模板DNA， d.d,H20補(bǔ)足25nl， PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2min; 94'C變性lmin， 60°C 退火30sec， 72。C延伸lmin共35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
3. 檢測(cè)結(jié)果
結(jié)果見(jiàn)圖3,見(jiàn)到一條清晰的分子量為364bp的特異條帶，可以判斷土壤樣品侵染辣椒 疫病菌。核苷酸序列表
<110>福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
<120>辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物及其應(yīng)用
<160>2
<210> 1
<211>21
<212>DNA
<213>辣椒疫病菌(P一o盧/wra c印由')
<220>
<400> 1
5'- gtatagcagaggtttagtgaa -3，
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>辣椒疫病菌(P/ vtop/^wraca/w/d)
<220>
<400> 2
5'-actgaagttctgcgtgcgtt -3"
10
權(quán)利要求
1. 一種辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物，其特征在于所述辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物的序列為PCA1F5‘-GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA-3’PCA2R5‘-ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT-3’。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物，其特征在于所述辣椒疫病菌分子檢 測(cè)引物PCA1F和PCA2R對(duì)辣椒疫病菌特異性擴(kuò)增出364bp的產(chǎn)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物，其特征在于所述辣椒疫病菌分子檢 測(cè)引物特異引物序列獲得方法為以辣椒疫病菌和多個(gè)疫霉屬近緣種以及常見(jiàn)的幾種病 原真菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下取50mg冷 凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入900pl重量濃度2%十六垸基三甲基溴化銨 CTAB提取液和90jil重量濃度10%十二垸基苯磺酸鈉SDS后混勻，于55 6(TC水浴1.5 h, 每10 min振蕩混勻一次，水浴1.5h后離心15min,離心速度為12,000rpm，取上清液加入等體積的酚、氯仿和異戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚氯仿異戊醇的體積比為25:24:1,離心5min，離心速度為12，000rpm，取上清液，即水相，加入等體積氯仿抽 提一次，離心5min，離心速度為12,000rpm,吸上清液，力[]0.1體積的3mol/L NaAC溶 液和2體積的一20'C無(wú)水乙醇，一20。C下沉淀30min后12,000rpm離心5 min，輕輕地倒 去上清液，加入70(^1體積濃度70%的_20°0]乙醇進(jìn)行洗滌，稍離心，傾掉上清，在超 凈工作臺(tái)上自然晾干無(wú)酒精味后用lxTE溶液進(jìn)行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光 度計(jì)檢測(cè)DNA濃度并稀釋至50ng4U待用；在辣椒疫病菌特異DNA片段序列的基礎(chǔ)上 應(yīng)用ClustalX軟件比對(duì)設(shè)計(jì)特異引物，獲得辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物特異引物序列，經(jīng) 對(duì)供試菌株和42株辣椒疫病菌的特異性進(jìn)行PCR驗(yàn)證，所述特異引物在辣椒疫病菌上特 異性地?cái)U(kuò)增出364bp的產(chǎn)物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物，其特征在于所述CTAB提取液為重 量濃度2% CTAB; 100 m mol/LTris-HCl， PH 8.0; 20mmol/L EDTA，pH8.0: 1.4 mol/L NaCl。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物，其特征在于所述lxTE溶液為 10腿ol/LTris-HCL， 0.1腿ol/LEDTA, pH8.0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物，其特征在于所述對(duì)供試菌株和42株 辣椒疫病菌的特異性進(jìn)行PCR驗(yàn)證的具體的反應(yīng)體系是PCR反應(yīng)體系25^1，包括2.5^1 10xPCR反應(yīng)緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50pmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物 PCA1F和PCA2R各0.5iimol/L和lOng模板DNA, d.d.H20補(bǔ)足25jJ， PCR反應(yīng)條件為 95。C預(yù)變性2min; 94。C變性lmin， 60。C退火30sec , 72'C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)； 72。C延伸10min。
7. —種如權(quán)利要求1、 2、 3、 4、 5或6所述的辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物的應(yīng)用，其特征在 于所述的辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物應(yīng)用于辣椒疫病菌的快速分子檢測(cè)診斷，按照以下 步驟檢測(cè)G) 從被辣椒疫病菌、辣椒疫病菌感染的植物組織或存在辣椒疫病菌的土壤中提取 DNA;(2) 以該DNA為模板用所述的一對(duì)引物PCA1F和PCA2R通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò) 增；PCR反應(yīng)體系25^1，所述PCR反應(yīng)體系為2.5^ 10xPCR反應(yīng)緩沖液，2.0mmol/L Mg2+， 50pmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L 禾卩10ng模板DNA,d.d.H2O補(bǔ)足25jxl; PCR反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性2min; 94°C 變性lmin， 6(TC退火30sec， 72。C延伸lmin共35個(gè)循環(huán)；72 。C延伸10min;(3) 然后取適量步驟(2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后于紫 外燈下觀察，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出364 bp的產(chǎn)物， 即可判斷所述的植物組織或土壤樣品中存在辣椒疫病菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物的應(yīng)用，其特征在于當(dāng)植株組織中存 在辣椒疫病菌時(shí)，采用CTAB法提取辣椒疫病菌的DNA。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物的應(yīng)用，其特征在于采用土壤DNA提 取法提取土壤中辣椒疫病菌的DNA:取過(guò)篩的土壤冷凍抽干24-48 h后加少量石英砂， 倒入液氮充分研磨，將研磨后的土壤細(xì)粉分裝至1.5ml離心管中，每管加入500 ^1重量 濃度0.4%脫脂奶粉溶液，渦旋混勻，12000 rpm離心15 min，取上清加入等體積蛋白酶 K緩沖液，加終濃度為10 Mg/ml蛋白酶K， 55'C水浴l-3h，水浴結(jié)束后，加入1/2體積 的7.5 M NH4AC溶液，上下顛倒混勻，12000 rpm離心15 min，吸上清加2倍體積無(wú)水 乙醇一20'C沉淀，沉淀時(shí)間1.5h，沉淀結(jié)束后，12000 rpm離心15 min，用體積濃度70% 乙醇洗滌沉淀后傾去，室溫晾干，每份樣品所提DNA用10WTE或無(wú)菌超純水溶解，-20 'C保存?zhèn)溆谩?br> 10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(3)為 取8 pi PCR產(chǎn)物用重量濃度1.5%瓊脂糖電泳分離。
全文摘要
本發(fā)明提供一種辣椒疫病菌分子檢測(cè)引物及其應(yīng)用，該特異引物上游引物PCA1F5‘-GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA-3’；下游引物PCA2R5‘-ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT-3’；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，可在辣椒疫病菌純DNA、帶菌的發(fā)病組織及土壤上特異性地?cái)U(kuò)增出片段長(zhǎng)度為364bp的特異擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)辣椒疫病菌快速檢測(cè)；本發(fā)明的特異分子檢測(cè)引物及其用法可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中辣椒疫病菌感染的植物組織和土壤中辣椒疫病菌的快速、靈敏、特異的檢測(cè)，同時(shí)可用于田間病害的早期診斷和病菌的監(jiān)測(cè)和鑒定，為辣椒疫病菌引起的病害的防治提供可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101445825SQ20081007243
公開(kāi)日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者蘭成忠, 李本金, 翁啟勇, 健 趙, 陳慶河 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所