溶液H按照I :2 (v/v)的比例混合混合，室溫攪拌4h，裝入透析袋， 采用濃度為〇. 05M，pH值為7. 0的PBS緩沖液作為透析液進行透析72h，得到CS與HRP的 偶聯(lián)物，即為酶標物。
[0112] 酶標工作液：采用樣品稀釋液將酶標物配置成濃度為1 μ g/mL的溶液，即為酶標 工作液。
[0113] -、蛋白質(zhì)flop的靈敏度試驗
[0114] 1、包被：將實施例2中獲得的BL21-pET28b-flop-7菌株純化后的蛋白質(zhì)溶液采用 包被緩沖液稀釋成濃度為1 μ g/mL的蛋白質(zhì)flop溶液，加入到酶標板中，每孔100 μ L。
[0115] 2、洗滌與封閉：傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次3min ;每孔加入150 μ L封 閉液，37°C恒溫封閉lh，傾去孔內(nèi)液體，然后用洗滌液洗滌3次，每次3min，得到酶標板。
[0116] 3、加樣：
[0117] 3.1、標準品孔
[0118] 將磺胺藥物標準品磺胺二甲基嘧啶用樣品稀釋液溶解，配置成如下濃度梯度的溶 液：50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL 和 I. 6ng/mL。向包被有蛋白質(zhì) flop的酶標板微孔中加入50 μ L上述一種濃度的磺胺二甲基嘧啶溶液，再加入酶標物工作 液50 μ L，用蓋板膜封板。
[0119] 3. 2陰性對照孔
[0120] 與3. 1的區(qū)別僅在于將磺胺二甲基嘧啶溶液替換為等體積的高純水，其它步驟不 變。
[0121] 3. 3空白對照孔
[0122] 與3. 1的區(qū)別僅在于將空白孔為將添加的蛋白質(zhì)flop溶液替換為高純水，其它步 驟不變。
[0123] 37°C恒溫箱中反應30min，甩干孔中液體，每孔加入350 μ L洗滌液，30s后倒出孔 中液體，如此重復操作共洗板4次，用吸水紙拍干。
[0124] 4、顯色：每孔加入IOOyL底物顯色液，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色 lOmin，然后每孔加入終止液50 μ L以終止反應，輕輕振蕩混勻，最后用酶標儀測定各孔的 〇〇咖值。
[0125] 用每個濃度的磺胺二甲基嘧啶溶液的吸光度平均值（B)除以陰性對照孔的吸光 度值（Β。）再乘以100%，得到百分吸光度值。
[0126] 百分吸光度值=2 X 100% %
[0127] 以標準品溶液濃度（ng/mL)為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線（圖6)， 當B/B。為50%時，所對應的標準品溶液的濃度即為半抑制率（IC 5。）。由ELISA方法的標準 曲線可見，磺胺二甲基啼啶對蛋白質(zhì)flop的半數(shù)抑制量（IC5。）為9. 03ng/mL，最低檢測限 (LOD)為4. 82ng/mL，在5. 61-14. 59ng/mL范圍內(nèi)，抑制率與磺胺二甲基嘧啶標準品溶液濃 度的對數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r = 0. 999。與陰性對照（未加磺胺二甲基嘧啶 標準品溶液）相比，加入磺胺二甲基嘧啶標準品溶液后，吸光值呈明顯的遞減梯度，說明獲 得的蛋白質(zhì)flop能夠特異性地識別磺胺二甲基嘧啶標準品，對磺胺二甲基嘧啶標準品具 有較高的親和力。
[0128] 二、蛋白質(zhì)flop的特異性試驗
[0129] 采用樣品稀釋液分別溶解磺胺異噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺 胺甲二唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、 磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪、磺胺乙氧噠嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲 基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁挫、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺間甲氧噠嗪、磺胺 硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑等磺胺藥物樣品，配置 成如下濃度梯度的溶液：50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL 和 I. 6ng/ mL。按照步驟一中的操作方法分別計算磺胺異噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡 啶、磺胺甲二唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺林、磺胺索嘧啶、 磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪、磺胺乙氧噠嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲 基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁挫、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺間甲氧噠嗪、磺胺 硝苯、磺胺啼啶、磺胺溴二甲啼啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑樣品對蛋白質(zhì)f 10 P 的半數(shù)抑制量（IC5。）分別為 2. 95ng/mL、4. 58ng/mL、4. 92ng/mL、5. 28ng/mL、5. 75ng/mL、 6. 37ng/mL、6. 66ng/mL、6. 68ng/mL、7. 08ng/mL、7. 22ng/mL、7. 39ng/mL、7. 44ng/mL、7. 86ng/ mL、8. 07ng/mL、8. 39ng/mL、8. 78ng/mL、8. 84ng/mL、9. 03ng/mL、10. 02ng/mL、10. 69ng/mL、 11. 93ng/mL、14. 09ng/mL、20. 43ng/mL、21. 79ng/mL、25. 83ng/mL、28. 75ng/mL、31. 24ng/mL、 54. 42ng/mL、56. 22ng/mL樣品對蛋白質(zhì)flop的半數(shù)抑制量（IC5。）的數(shù)值）及磺胺二甲基嘧 啶標準品與磺胺異噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺間甲氧嘧 啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺（二）甲 噁唑、磺胺氯噠嗪、磺胺乙氧噠嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲 氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺間甲氧噠嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺 胺溴（二）甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑樣品的交叉反應率，交叉反應率的公 式為：交叉反應率（％) =(引起蛋白質(zhì)flop 50%抑制的磺胺二甲基啼啶標準品的濃度/ 引起蛋白質(zhì)flop 50%抑制的其它磺胺藥物的濃度）X 100%。實驗設(shè)三次重復。
[0130] 結(jié)果見表1，蛋白質(zhì)flop可以識別包括磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻 唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑等在內(nèi)的至少29種磺胺藥物。
[0131] 表1、多種磺胺藥物的交叉反應率
[0132]
【主權(quán)項】
1. 重組大腸桿菌，其特征在于：所述重組大腸桿菌是大腸埃希氏菌（Escherichia C〇li)BL21(DE3)-pET28b-fl 〇p，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登 記入冊編號為CGMCC No. 10068。2. 構(gòu)建重組大腸桿菌的方法，包括將蛋白質(zhì)flop的編碼基因?qū)胧荏w大腸桿菌中得 到產(chǎn)所述蛋白質(zhì)flop的重組大腸桿菌； 所述蛋白質(zhì)flop為如下a)或b)的蛋白質(zhì)： a) 由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 將SEQ ID No. 1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加得到的具有蛋白質(zhì)flop活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述蛋白質(zhì)flop的編碼基因為如下1)或 2)或3)的核酸分子： 1) 其編碼序列是SEQ ID No. 2的DNA分子或cDNA分子； 2) 在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)flop的DNA分子或cDNA 分子； 3) 與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述蛋白質(zhì)flop的 DNA分子或cDNA分子。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述蛋白質(zhì)flop的編碼基因通過重 組表達載體導入所述受體大腸桿菌中。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述受體大腸桿菌為大腸桿菌 BL21 (DE3);所述重組表達載體是將所述蛋白質(zhì)flop的編碼基因插入載體pET-28b (+)的多 克隆位點得到的重組表達載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：所述重組大腸桿菌為權(quán)利要求1 所述的重組大腸桿菌。7. 由權(quán)利要求2-5中任一所述方法構(gòu)建的重組大腸桿菌。8. 權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)flop的制備方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌 或權(quán)利要求7所述的重組大腸桿菌，得到權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)flop。 9?下述1)-8)中的任一種應用： 1) 權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌在生產(chǎn)權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)flop中的應用； 2) 權(quán)利要求2-5中任一所述的方法在生產(chǎn)權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)flop中的應用； 3) 權(quán)利要求7所述重組大腸桿菌在生產(chǎn)權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)flop中的應用； 4) 權(quán)利要求1所述重組大腸桿菌在檢測磺胺藥物中的應用； 5) 權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)flop在檢測磺胺藥物中的應用； 6) 權(quán)利要求2-5中任一所述的方法在檢測磺胺藥物中的應用； 7) 權(quán)利要求7所述的重組大腸桿菌在檢測磺胺藥物中的應用； 8) 權(quán)利要求8所述的制備方法在檢測磺胺藥物中的應用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于：所述磺胺藥物為磺胺異噁唑、柳氮磺胺 吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁 啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯噠嗪、磺胺乙氧噠嗪、磺胺甲 氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺甲基嘧啶、 磺胺胍、磺胺間甲氧噠嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞 磺胺噻唑中的全部或部分任一種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了產(chǎn)能檢測磺胺藥物的蛋白質(zhì)的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法與應用。采用本發(fā)明的方法構(gòu)建篩選獲得的大腸埃希氏菌(Escherichia？coli)BL21(DE3)-pET28b-flop(即為BL21-pET28b-flop-7菌株)，具有最高的蛋白質(zhì)flop產(chǎn)率，適于作為蛋白質(zhì)flop的生產(chǎn)菌株，該菌株表達的蛋白質(zhì)flop對于磺胺二甲基嘧啶標準品的檢測限為4.82ng/mL，可以識別包括磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑等在內(nèi)的至少29種磺胺藥物。CGMCC No.1006820141127
【IPC分類】C12R1/19, G01N33/68, C12N15/70, C12P21/02, C12N1/21
【公開號】CN105018406
【申請?zhí)枴緾N201510455258
【發(fā)明人】王戰(zhàn)輝, 沈建忠, 梁曉, 張素霞, 溫凱, 江海洋, 李成龍
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月29日