μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，在37 °C，轉(zhuǎn)速為250rpm條件下振搖培養(yǎng)至培養(yǎng)體系的 OD6。。為0. 6-0. 8,取出ImL菌液，作為未誘導菌體對照（簡稱對照組）。將OD 6。。為0. 6-0. 8 的BL21-pET28b-flop菌株的菌液中加入IPTG至各菌株菌液中的IPTG終濃度為ImM，在 20°C，轉(zhuǎn)速為150rpm條件下進行搖菌培養(yǎng)，從誘導第8個小時開始（加入IPTG時記作第 〇小時），每小時取出ImL菌液，誘導時間分別為8h、9h、10h、llh、12h、13h、14h、15h、16h和 17h，將誘導8h時取出的菌液命名為I號，將誘導9h時取出的菌液命名為2號，將誘導IOh 時取出的菌液命名為3號，將誘導Ilh時取出的菌液命名為4號，將誘導12h時取出的菌液 命名為5號，將誘導13h時取出的菌液命名為6號，將誘導14h時取出的菌液命名為7號， 將誘導15h時取出的菌液命名為8號，將誘導16h時取出的菌液命名為9號，將誘導17h時 取出的菌液命名為10號。將1-10號菌液及對照組菌液分別在4°C下1000 Orpm離心5min， 收集菌體，分別得到1號菌體、2號菌體、3號菌體、4號菌體、5號菌體、6號菌體、7號菌體、 8號菌體、9號菌體、10號菌體和對照組菌體。用Tris-HCl (lOmMTris，pH7. 0)重懸菌體， 200W功率冰浴超聲（超聲10s，間隔10s)破碎菌體至懸液變澄清，在4°C，12000g條件下離 心20min，收集上清液，分別得到1號上清液、2號上清液、3號上清液、4號上清液、5號上清 液、6號上清液、7號上清液、8號上清液、9號上清液、10號上清液和對照組上清液。將培養(yǎng) 容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作菌液。
[0076] 分別將1-10號上清液和對照組上清液進行10 % SDS-PAGE電泳實驗，結(jié)果如圖2 所示，誘導8-17h的菌株均可以產(chǎn)生35KDa大小的蛋白質(zhì)，對照組菌株則沒有產(chǎn)生35KDa大 小的蛋白質(zhì)。在一定時間內(nèi)，誘導時間越長產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含量越多。
[0077] 利用表達載體pET_28b (+)帶有的組氨酸標簽（His-tag)標記通過鎳離子親和層 析純化上述10號上清液中的蛋白質(zhì)。先用10倍柱體積的binding buffer平衡His · Bind? Columns，加入4倍體積上述10號上清液，然后用5倍柱體積的Wash buffer洗脫雜蛋白， 最后用10倍柱體積的elution buffer洗脫目標蛋白，收集洗脫液，透析，得到純化后的蛋 白質(zhì)溶液。Wash buffer 中的咪唑的濃度依次為 0、25、50、100、200、300mM、400m]\^P 500mM， 將不同濃度咪唑洗脫液洗脫的蛋白質(zhì)溶液分別標記為1-8號（咪唑濃度OmM時標記為1號， 咪唑濃度25mM時標記為2號，咪唑濃度50mM時標記為3號，咪唑濃度IOOmM時標記為4號， 咪唑濃度200mM時標記為5號，咪唑濃度300mM時標記為6號，咪唑濃度400mM時標記為7 號，咪唑濃度500mM時標記為8號），將1-8號不同濃度咪唑洗脫純化后的蛋白質(zhì)溶液進行 10% SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示，當咪唑濃度為IOOmM時，目的蛋白flop洗脫量最大 且雜蛋白最少。
[0078] 二、蛋白質(zhì)flop的制備
[0079] 從固體篩選培養(yǎng)基上挑取8個重組大腸桿菌BL21-pET28b-flop的菌落，分別 標記為 BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌 株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌 株、BL21-pET28b-flop-7 菌株和 BL21-pET28b-flop-8 菌株，將 BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌 株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株、 BL21-pET28b-flop-8菌株、BL21-CK菌株和大腸桿菌BL21(DE3)(下文中簡稱為BL21菌 株）分別接種于2mL含卡那霉素（濃度為30 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C，轉(zhuǎn)速 為 250rpm 條件下振搖培養(yǎng) 8h，分別得到 BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌 株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株、BL21-pET28b-flop-8 菌 株、BL21-CK菌株和BL21菌株的種子培養(yǎng)液。分別將ImL的BL21-pET28b-f Iop-I菌 株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌 株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株、 BL21-pET28b-f lop-8菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的種子培養(yǎng)液接種于200mL含卡那霉 素（濃度為30 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C，轉(zhuǎn)速為250rpm條件下振搖培養(yǎng)至培 養(yǎng)體系的〇D_為0. 6-0. 8,分別取出上述菌株的ImL菌液，未誘導菌體的菌液。分別將OD 6。。 為 0· 6-0. 8 的 BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌 株、BL21-pET28b-flop-7 菌株、BL21-pET28b-flop-8 菌株、BL21-CK 菌株和 BL21 菌株 的菌液中加入IPTG至各菌株菌液中的IPTG終濃度為ImM，在20°C，轉(zhuǎn)速為200rpm條件 下進行搖菌培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)后分別收集所有菌株誘導培養(yǎng)后的菌液。將所有菌株誘導 培養(yǎng)后的菌液在4°C下1000 Orpm離心5min，收集菌體，分別得到BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌 株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株、 BL21-pET28b-flop-8 菌株、BL21-CK 菌株和 BL21 菌株的菌體。用 Tris-HCl (lOmMTris， PH7.0)重懸菌體，200W功率冰浴超聲（超聲10s，間隔10s)破碎菌體至懸液變澄清， 在4 °C，12000g條件下離心20min，收集上清液，分別得到BL21-pET28b-f Iop-I菌株、 BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、 BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株、 BL21-pET28b-f lop-8菌株、BL21-CK菌株和BL21菌株的上清液。將培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì) 記作菌液。
[0080] 三、蛋白質(zhì)flop的純化
[0081] 利用表達載體pET_28b (+)帶有的組氨酸標簽（His-tag)標記通過鎳離子親和層 析純化蛋白質(zhì)flop。先用10倍柱體積的binding buffer平衡His· Bind? Columns，加 入4倍體積步驟二獲得的上述菌株的上清液，然后用5倍柱體積的wash buffer洗脫雜蛋 白，Wash buffer中的咪唑的濃度為100mM，最后用10倍柱體積的elution buffer洗脫 目標蛋白，收集洗脫液，透析，分別得到BL21-pET28b-flop-l菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、 BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株、BL21-pET28b-flop-8 菌株、BL21-CK 菌株和BL21菌株純化后的蛋白質(zhì)溶液。
[0082] 四、蛋白質(zhì)flop的驗證
[0083] 1、SDS-PAGE 電泳驗證
[0084] 分別將 BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、 BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、 BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株、BL21-pET28b-flop-8 菌株、BL21-CK 菌株和BL21菌株的步驟二中的0D_為0. 6-0. 8的未誘導菌體的菌液，步驟二中的上述菌 株的上清液和步驟三中的上述菌株純化后的蛋白質(zhì)溶液進行10% SDS-PAGE電泳。結(jié)果 如圖 4 所示，BL21-pET28b-fIop-I 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、 BL21-pET28b-flop-7 菌株、BL21-pET28b-flop-8 菌株、BL21-CK 菌株和 BL21 菌株的步驟 二中的OD6。。為0. 6-0. 8的未誘導菌體的菌液中均不含有分子量為35KDa的蛋白質(zhì)條帶 (圖 4 中 A) ;BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌 株、BL21-pET28b-flop-7菌株和BL21-pET28b-flop-8菌株的步驟二中的上清液和步驟 三中的純化后的蛋白質(zhì)溶液中均含有分子量為35KDa的蛋