過PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的 DNA片段（序列如SEQIDN0:4所示）。目的條帶進(jìn)行切膠回收，將回收后的產(chǎn)物與pMD-lST 載體連接制備重組陽性質(zhì)粒。將重組的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)胞，挑取陽性菌落，提取質(zhì) 粒。質(zhì)粒作為鼠疫耶爾森氏菌標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。質(zhì)粒的260nm/280nm比值為2. 07,濃度為 52.14ng/ul,
[0044] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0045] 實(shí)施例1
[0046] 以SEQIDNO: 1所示核苷酸序列為上游引物；以SEQIDNO: 2所示核苷酸序列為 下游引物；以SEQIDN0:3所示核苷酸序列為探針。
[0047] 根據(jù)矩陣法正交驗(yàn)證，確定引物和探針的最佳濃度和用量。以鼠疫耶爾森氏菌DNA 為樣品模版，建立熒光PCR反應(yīng)體系，總反應(yīng)體系為25ul。在確定模板濃度相同的情況下， 對(duì)引物和探針分別用5,10,15, 20pM的引物濃度和5,10, 20的探針濃度，用矩陣法篩選引物 和探針的最佳濃度。結(jié)果最佳引物濃度為10pM，探針濃度為10pM。最佳體系結(jié)果為：
[0048]
[0049] 通過對(duì)鼠疫耶爾森氏菌Taq-man熒光PCR和反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化，結(jié)果分別在 65 °C、62 °C時(shí)為最佳退火溫度。
[0050] Taqian熒光PCR具體反應(yīng)條件為：
[0051]
[0052] 收集熒光信號(hào)
[0053] 利用鼠疫耶爾森氏菌驗(yàn)證后的陽性單克隆質(zhì)粒為模板，重組質(zhì)粒DNA經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè) 定，質(zhì)粒濃度為52. 14ng/ul進(jìn)行10倍梯度稀釋，根據(jù)已優(yōu)化好的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行3組 平行重復(fù)熒光PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0054] 鼠疫耶爾森氏菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2= 1，擴(kuò)增效率E= 101%，計(jì)算公式為 E=ICKl/斜率;所獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3. 278,截距為44. 332,得到回歸方程：Ct =-3. 2781gN+44. 332
[0055] 熒光定量PCR的反應(yīng)體系，模板、探針、引物的濃度和用量都會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 特別會(huì)影響到PCR擴(kuò)增效率。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明提供的反應(yīng)體系擴(kuò)增效率 為101%，結(jié)果較為良好。相關(guān)系數(shù)為1，說明誤差小，結(jié)果較為客觀準(zhǔn)確。
[0056] 實(shí)施例2
[0057] 按照實(shí)施例1的反應(yīng)體系及條件分別檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌、土拉弗郎西斯菌、Q 熱、斑點(diǎn)熱、大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、沙雷氏菌，結(jié)果如圖1。通過擴(kuò)增只有鼠 疫耶爾森氏菌出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其它未有S型曲線擴(kuò)增，陰性對(duì)照成立，表明具有良好的特異 性。研究結(jié)果顯示，所建立的檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，可對(duì)鼠疫耶爾森氏菌進(jìn)行特異性鑒定。
[0058] 實(shí)施例3
[0059] 按照實(shí)施例1的反應(yīng)體系及條件，將質(zhì)粒樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，共稀釋10個(gè)梯 度，依次為：10、10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5進(jìn)行平行驗(yàn)證，應(yīng)用優(yōu)化好的方法對(duì)每個(gè)梯度樣品 做重復(fù)性檢測(cè)。結(jié)果如表1:
[0060] 表1鼠疫耶爾森氏菌不同稀釋度重復(fù)性試驗(yàn)
[0061]
[0062] 結(jié)果顯示，重復(fù)性檢測(cè)的熒光PCR的Ct變異系數(shù)最小可達(dá)0. 81%，梯度重復(fù)性良 好，以此證明所建立的方法重復(fù)性良好且穩(wěn)定。所檢測(cè)到的Ct值近似或根據(jù)稀釋倍數(shù)呈現(xiàn) 梯度曲線。經(jīng)計(jì)算，鼠疫引物SY-I的熒光PCR能檢出的最低拷貝數(shù)為I. 66xl02C〇pieS/yL， 熒光PCR的敏感性均較高。
[0063] 實(shí)施例4
[0064] 從4個(gè)不同省份，10個(gè)市區(qū)共收集蜱4797只，10只分為一組，共475組。其中吉 林省2105只，遼寧省1195只，黑龍江省905只，內(nèi)蒙古592只；7個(gè)蜱種包括：森林革蜱，全 溝硬蜱，微小牛蜱，嗜群血蜱，草原血蜱，亞東璃眼蜱，日本血蜱。應(yīng)用本研究所建立的檢測(cè) 方法對(duì)4個(gè)省份4797只蜱進(jìn)行鼠疫耶爾森氏菌進(jìn)行檢測(cè)：
[0065] 首先：將蜱種鑒定、標(biāo)號(hào)后，用75%酒精將其浸泡消毒20min后，用吸水紙吸干，再 用PBS液，漂洗3次，用吸水紙吸干婢表面水份，放置研磨缽中，倒入液氮進(jìn)行研磨，取粉末 放入離心管中，以備用。
[0066] 將動(dòng)物組織在液氮中粉碎后，粉末組織放于I. 5rnl離心管中；
[0067] 加入180yL緩沖液ATL，然后加入20yL蛋白酶K，于56°C溫育1~3小時(shí)，每隔 20min取出輕輕旋禍，觀察直到組織完全溶解；
[0068] 取出離心管短暫離心，然后加入200yL的緩沖液AL，短暫禍旋15s，37 °C溫育 IOmin；
[0069] 短暫離心后加入200yL無水乙醇，輕輕禍旋15s，短暫離心；
[0070] 將上述樣品加入到QIAampMinispincolumn收集管中，8000rpm離心Imin，棄濾 液；
[0071 ] 加入500yL緩沖液AWl，8000rmp離心Imin，棄濾液；
[0072] 加入500yL緩沖液AW2,全速離心2min，棄濾液；
[0073] 更換柱子的收集管，全速離心Imin;
[0074] 將柱子放置到新的1.5ml離心管上，加入IOOyl緩沖液AE，室溫下放置lmin， 8000rmp，離心lmin。
[0075] 應(yīng)用實(shí)施例1所述的引物及條件體系對(duì)蜱蟲樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)，得 到的數(shù)據(jù)經(jīng)分析結(jié)果均為陰性，與預(yù)期相符。
[0076] 以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 鼠疫耶爾森氏菌巧光定量檢測(cè)引物組，其特征在于，包括如SEQIDNO: 1所示核巧酸 序列的上游引物和如SEQIDN0:2所示核巧酸序列的下游引物。2. 鼠疫耶爾森氏菌巧光定量檢測(cè)探針，其特征在于，其核巧酸序列如SEQIDN0:3所 /J、- 〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鼠疫耶爾森氏菌巧光定量檢測(cè)探針，其特征在于，3'端連接 有FAM巧光標(biāo)記基團(tuán)。4. 鼠疫耶爾森氏菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如SEQIDN0:1所示核巧酸序列 的上游引物、如SEQIDN0:2所示核巧酸序列的下游引物擴(kuò)增擴(kuò)增待測(cè)樣品DNA，W如SEQ IDNO: 3所示核巧酸序列的探針檢測(cè)，經(jīng)巧光定量PCR獲得巧光信號(hào)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述巧光定量PCR的反應(yīng)體系為：6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述real-timePCR檢測(cè)的程序?yàn)椋?〇7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述SEQ ID NO: 1所示核巧酸序列 的上游引物的濃度為lOpmol/L;所述SEQ ID N0:2所示核巧酸序列的上游引物的濃度為 1化mol/L ;所述SEQ ID N0:3所示核巧酸序列的探針的濃度為1化mol/L。8. 鼠疫耶爾森氏菌的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括：SEQIDN0:1所示核巧酸序列的 上游引物、SEQIDN0:2所示核巧酸序列的下游引物，和SEQIDN0:3所示核巧酸序列的探 針。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括dNTP、Taq酶、PCR反應(yīng)緩沖液。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括d地2〇、96孔板和光學(xué)反應(yīng)蓋 膜。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，尤其涉及鼠疫耶爾森氏菌熒光定量引物、檢測(cè)方法及試劑盒。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，以本發(fā)明提供的引物和探針對(duì)鼠疫耶爾森氏菌進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確性可達(dá)100％，對(duì)其他病毒未見非特異性的擴(kuò)增，特異性良好。通過對(duì)不同拷貝的鼠疫耶爾森氏菌標(biāo)準(zhǔn)品系時(shí)候進(jìn)行檢測(cè)，該引物和探針對(duì)鼠疫耶爾森氏菌能檢測(cè)出的最低拷貝數(shù)為1.66×102copies/μL，具有良好的靈敏性。不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品間相關(guān)系數(shù)(R2)為1，擴(kuò)增效率E＝101％，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.278，截距為44.332，回歸方程為Ct＝-3.278lgN+44.332。表明本發(fā)明提供的引物和探針具有良好的擴(kuò)增效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/04, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105002292
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510496480
【發(fā)明人】王偉利, 孟慶峰, 姚貴哲, 于欽壘, 李穎
【申請(qǐng)人】吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年8月13日