一種檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)siRNA池的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)SiRNA池的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因干擾是研宄植物基因功能的一個重要手段，干涉正常核糖核酸的積累（RNAi) 是基因干擾的一個方法。RNAi是一種強大的實驗工具，利用具有同源性的雙鏈RNA (dsRNA) 誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉寂，抑制或者阻斷基因表達(dá)。小干擾RNA(siRNA)是由dsRNA 經(jīng)過剪切形成的21-25核苷酸（nt)，是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需 的因子。使用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)dsRNA，表達(dá)的dsRNA可以由Dicer和Rde-I作用形成靶標(biāo) siRNA 池。
[0003] 檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)SiRNA池的形成對于研宄目標(biāo)基因的干擾過程具有重要 意義。目前，檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)siRNA池的方法主要有兩種：1.利用含有放射性磷32P-dCTP的DNA探針；2.檢測靶標(biāo)siRNA可以使用合成小片段反義單鏈RNA(ssRNA)(通常小 于30nt)，然后使用化學(xué)修飾的方法，在ssRNA的5'或者3'端增加地高辛（DIG)標(biāo)記。但是， 這兩種方法的實施都有較大的限制：對于方法1 :國家對使用放射性材料有嚴(yán)格的限制，而 且使用放射性探針需要復(fù)雜的實驗設(shè)備和防護措施，只有少數(shù)單位具有操作放射性材料的 資質(zhì)，導(dǎo)致該方法無法大規(guī)模推廣使用，而委托具有資質(zhì)的單位進(jìn)行檢測則價格昂貴；對于 方法2 :化學(xué)修飾的方法增加 DIG標(biāo)記價格昂貴，靶標(biāo)siRNA池中具有大量靶標(biāo)siRNA，使用 少量反義單鏈RNA作為探針容易產(chǎn)生脫靶標(biāo)效應(yīng)，若合成大量反義單鏈RNA，則由于化學(xué)修 飾增加 DIG的方法價格昂貴而很難實施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)SiRNA池的方法，利用DIG標(biāo) 記RNA探針來檢測轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)靶siRNA池，該方法具有高度特異性，且操作簡單，成本 低，大幅度減少標(biāo)靶siRNA池的檢測成本。
[0005] 本發(fā)明是基于如下理論和技術(shù)實現(xiàn)的：目的基因的dsRNA在轉(zhuǎn)基因植物中被隨機 剪切為21-25nt的靶標(biāo)siRNA，這些不同核苷酸序列的靶標(biāo)siRNA形成靶標(biāo)siRNA池。本發(fā) 明通過目標(biāo)基因擴增出的反義RNA鏈與靶標(biāo)siRNA池中的各個靶標(biāo)siRNA正義鏈均互補， 該反義RNA鏈在Northern雜交過程中可以和各個革El標(biāo)siRNA結(jié)合，具體如圖1所示，提高 了檢測特異性和靈敏度。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 一種檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)siRNA池的方法，其包括如下步驟：
[0008] (1)以目標(biāo)基因 DNA為模板制備DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈：
[0009] ①反應(yīng)體系包括：UTP、ATP、GTP、CTP，DIG-UTP、RNA聚合酶緩沖液、目標(biāo)DNA、RNA 聚合酶、去離子水，10~50°C反應(yīng)0~24小時。
[0010] ②然后，反應(yīng)體系中加入DNA酶，10~50°C反應(yīng)去除反應(yīng)體系中的目標(biāo)DNA。
[0011] ③再，加入去離子水和氯化鋰溶液，-20~0°C中沉淀RNA。
[0012] ④離心，棄上清，加去離子水溶解RNA沉淀，獲得含有多個DIG-UTP標(biāo)記的高純度 目標(biāo)反義RNA鏈。
[0013] (2)以DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈為探針檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)siRNA池：
[0014] ①將目標(biāo)基因 RNA進(jìn)行聚丙烯酰胺膠電泳，然后，將目標(biāo)基因 RNA從聚丙烯酰胺膠 中轉(zhuǎn)到硝酸纖維素濾膜上，烤干濾膜。
[0015] ②然后，將烤干后的濾膜預(yù)雜交后，加入步驟1)獲得的DIG-UTP標(biāo)記的高純度目 標(biāo)反義RNA鏈，雜交過夜。
[0016] ③再，將濾膜清洗，顯色、曝光、成像。
[0017] 優(yōu)選的，一種檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)siRNA池的方法，其包括如下步驟：
[0018] (1)以目標(biāo)基因 DNA為模板制備DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈：
[0019] ①反應(yīng)體系：50 ~200mM UTP，50 ~200mM ATP，50 ~200mM GTP，50 ~200mM CTP， 5~20mM DIG-UTP，10 X RNA聚合酶緩沖液，1~20 μ 1目標(biāo)DNA，1~10 μ I RNA聚合酶， 0~20 μ 1去離子水，25~45°C，反應(yīng)0~10小時。
[0020] ②然后，反應(yīng)體系中加入DNA酶，25~40°C反應(yīng)0~1小時，去除反應(yīng)體系中的目 標(biāo) DNA。
[0021] ③再加入去離子水和氯化鋰溶液，-20~0°C中沉淀RNA。
[0022] ④在0~25°C下，高速離心5分鐘以上，棄上清，加入去離子水溶解RNA沉淀，獲得 含有多個DIG-UTP標(biāo)記的高純度目標(biāo)反義RNA鏈。
[0023] (2)以DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈為探針檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)siRNA池：
[0024] ①將RNA進(jìn)行聚丙烯酰胺膠電泳，使用半干電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，將RNA從聚丙烯酰胺膠中轉(zhuǎn) 到硝酸纖維素濾膜上，烤干濾膜。
[0025] ②將濾膜放入雜交液中，55~65°C預(yù)雜交10分鐘以上，將濾膜取出，浸入新鮮雜 交液中，加入步驟1)獲得的DIG-UTP標(biāo)記的高純度目標(biāo)反義RNA探針，37~45°C雜交5小 時以上。
[0026] ③依次使用低嚴(yán)謹(jǐn)性和高嚴(yán)謹(jǐn)性緩沖液緩清洗濾膜，然后，將濾膜在阻斷液和抗 體混合溶液中浸泡，使用洗膜液浸洗濾膜。最后使用檢測液和顯色液浸泡濾膜，顯色后，將 濾膜放入顯色成像系統(tǒng)，曝光，拍攝并保存成像圖片。
[0027] 更優(yōu)選的，一種檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)siRNA池的方法，其包括如下步驟：
[0028] (1)以目標(biāo)基因 DNA為模板制備DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈：
[0029] ①反應(yīng)體系：L 7μ1 UTP(IOOmM)，L 7 μ I ATP(IOOmM)，L 7 μ I GTP(IOOmM)， I. 7 μ I CTP (IOOmM)，I. 0 μ I DIG-UTP (IOmM)，2· 0 μ I 10 X RNA 聚合酶緩沖液，5· 0 μ 1 目標(biāo) DNA，2. ΟμL RNA聚合酶，3. 2μ1去離子水，37°C，反應(yīng)4小時。
[0030] ②然后，反應(yīng)體系中加入ΙμL DNA酶，37 °C反應(yīng)15分鐘，去除反應(yīng)體系中的目標(biāo) DNA0
[0031] ③再加入去離子水和氯化鋰溶液，_20°C中沉淀1小時。
[0032] ④在4°C下，12000rpm離心15分鐘。棄上清，加入50μ1去離子水溶解RNA沉淀， 獲得含有多個DIG-UTP標(biāo)記的高純度目標(biāo)反義RNA鏈。
[0033] (2)以DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈為探針檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)siRNA池：
[0034] ① RNA轉(zhuǎn)移：將RNA進(jìn)行聚丙烯酰胺膠電泳，使用半干電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，將RNA從聚丙烯 酰胺膠中轉(zhuǎn)到硝酸纖維素濾膜上，烤干濾膜。
[0035] ②將濾膜放入雜交液中，58°C預(yù)雜交30分鐘，將濾膜取出，浸入新鮮雜交液中，加 入步驟1)獲得的DIG-UTP標(biāo)記的高純度目標(biāo)反義RNA探針，42°C雜交過夜。
[0036] ③依次使用低嚴(yán)謹(jǐn)性和高嚴(yán)謹(jǐn)性緩沖液緩清洗濾膜，然后，將濾膜在阻斷液和抗 體混合溶液中浸泡，使用洗膜液浸洗濾膜。最后使用檢測液和顯色液浸泡濾膜，顯色后，將 濾膜放入顯色成像系統(tǒng)，曝光，拍攝并保存成像圖片。
[0037] 本發(fā)明提供一種包含所述DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈的RNA擴增試劑盒。
[0038] 又，一種包含所述DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈的RNA擴增試劑盒在檢測轉(zhuǎn)基因植 物中靶標(biāo)siRNA池中的應(yīng)用。
[0039] 本發(fā)明中，步驟（1)制備DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈中所選反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 可保證生成含有DIG標(biāo)記的全長目標(biāo)RNA，進(jìn)而有效地結(jié)合siRNA池中的各個siRNA，而且 此條件下產(chǎn)生RNA的效率最高。
[0040] 步驟⑵中，55~65°C預(yù)雜交可以充分地去除沒有結(jié)合到濾膜上的RNA，提高雜交 的特異性，使siRNA打開雙鏈。37~45°C雜交過夜使探針與目標(biāo)siRNA充分接觸和結(jié)合， 且一旦結(jié)合，不容易分離。
[0041] 本發(fā)明有益效果：
[0042] 1.本發(fā)明利用DIG標(biāo)記核酸得到DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈及其RNA擴增試劑 盒，用于檢測轉(zhuǎn)基因植物中靶標(biāo)siRNA池，檢測過程中無放射性，在一般的生物學(xué)實驗室就 可以進(jìn)行合成，且比制作放射性探針需要的設(shè)備少，無需特殊的防護措施、成本低。
[0043] 2.與化學(xué)修飾的方法相比，DIG-UTP標(biāo)記的反義RNA鏈和RNA擴增試劑盒可以多 次使用，這種合成反義RNA鏈的方法使成本大幅降低。
[0044] 3.本發(fā)明特異性高、操作簡單。
【附圖說明】
[0045] 圖1為本發(fā)明檢測方法的原理示意圖。
[0046] 圖2為本發(fā)明實施例3中使用1 %瓊脂糖膠分析樣品中RNA總含量的溴化乙錠染 色圖。
[0047] 圖3為相對應(yīng)于圖2的Northern Blot檢測圖。
[0048] 圖4為本發(fā)明實施例5中使用15%聚丙烯酰胺膠分析樣品中小RNA總含量的溴化 乙錠染色圖。
[0049] 圖5為本發(fā)明實施例5中使用DIG-UTP反義RNA探針的Northern Blot檢測圖。
[0050] 圖6為本發(fā)明實施例6中使用放射性DNA探針的Northern Blot檢測圖。
[0051] 圖2~圖6中，泳道1為1號RNA樣品（非轉(zhuǎn)基因植物株系），泳道2-3對應(yīng)2號 RNA樣品（轉(zhuǎn)基因植物株系）、3號RNA樣品（轉(zhuǎn)基因植物株系）。
【具體實施方式】
[0052] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。<