肝癌細(xì)胞中β1蛋白功能及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及β I蛋白在肝癌細(xì)胞中功能及其應(yīng)用。具體為β I做為粘附分子在肝癌中影響細(xì)胞的侵襲和遷移，以此為靶點(diǎn)，對肝癌進(jìn)行診斷、檢測和分型等，同時(shí)設(shè)計(jì)和篩選核酸，蛋白或其他物質(zhì)作為靶向抗肝癌藥物，用于肝癌治療。
【背景技術(shù)】
[0002]電壓門控性離子通道，或稱電壓依賴性和電壓敏感性(voltage-dependent andvoltage-sensitive)離子通道，是迄今人類所了解的參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的最復(fù)雜的超家族之一，目前其成員已超過140個(gè)，并且還有新的成員不斷被發(fā)現(xiàn)。經(jīng)純化、克隆和測定表明，離子通道蛋白是由多個(gè)亞基構(gòu)成復(fù)合體。電壓門控離子通道有α、β、Y、δ等亞基構(gòu)成，但不同的離子通道的組成略有差異。
[0003]電壓門控性鈉離子通道有α亞基和β亞基組成。α亞基分子量約260 kDa，由四個(gè)同源跨膜結(jié)構(gòu)域(1-1V)構(gòu)成，而每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有六次跨膜螺旋(SfS6)，S4為電壓感受器，S5和S6之間的短肽參與構(gòu)成孔道，起到閘門的作用，參與介導(dǎo)去極化過程。一般來說，VGSC除了 α亞單位以外，還含有廣2個(gè)被稱之為β亞單位的小分子多肽。對于哺乳動(dòng)物的腦神經(jīng)細(xì)胞來說，鈉通道由一個(gè)α亞單位(Nav1.1?Navl.9)與一個(gè)或更多的輔助β亞單位(β 1、β 2、β 3及β 4 (33?36 kDa))組成的復(fù)合體所構(gòu)成。
[0004]β亞基有多種功能，它不僅能夠調(diào)節(jié)電壓門控、離子通道在質(zhì)膜上的表達(dá)，還能夠作為細(xì)胞黏附分子與細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)和其他細(xì)胞黏附分子相互作用。近年來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到β亞基作為輔助亞基對通道功能的重要性，如β亞基可以調(diào)節(jié)α亞基在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)和定位、調(diào)節(jié)心肌Na+通道晚期電流。除此之外，基于β亞基突變所導(dǎo)致的疾病也逐步被納入到基因-表型相互作用的研究中來。
[0005]β I和β 3亞基同源性較高，以非共價(jià)鍵的方式與α亞基相結(jié)合，β 2和β 4亞基同源性較高，以二硫鍵的方式與α亞基相結(jié)合。β?和β 2亞基功能已經(jīng)明確為細(xì)胞粘附分子(CAM, cell adhes1n molecules), β3和β 4亞基的功能尚不明確。
[0006]在21世紀(jì)初，有研究電壓門控鈉離子通道在不同侵襲性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中都有β 1、β 2和β 4的mRNA表達(dá)，沒有檢測到β 3，蛋白水平只有MCF-7細(xì)胞中有被稱為粘附分子的VGSC β I的表達(dá)。針對以上結(jié)果，在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染VGSC β I并成功表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的粘附性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)移性下降。同樣的利用特異性的干擾RNA，對MCF-7細(xì)胞中的β I亞基進(jìn)行干擾，8天后蛋白降低了 40%。同時(shí)細(xì)胞的粘附性降低了 25%，遷移性升高了 121%。研究表明VGSC β I亞基與乳腺癌細(xì)胞的遷移密切相關(guān)，因此在臨床上可作為乳腺癌治療的一個(gè)新靶標(biāo)。
[0007]綜上所述，電壓門控鈉離子通道β I亞基的研究也愈來愈受到人們的重視，功能輔助亞基如βI亞基已成為疾病治療的新靶點(diǎn)以及認(rèn)識(shí)疾病發(fā)病過程的新視角。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供肝癌細(xì)胞中β I蛋白功能及其應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明中β I蛋白功能為在肝癌中，作為粘附分子，影響細(xì)胞的侵襲和遷移。具體為肝癌細(xì)胞中存在β I蛋白的表達(dá)，不同肝癌細(xì)胞表達(dá)量不同，細(xì)胞侵襲和遷移能力不同。β I表達(dá)量高，細(xì)胞侵襲和遷移能力弱；β I表達(dá)量低，細(xì)胞侵襲和遷移能力強(qiáng)。
[0010]以β I為靶點(diǎn)影響β I表達(dá)的核酸和多肽等物質(zhì)，能夠影響肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。增加β I表達(dá)的核酸或蛋白等物質(zhì)，降低肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。因此可以以此為靶點(diǎn)，對肝癌進(jìn)行診斷、檢測和分型等，包括設(shè)計(jì)和篩選核酸，蛋白或其他物質(zhì)作為靶向抗肝癌藥物，用于肝癌治療。
[0011]本發(fā)明中β I蛋白應(yīng)用包括:
以β I為革巴點(diǎn)，采用PCR或Western Blotting等技術(shù),對β I蛋白mRNA或蛋白水平檢測等方法，對肝癌進(jìn)行診斷、治療和分型等。
[0012]以β I蛋白為靶點(diǎn)的化學(xué)合成、天然、生物技術(shù)方法制造的小分子、多肽、抗體、核酸類靶向肝癌治療藥物及其應(yīng)用。
[0013]以β I蛋白為靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)和篩選靶向肝癌治療藥物(化學(xué)合成，生物化學(xué)合成、天然、生物技術(shù)方法制造的小分子、多肽、抗體、核酸類)。
【附圖說明】
[0014]圖1:肝癌細(xì)胞株H印G2和Hep3B及肝細(xì)胞株中β I的RNA的表達(dá)(Α)，蛋白水平表達(dá)(B)，細(xì)胞遷移能力檢測(C)
圖2:干擾后HepG2細(xì)胞中β? mRNA及蛋白表達(dá)檢測。(A)干擾如后HepG2細(xì)胞中β?mRNA表達(dá)水平，(B)干擾前后IfepG2細(xì)胞中β I蛋白表達(dá)水平
圖3:干擾后!fepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測。(A)干擾前后!fepG2細(xì)胞遷移能力比較，(B)干擾前后!fepG2細(xì)胞侵襲能力比較
圖4:Hep3B細(xì)胞轉(zhuǎn)染β I后，β I蛋白表達(dá)水平的檢測。泳道I為轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-hSCNIB，泳道2為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.0，泳道3為未轉(zhuǎn)染，以GAPDH為內(nèi)參。
[0015]圖5:轉(zhuǎn)染β I基因后!fep3B細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測。(A)轉(zhuǎn)染前后Ifep3B細(xì)胞遷移能力比較，(B)轉(zhuǎn)染前后Hep3B細(xì)胞侵襲能力比較
圖6:鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽作用于肝細(xì)胞H印G2后，β I表達(dá)水平檢測。
[0016]圖7:鎮(zhèn)痛抗腫瘤纈精甘肽細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測。(A) AGAP作用前后!fepG2細(xì)胞遷移能力比較，(B) AGAP作用前后!fepG2細(xì)胞侵襲能力比較。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明特批權(quán)利要求的范圍。
[0018]如下為實(shí)施例中所涉及的序列: βI特異性引物序列如下:
F:5’-CGTCTACCGCCTGCTCTTCT-3’
R: 5’-GGTATTCCGAGGCATTCTCCT-3’
VGSC β I干擾RNA序列:SCNlB-homo-319 5’-GCACUGAGGAGUUUGUCAATT-3’
5，-UUGACAAACUCCUCAGUGCTT-3，
SCNlB-homo-607 5’-CUGAGAUCAUGAUGUAUGUTT-3，
5，-ACAUACAUCAUGAUCUCAGTT-3，
隨機(jī)序列(Negative Control):
Se