枇杷EJPFPb及其編碼基因改善煙草糖水平的方法
【專利摘要】一種枇杷EJPFPb及其編碼基因改善煙草糖水平的方法，按如下五個(gè)步驟進(jìn)行：一是分離克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA片段序列，二是分離克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA全長(zhǎng)序列，三是枇杷EJPFPb基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建，四是煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，五是轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)速度和糖分組成水平的試驗(yàn)與測(cè)定。采用本方法獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株生長(zhǎng)快，葉片中蔗糖含量明顯下降，葡萄糖含量基本不變，果糖含量提高3%-10%，實(shí)現(xiàn)了利用EJPFPb基因調(diào)控糖組成及糖水平，改善煙草風(fēng)味品質(zhì)的目的，而且利用這種新獲得的枇杷EJPFPb基因，拓寬至用于轉(zhuǎn)接至其它蔬菜、果樹和糧食作物，具有有望改善受體作物品質(zhì)風(fēng)味的前景。
【專利說(shuō)明】枇杷EJPFPb及其編碼基因改善煙草糖水平的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種枇杷(iZrioAoirja japonicaLindl.) EJPFPb及其編碼基因改善煙草(Ai'coiiaaa tabacum)糖水平的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖酵解是調(diào)控植物糖代謝的最重要途徑。糖酵解途徑有三個(gè)限速位點(diǎn)，這三個(gè)位點(diǎn)分別是由己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶這三種酶作用。這三種酶催化的反應(yīng)都是不可逆反應(yīng)，因此這三種酶是糖酵解的限速酶。其中，磷酸果糖激酶是一類激酶，可作用于果糖-6-磷酸，反應(yīng)產(chǎn)物為果糖-1，6- 二磷酸或果糖_2，6- 二磷酸。植物中的磷酸果糖激酶分為兩種，一種是依賴ATP的ATP:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(ATP:Fru-6-P1-phosphotransferase, EC 2.7.1.11),簡(jiǎn)稱為ATP-PFK ;另一種是依賴焦磷酸的焦磷酸:果糖 _6_ 憐酸 1-憐酸轉(zhuǎn)移酶(pyrophosphate: Fru-6-P 1- phosphotransferase, EC2.7.1.90)，簡(jiǎn)稱為PFP。PFP通常由α和β兩個(gè)亞基組成，這兩個(gè)亞基由不同的基因編碼，α亞基具有調(diào)節(jié)活性功能，而β亞基具有催化活性。研究表明，通過(guò)調(diào)控PFP基因的表達(dá)，可以調(diào)節(jié)植株組織中的糖水平，例如，在甘蔗中下調(diào)PFP基因表達(dá)使蔗糖水平提高，果糖水平下降(Groenewald et al.Transgenic research, 2008,17:85 -92 ；van der Merweet al.Planta，2010，231:595-608)。糖是水果風(fēng)味的重要組成物質(zhì)，其中果糖對(duì)風(fēng)味構(gòu)成起更為關(guān)鍵的作用，因此，如能通過(guò)PFP基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)糖組成及糖水平的調(diào)控，可為水果風(fēng)味的改善提供技術(shù)依據(jù)；糖類與煙草的品質(zhì)關(guān)系密切，是影響煙草吸味的最重要化學(xué)組分之一，對(duì)煙氣的酸堿平衡和焦油含量有直接影響，無(wú)疑，利用PFP實(shí)現(xiàn)煙草糖分的調(diào)控，對(duì)改善煙草品質(zhì)是有益的、可行的，但至今未見(jiàn)相關(guān)的資料報(bào)道和新植株問(wèn)世。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種枇杷EJPFPb及其編碼基因改善煙草糖水平的方法。
[0004]解決上述技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案:
本枇杷EJPFPb及其編碼基因改善煙草糖水平的方法按如下步驟進(jìn)行:
(1）分離克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA片段序列:提取枇杷葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,通過(guò)與GenBank已知的植物焦磷酸:果糖_6_磷酸1_磷酸轉(zhuǎn)移酶pyrophosphate:Fru-6-P 1- phosphotransferase β亞基序列進(jìn)行比對(duì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，回收產(chǎn)物克隆到PMD18-T載體中并測(cè)序，利用分子生物學(xué)工具分析測(cè)序結(jié)果，與其他植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基基因比對(duì)，確定為枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基基因EJPFPb的保守區(qū)片段；
(2)分離克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA全長(zhǎng)序列:根據(jù)上述枇杷焦磷酸:果糖_6_磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基基因cDNA片段序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲得基因的全長(zhǎng)cDNA序列，與其他植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基基因比對(duì)，通過(guò)分析基因編碼區(qū)及焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基特有的功能域確定分離到枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基全長(zhǎng)cDNA序列，并命名為EJPFPb，EJPFPb基因編碼區(qū)核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示，編碼氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2 所示；
(3)枇杷EJPFPb基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)上述基因EJPFPb的完整編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用無(wú)縫克隆技術(shù)將擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA-1302進(jìn)行連接，將EJPFPb正向插入pCAMBIA-1302，獲得植物過(guò)量表達(dá)重組雙元表達(dá)載體，命名為 pCAMBIA-1302-EJPFPb ；
(4)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化:將上述表達(dá)載體pCAMBIA-1302-EJPFPb利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，獲得具有特異抗生素抗性的轉(zhuǎn)基因植株，提取轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA，利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，確定成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，單株收種子，對(duì)其后代進(jìn)行觀察鑒定；
(5)轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)速度和糖分組成水平的試驗(yàn)與測(cè)定:將轉(zhuǎn)基因煙草種子進(jìn)行播種，轉(zhuǎn)基因煙草與未轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行生長(zhǎng)速度的對(duì)比試驗(yàn)，生長(zhǎng)速度明顯加快；定期采集葉片進(jìn)行糖含量的高效液相色譜分析，轉(zhuǎn)基因煙草葉片的蔗糖水平顯著降低，而果糖水平顯著提高，說(shuō)明EJPFPb基因既加快煙草生長(zhǎng)速度，又能提高葉片的果糖水平，煙草品質(zhì)明顯改
[0005]本發(fā)明的有益效果是，從枇杷中分離克隆到EJPFPb基因全長(zhǎng)cDNA序列，將該基因的編碼區(qū)以正向方式插入到植物雙元表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入煙草中，與未轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)加快，葉片中蔗糖含量明顯下降，而果糖含量提高3%-10%，因此，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了利用EJPFPb基因調(diào)控糖組成及糖水平，對(duì)改善煙草的風(fēng)味品質(zhì)具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0006]圖1為本申請(qǐng)所用植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA-1302-EJPFPb構(gòu)建示意圖。
[0007]圖2為轉(zhuǎn)基因煙草不同時(shí)期的生長(zhǎng)形態(tài)圖。
[0008]圖3為轉(zhuǎn)基因煙草葉片的PCR檢測(cè)電泳圖。
[0009]圖4為轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照煙草葉片糖含量對(duì)比圖 圖5為煙草葉片糖含量測(cè)定的HPLC峰形圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]本發(fā)明下面結(jié)合實(shí)施例并參照附圖作進(jìn)一步詳述。下述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用的試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為購(gòu)自生化試劑公司的常規(guī)試劑。所述的對(duì)照煙草或野生型煙草均系未轉(zhuǎn)基因煙草。
[0011](I)分離克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA片段序列
采用改良CTAB法提取枇杷葉片總RNA，具體步驟如下:提前預(yù)熱RNA提取液500μ1 (2%CTAB, 2% PVP, IOOmM Tris, 25mM EDTA, 2M Nacl, ρΗ8.0)于 65°C水浴鍋中；將 0.2g 枇杷葉片加入液氮中研磨成粉末，迅速將粉末轉(zhuǎn)入預(yù)熱好的提取液中，然后快速加入40μ1的巰基乙醇和少量亞精胺渦旋混勻；在65°C水浴鍋中培養(yǎng)15min ;加入等體積氯仿/異戊醇(24:1),潤(rùn)旋混勻，1000Orpm,4°C, 20min ;取上清,加入等體積的氯仿異戍醇，潤(rùn)旋混勻，1000Orpm, 4°C，20min ;取上清，加入1/4體積的IOM Licl,倒轉(zhuǎn)混勻，放于4°C冰箱過(guò)夜(8-16 小時(shí))；1000Orpm, 4°C，35min,棄上清，加入 500μ1 的 SSTE (1.45g NaCl,0.125gSDS, 50μ1 0.5Μ EDTA(pH 8.0) ,0.25mlIM Tris (pH8.0)，定容至 25ml)和 2 倍體積的100%的乙醇，-70°C放置30min，取出，12000rpm，4°C，20min ;棄上清，加入Iml 75%的乙醇，12000rpm, 4°C, IOmin ;棄上清，常溫干燥；加入30μ1 DEPC水溶解，進(jìn)行電泳及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)；
利用反轉(zhuǎn)錄酶將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，具體步驟如下:在DEPC處理過(guò)的1.5mL離心管中加入約IKg總RNA和?μ? 0.5Kg/Kl的Oligo (dT) 18 primer,小心混勻，70°C保溫5 min,立即置于冰上；按次序分別加入下列試劑:5μ1 5 XM-MLV RT Buffer, 2μ1dNTP mix (2.5mM), IM-1 RNase 抑制劑(30U/ML),1M<1 M-MLV Reverse Transcriptase,然后加DEPC水到25μ1 ;小心混勻，室溫離心5秒，將所有溶液收集到管底，37°C保溫I小時(shí)；90°C5 min，冰上冷卻，_20°C保存?zhèn)溆茫?br> 通過(guò)與GenBank已知的植物果糖_6_磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基基因序列進(jìn)行比對(duì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，具體步驟如下:在NCBI查找并下載植物果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基序列，將所下載序列保存為fasta格式，利用Clustalx進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)序列相似性判斷植物果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基基因的保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，弓丨物序列如下:上游引物:5’ -TATGCAGAAATGATTGG(A/G)AATGT-3’ ;下游引物 5’ -ACATT (G/C/T) CC (G/A) TGTGGATCTCT-3 ’。以上述cDNA為模板，通過(guò)此對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段并測(cè)序，獲得枇杷果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基EJPFPb基因保守區(qū)片段；
(2)分離克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA全長(zhǎng)序列
根據(jù)上述測(cè)序信息設(shè)計(jì)引物用于cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)，用于5’ RACE擴(kuò)增的引物為:5，-CATTCACGATGTGGTCAGTGACAT-3，(SEQ ID No:3)和 5，-TAATGTGTGAAGCTGCACGTCC-3，(SEQ ID No:4);用于 3’RACE 擴(kuò)增的引物為:5’ - GCGTGCTGACCTTGGTTATAACTATGG-3’(SEQID(SEQ ID No:6);參考 5’-Full RACE Kit
和3’-Full RACE Kit (TaKaRa)進(jìn)行RACE擴(kuò)增，通過(guò)RACE技術(shù)獲得基因未知區(qū)域的序列，進(jìn)行序列拼接獲得基因的全長(zhǎng)序列，將該基因命名為EJPFPb，該基因的編碼區(qū)核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；按照拼接序列的兩端設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到該基因的完整序列，并克隆到PMD18-T載體，獲得pMD18-T-EJPFPb。
[0012](3)枇杷EJPFPb基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)(2 )中獲得的枇杷EJPFPb基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，上游引物為EJPFPb-F: 5 ’ -CGGGGGACTCTTGACATGGCTGCACCATCACTGGTTGC-3，(SEQ ID No: 7 ):下游引物為 E TPFPb-R: 5，-ACTAGTCAGATCTACCATGGAAACAGAAACTCCGAGTTCCAAGAGTAGCG -3’ (SEQ ID No:8).下劃線區(qū)域的序列為附加序列，用于和表達(dá)載體的無(wú)縫克隆。以步驟(2)的載體pMD18-T-EJPFPb質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增編碼區(qū)序列，PCR體系如下:
10 X AccuPrime pfx Reaction mix 5M-1
10 X enhancer 5M-1
EJPFPb-F (10μΜ) ?μ?
EJPFPb-R (10μΜ) ?μ?
pMD18-T-EJPFPb 質(zhì)粒 DNA (20ng/^L) ?μ?AccuPrime pfx polymerase (2.5U /M-L) 0.5M-1
PCR water 36.5M-1
擴(kuò)增條件為:94 °C 3min lcycle ；94 °C 30sec, 58 °C 30sec,68 °C 2min IOsec,28cycles ；68 °C IOmin lcycle ；4 °C forever lcycle。PCR 反應(yīng)結(jié)束后按照 TaKaRaAgarose Gel DNA Extraction Kit 回收目的片段。
[0013]用AfcoI單酶切pCAMBIA-1302載體，酶切體系如下: pCAMBIA-1302 載體質(zhì)粒(200ng/^l) 5μ1
NcoI ?μ?
lOXFastDigest? Green Buffer 5M-1
ddH20 39μ1
37度酶切2小時(shí)后電泳切膠回收；
將目的片段和載體進(jìn)行無(wú)縫克隆和重組(GENEART? Seamless Cloning and AssemblyKit, Invitrogen),反應(yīng)體系如下:
5 X Reaction buffer 4M-1
DNA 片段(lOOng/μΙ) 2μ1
pCAMBIA-1302 vector (NcoI) (50ηδ/μ1) 2μ1
ddH20 ΙΟμΙ
10 X Enzyme Mix 2M-1
25°C連接30min后置于冰上，取8μ1反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α。測(cè)序驗(yàn)證重組克隆插入片段的序列信息，含有目的基因序列的正確質(zhì)粒命名為pCAMBIA-1302-EJPFPb(雙元表達(dá)載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。
[0014](4)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
將上述構(gòu)建的植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA-1302-EJPFPb轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株LBA4404，28°C培養(yǎng)，挑取攜帶植物表達(dá)載體pCAMBIA-1302-EJPFPb質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種在3-5ml含50mg/L rif和50mg/L Kan的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)OD6tltl為0.6-0.8 ;活化過(guò)夜的農(nóng)桿菌按1:100-1:50的比例接種在相同的20_50mlYEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；取煙草無(wú)菌葉片，切成4-6mm的葉盤到無(wú)菌瓶中,加入農(nóng)桿菌菌液,感染IOmin,期間輕微振蕩,取出外植體用無(wú)菌濾紙吸去附著的菌液；將浸染過(guò)的外植體接種在分化培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2d-4d ;將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，25°C，光照培養(yǎng)。每隔3-4周繼代一次，待轉(zhuǎn)化后的外植體長(zhǎng)出大量叢生芽即轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)篩選的抗性芽長(zhǎng)1-1.5cm時(shí)，從基部將芽切下，并轉(zhuǎn)入含有適宜抗生素的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，獲得具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因植株；待植株長(zhǎng)到一定高度時(shí)移出組培瓶，在含有蛭石、珍珠巖等的基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)；選擇抗性植株，單株收種子，對(duì)其后代進(jìn)行觀察鑒定(轉(zhuǎn)基因煙草不同時(shí)期的生長(zhǎng)形態(tài)圖見(jiàn)圖2)。
[0015]對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，主要步驟如下:取0.2 g幼嫩葉片，加入研缽中，加入 2% CTAB 提取液(2% CTAB, 1.4M NaCl, IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, pH8.0, 2%β -巰基乙醇)700μ1研磨，研磨好后轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，65°C保溫20min ;冷卻后加入等體積氯仿:異戊醇(24:1)混勻，1000Orpm lOmin，取上清液至一新離心管，加入100μ15Μ NaCl和Iml乙醇，沉淀DNA，離心去上清，70%乙醇洗沉淀，干燥后溶解于100μ1 TE中。以35S CaMV序列設(shè)計(jì)引物，上游引物為5’ -GAACTCGCCGTAAAGACTGG-3’，下游引物為5’-CCCCGTGTTCTCTCCAAAT-3’，以上述提取到的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)到有條帶(500bp)的即為陽(yáng)性植株，即轉(zhuǎn)基因植株(轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)電泳圖見(jiàn)圖3)。轉(zhuǎn)基因植株單株收種子，播種。
[0016](5)轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)速度和糖分組成水平的試驗(yàn)與測(cè)定
將轉(zhuǎn)基因煙草種子進(jìn)行播種，轉(zhuǎn)基因煙草與未轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行生長(zhǎng)速度的對(duì)比試驗(yàn)，定期測(cè)定植株高度，與未轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)速度明顯加快；定期采集葉片進(jìn)行糖含量的高效液相色譜分析，步驟如下:
糖的提取及測(cè)定:提取液為乙醇:氯仿:水(E:C:W) = 12:5:3。取上述(4)獲得的轉(zhuǎn)基因植株葉片Ig剪碎研磨3-5 min,加入5倍體積(w/v)的提取液,5000g離心5 min.取上清液，重復(fù)3次。合并提取液，轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入水和氯仿使E:C:W = 10:6:5，分層，去掉氯仿相。用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0,40°C減壓真空蒸干,超純水定容，WatersSep-Pak-C18固相萃小柱預(yù)分離，過(guò)濾滅菌。糖含量測(cè)定用Waters高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)行。色譜條件為:柱溫為90°C，流動(dòng)相為超純水，流速0.5ml/min。蔗糖、葡萄糖和果糖通過(guò)出峰時(shí)間及峰面積與標(biāo)樣比較來(lái)定性和定量。轉(zhuǎn)基因煙草葉片的蔗糖水平顯著降低，而果糖水平顯著提高，說(shuō)明EJPFPb基因既加快煙草生長(zhǎng)速度，又能提高葉片的果糖水平，煙草品質(zhì)明顯改善。(轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照煙草葉片糖含量對(duì)比圖見(jiàn)圖4，樣品HPLC峰形圖見(jiàn)圖5)
下面，將與本申請(qǐng)有關(guān)的試驗(yàn)情況介紹如下:
尚需說(shuō)明的是圖1表示本申 請(qǐng)所用植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA-1302-EJPFPb構(gòu)建示意圖，其中所標(biāo)記的(I)表示潮霉素抗性標(biāo)記基因，(2)表示35S CaMV啟動(dòng)子，(3)表示EJPFPb，(4)表示綠色熒光蛋白，(5)表示NOS終止子，(6)表示NocI酶切插入位點(diǎn)。EJPFPb位于35S CaMV下游，GFP綠色熒光蛋白上游。
[0017]圖2為轉(zhuǎn)基因煙草不同時(shí)期的生長(zhǎng)形態(tài)圖，其中所標(biāo)記的(I)為侵染后的愈傷誘導(dǎo)后煙草生長(zhǎng)形態(tài)圖，(2)為生根誘導(dǎo)后煙草生長(zhǎng)形態(tài)圖，(3)為轉(zhuǎn)基因煙草移栽入土壤后的煙草生長(zhǎng)形態(tài)圖。
[0018]圖3為轉(zhuǎn)基因煙草葉片的PCR檢測(cè)電泳圖，從左側(cè)起第一泳道為DL2000 MARKER、轉(zhuǎn)基因植株1、2、3、野生型植株、陰性對(duì)照(不含模板、只加擴(kuò)增引物)、陽(yáng)性對(duì)照(含有EJPFPb的質(zhì)粒DNA)。圖3顯示出，陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株均可擴(kuò)增出500bp條帶，而陰性對(duì)照和未轉(zhuǎn)基因植株均未擴(kuò)增出這一條帶，說(shuō)明EJPFPb基因在轉(zhuǎn)基因植株1、2、3中成功表達(dá)，而在未轉(zhuǎn)基因植株中不表達(dá)。
[0019]圖4為轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照煙草葉片糖含量對(duì)比圖，縱坐標(biāo)表示糖含量(單位mg/g.Fff),葡表示葡萄糖,果表示果糖,鹿表示鹿糖,橫坐標(biāo)從左側(cè)起分別表示野生型煙草、轉(zhuǎn)基因煙草1、2、3。每一橫坐標(biāo)對(duì)應(yīng)3種糖含量，從左向右分別為:葡萄糖、果糖、蔗糖。圖4顯示出轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的蔗糖含量均低于野生型煙草，果糖含量均高于野生型煙草，說(shuō)明EJPFPb基因可以提高煙草葉片的果糖水平。
[0020]圖5為煙草葉片糖含量測(cè)定的HPLC峰形圖，從左側(cè)起分別為蔗糖、葡萄糖、果糖，說(shuō)明HPLC檢測(cè)煙草葉片的蔗糖、葡萄糖、果糖水平方法可行。
【權(quán)利要求】
1.一種枇杷EJPFPb及其編碼基因改善煙草糖水平的方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行: (O分離克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA片段序列:提取枇杷葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過(guò)與GenBank已知的植物焦磷酸:果糖_6_磷酸1_磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基序列進(jìn)行比對(duì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，回收產(chǎn)物克隆到PMD18-T載體中并測(cè)序，利用分子生物學(xué)工具分析測(cè)序結(jié)果，與其他植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基基因比對(duì)，確定為枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基基因EJPFPb的保守區(qū)片段； (2)分離克隆枇杷EJPFPb基因的cDNA全長(zhǎng)序列:根據(jù)上述枇杷焦磷酸:果糖_6_磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基基因cDNA片段序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲得基因的全長(zhǎng)cDNA序列，與其他植物焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基基因比對(duì)，通過(guò)分析基因編碼區(qū)及焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基特有的功能域確定分離到枇杷焦磷酸:果糖-6-磷酸1-磷酸轉(zhuǎn)移酶β亞基全長(zhǎng)cDNA序列，并命名為EJPFPb，EJPFPb基因編碼區(qū)核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示，編碼氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2 所示； (3)枇杷EJPFPb基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)上述基因EJPFPb的完整編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用無(wú)縫克隆技術(shù)將擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA-1302進(jìn)行連接，將EJPFPb正向插入pCAMBIA_1302，獲得植物過(guò)量表達(dá)重組雙元表達(dá)載體，命名為 pCAMBIA-1302-EJPFPb ； (4)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化:將上述表達(dá)載體pCAMBIA-1302-EJPFPb利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，獲得具有特異抗生素抗性的轉(zhuǎn)基因植株，提取轉(zhuǎn)基因植株葉片DNA，利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，確定成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，單株收種子，對(duì)其后代進(jìn)行觀察鑒定； (5)轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)速度和糖分組成水平的試驗(yàn)與測(cè)定:將轉(zhuǎn)基因煙草種子進(jìn)行播種，轉(zhuǎn)基因煙草與未轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行生長(zhǎng)速度的對(duì)比試驗(yàn)，生長(zhǎng)速度明顯加快；定期采集葉片進(jìn)行糖含量的高效液相色譜分析，轉(zhuǎn)基因煙草葉片的蔗糖水平顯著降低，而果糖水平顯著提高，說(shuō)明EJPFPb基因既加快煙草生長(zhǎng)速度，又能提高葉片的果糖水平，煙草品質(zhì)明顯改盡口 ο
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103789345SQ201410050704
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】秦巧平, 崔永一, 林飛凡 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)