試劑盒及確定待測dna樣本預定snp位點的基因型的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及試劑盒及確定待測DNA樣本預定SNP位點的基因型的方法。
【背景技術】
[0002] 華發(fā)林(Warfarin，也稱為"華法林")是臨床上最常用的香豆素類口服型強抗凝藥 物，廣泛用于心臟瓣膜置換、房顫、肺栓塞、再次腦卒中（中風）等深度動靜脈血栓性疾病的 預防和治療。該藥物的化學結構為3-(a-苯基丙酮）-4-羥基香豆素，為兩種光學同分異構 體R型和S型的消旋體（racemic)混合物，其中S異構體的抗凝作用比R異構體更強3~5 倍。華法林使用劑量在不同種族間及個體間存在較大差異，甚至可相差10到20倍。影響 華法林劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等。華 法林國際藥理學聯盟在新英格蘭發(fā)表的研究顯示，加入藥物基因組學的預測模型(包括基 因型）比臨床預測模型(不包括基因型）準確性提高了 80%。所以個體的遺傳特征對于華法 林的劑量影響很大。
[0003] 目前研究發(fā)現與華法林藥效學和藥動學相關的基因達30多種，起主要作用的有2 種，VKORCl為其中之一。美國FDA在華法林用藥說明書里介紹了 VKORCl基因對劑量的影 響并建議在用藥之前做基因檢測。VKORCl基因編碼的蛋白質為組成維生素 K環(huán)氧化物還原 酶復合體亞單位之一，主導維生素 K依賴性凝血因子的生成，是華法林的作用靶點。VKORCl 基因啟動子區(qū)-1639G > A多態(tài)性位點（rs9923231)與華法林臨床用藥劑量相關。與AA基 因型啟動子相比，GG和AG基因型啟動子活性高，凝血因子生成較多，患者臨床表現出華法 林抵抗。在亞洲人群中研究結果顯示，VKORCl的基因多態(tài)對華法林劑量差異的影響達到了 16-30%。因而，華法林用藥之前，需藥個體的VKORCl基因的rs9923231位點的基因型檢測 和分型，意義重大。
[0004] 然而，現階段VKORCl基因的rs9923231位點的檢測和基因型分型的方法仍有待改 進。

【發(fā)明內容】

[0005] 需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現而完成的：
[0006] 目前檢測SNP位點的最簡單的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通過應用特異性限 制性內切酶消化PCR擴增產物，并根據消化位點是否消失來判斷其變異存在與否。但該方 法操作復雜，樣本量多時易造成PCR產物的交叉污染且容易出現酶切不充分或酶切過度而 出現假陰性或假陽性結果，可靠性低。多重PCR方法盡管特異性有所提高，但是仍然是基于 普通PCR的原理，引物特異性以及低保真Taq酶等這些因素均可造成對結果的影響。DNA測 序法雖然是目前進行基因診斷的金標準，但步驟繁瑣，過程復雜，試劑價格昂貴，容易出現 樣本間的交叉污染而導致測序失??；另外測序儀的裝備也超出了一般臨床檢驗實驗室的承 受范圍。高分辨率熔解曲線法是一種快速，簡便，經濟，實用的分型方法，但基因分型依賴于 儀器溫度控制的精密性，假陽性高。Taqman探針雜交法采用特異性的熒光標記的探針，特 異性強，靈敏度高且操作方便，快速。該方法同樣被認為是SNP分型的金標準，在臨床應用 的前景值得期待。Taqman探針雜交法的原理為：在TaqMan探針法的PCR反應體系中，包括 一對PCR引物和一條探針，探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間，探針 的5'端標記有報告基因，如FAM、VIC，3'端標記有熒光淬滅基團，如MGB TAMRA ;當探針完 整的時候，報告基因所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號；隨著PCR的進 行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3' -5'外切核酸酶活性就會將探針切 斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號。由此，應用一對雙熒光標 記的Taqman探針，分別針對雙等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針才能夠擴增出 各自的基因型；用兩種熒光信號能夠被顯著區(qū)分的熒光染料分別標記這兩種探針，就可以 在一次PCR反應中完成對單個SNP位點的基因型判定。因而，利用該方法進行SNP基因型 分型時，引物和探針的設計至關重要，引物長度、探針長度、引物特異性和探針特異性均會 顯著影響檢測結果的特異性和敏感性。
[0007] 本發(fā)明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的 在于提出一種能夠有效用于VKORCl基因的rs9923231位點檢測的試劑盒，以及確定待測 DNA樣本的VKORCl基因的rs9923231位點的基因型的方法。
[0008] 根據本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。根據本發(fā)明的實施例，該試劑 盒包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；第二核酸 分子，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；第一探針，所述第一探針具 有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列；以及第二探針，所述第二探針具有SEQ ID NO :4所示的 核苷酸序列，其中，所述探針的5'端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團，所述 第一探針與所述第二探針的熒光報告基團不同。
[0009] 根據本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的試劑盒能夠用于VKORCl基因的rs9923231位點的 檢測。具體地，根據Taqman探針雜交法，利用該試劑盒中的試劑，將待測DNA樣本進行熒光 定量PCR后，基于熒光定量PCR結果即可容易地確定VKORCl基因的rs9923231位點的基因 型。進而，可以將VKORCl基因的rs9923231位點的基因型信息，與其他臨床信息結合分析， 用于指導待測DNA樣本來源的個體的華法林用藥。
[0010] 根據本發(fā)明的實施例，所述熒光報告基團為FAM或VIC，所述淬滅基團為MGB。
[0011] 根據本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了一種確定待測DNA樣本預定SNP位點 的基因型的方法，所述預定SNP位點為VKORCl基因的rs9923231位點。根據本發(fā)明的實施 例，該方法包括：根據Taqman探針雜交法，利用前面所述的試劑盒，將所述待測DNA樣本進 行熒光定量PCR ;以及對熒光定量PCR結果進行分析，以便確定待測樣本預定SNP位點的基 因型。
[0012] 根據本發(fā)明的實施例，利用本發(fā)明的方法能夠有效地確定待測DNA樣本VKORCl基 因的rs9923231位點的基因型。此外，發(fā)明人驚奇地發(fā)現，該方法成本低、特異性強、靈敏度 高、準確度高、可重復性好，且在一次PCR反應中即可完成對單個SNP位點的基因型判定，操 作方便、快速。
[0013] 另外，根據本發(fā)明上述實施例的確定待測DNA樣本預定SNP位點的基因型的方法 還可以具有如下附加的技術特征：
[0014] 根據本發(fā)明的實施例，利用ABI Stepone熒光定量PCR儀進行所述熒光定量PCR。 由此，熒光定量PCR結果準確，有利于后續(xù)的分析，進而有利于預定SNP位點基因型的確定。
[0015] 根據本發(fā)明的實施例，所述突光定量PCR的反應體系為：5重量份的Taqman Genotyping Master Mix ;3. 5重量份的超純水；0. 5重量份的組合物；以及1重量份的待測 DNA樣本，其中，所述組合物由所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探針和第二探針組 成。由此，熒光定量PCR效果好，結果準確，有利于后續(xù)的分析，進而有利于預定SNP位點基 因型的確定。
[0016] 根據本發(fā)明的實施例，所述待測DNA樣本的濃度為20ng/μ 1。由此，熒光定量PCR 效果好，結果準確，有利于后續(xù)預定SNP位點基因型的確定。
[0017] 根據本發(fā)明的實施例，所述待測DNA樣本來源于人唾液或外周血。
[0018] 根據本發(fā)明的實施例，所述組合物中每種核酸分子的濃度均為18 μ mol/L，每種探 針的濃度均為5 μ mol/L。由此，熒光定量PCR效果好，結果準確，有利于預定SNP位點基因 型的確定。
[0019] 根據本發(fā)明的實施例，所述熒光定量PCR的反應程序為：第一步：60°C下保持30 秒；第二步：95°C下保持1