生物質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑的多級(jí)質(zhì)譜鑒定方法，其主要的技術(shù)要點(diǎn)是高純度富集大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)，結(jié)合基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，建立轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑的肽指紋圖譜，通過指紋圖譜的比較為鑒定抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆提供一種新的方法。
【專利說(shuō)明】
生物質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑的分離富集及多級(jí)質(zhì)譜鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆商品化以來(lái)，已經(jīng)建立了不少的檢測(cè)方法，以檢測(cè)核酸為目標(biāo)的各種PCR檢測(cè)技術(shù)以及PCR快速檢測(cè)試劑盒；以檢測(cè)外源蛋白為目標(biāo)的ELISA檢測(cè)技術(shù)以及酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試紙條、試劑盒，這些檢測(cè)方法都可以為鑒定轉(zhuǎn)基因作物以及為轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。但是自中國(guó)2009年批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)安全證書的釋放，成為第一個(gè)批準(zhǔn)主糧商業(yè)化種植的國(guó)家后，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)、特別是轉(zhuǎn)基因作物在食品安全性評(píng)價(jià)方面提出更高的要求。
[0003]抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆是最早開始商業(yè)化種植的的轉(zhuǎn)基因作物，隨著轉(zhuǎn)基因大豆在我國(guó)飼料、食用油原料中使用量的不斷增加，轉(zhuǎn)基因大豆帶來(lái)的食品安全問題成為廣大消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)。生物信息是按DNA — mRNA —蛋白質(zhì)一代謝產(chǎn)物方向流動(dòng)的，蛋白質(zhì)和各類代謝物是最終與人類食用直接關(guān)聯(lián)的物質(zhì)形態(tài)，因此，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物蛋白組、代謝物的分離鑒定，檢測(cè)分析可以為食品安全相關(guān)預(yù)警信號(hào)提供一個(gè)預(yù)知平臺(tái)，也可以為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在安全性評(píng)價(jià)方面提供一種新的技術(shù)。
[0004]代謝物檢測(cè)通常有兩種方法，一種方法稱作代謝物指紋分析(Metabolomicfingerprinting)，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)的方法，比較不同樣品中各自的代謝產(chǎn)物以確定其中所有的代謝產(chǎn)物。代謝指紋分析涉及比較不同個(gè)體中代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜峰，最終了解不同化合物的結(jié)構(gòu)，建立一套完備的識(shí)別這些不同化合物特征的分析方法。另一種方法是代謝輪廓分析(Metabolomic profiling)，研究人員假定了一條特定的代謝途徑，并對(duì)此進(jìn)行更深入的研究，再結(jié)合模式識(shí)別方法，有可能找出與之相關(guān)的生物標(biāo)志物(B1marker)。用于代謝物檢測(cè)的主要技術(shù)手段是核磁共振(NMR)，質(zhì)譜(MS)，色譜(HPLC，GC)。對(duì)于代謝產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，不僅只有質(zhì)譜峰這個(gè)特征，由于質(zhì)譜只能檢測(cè)離子化的物質(zhì)，但有些代謝產(chǎn)物在質(zhì)譜儀中不能被離子化，因此，質(zhì)譜(MS)并不能檢測(cè)出所有的代謝產(chǎn)物。此夕卜，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，代謝產(chǎn)物的同質(zhì)性不高，由于缺乏均勻性，使色譜分析變得更加困難，無(wú)法識(shí)別出樣品中的未知物質(zhì)。采用核磁共振(NMR)的方法，可以彌補(bǔ)色譜的不足，但由于核磁共振檢測(cè)的靈敏度不高，所以只用于分析低豐度代謝產(chǎn)物。
[0005]由于蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，為了滿足蛋白質(zhì)檢測(cè)快速、大規(guī)模和準(zhǔn)確的要求，生物質(zhì)譜技術(shù)成為了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的必然選擇。隨著生物化學(xué)的飛速發(fā)展，電噴霧離子化質(zhì)譜以及基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜得到了顯著的發(fā)展，使得質(zhì)譜能夠?qū)ι锎蠓肿舆M(jìn)行檢測(cè)和鑒定。由于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-TOF-MS)具有很多優(yōu)勢(shì)，例如高準(zhǔn)確性、高分子量檢測(cè)能力(理論上MALD1-TOF-MS無(wú)檢測(cè)上限)、高檢測(cè)靈敏度和對(duì)離子、緩沖液較強(qiáng)的忍耐性以及可對(duì)混合物的直接分析，使得基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在生物化學(xué)領(lǐng)域、臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和高分子聚合物的研究中得到了快速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。
[0006]將基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜應(yīng)用于蛋白質(zhì)肽譜分析，為蛋白質(zhì)的表征和鑒定提供了一種強(qiáng)有力的手段和工具。大豆中胰蛋白酶抑制劑是大豆種子中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，轉(zhuǎn)基因大豆中抗除草劑蛋白在大豆體內(nèi)的活性是否會(huì)對(duì)蛋白酶抑制劑的表達(dá)產(chǎn)生影響，從而使抑制劑的種類含量發(fā)生變化是直接影響大豆的食用安全性問題。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-TOF-MS)分析技術(shù)，結(jié)合基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，建立大豆中Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的多級(jí)質(zhì)譜鑒定方法，分析比較轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑肽段質(zhì)譜圖的差異，為鑒定抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆提供一種新方法，也為轉(zhuǎn)基因大豆的安全性評(píng)價(jià)提供新手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑的分離富集方法及Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的多級(jí)質(zhì)譜鑒定方法，其主要的技術(shù)要點(diǎn)在于:
[0008]1、抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑的高效富集
[0009]I)利用葡聚糖凝膠(S^hadex G-75)-分子篩凝膠過濾層析，從胰蛋白酶抑制劑粗提物中初步分離純化得到kunitz型胰蛋白酶抑制劑。
[0010]2)利用胰蛋白酶-瓊脂糖凝膠4B為親和介質(zhì)進(jìn)行親和層析純化，富集高純度的kunitz型胰蛋白酶抑制劑。
[0011]2、MALD1-TOF-MS測(cè)定大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑
[0012]MALD1-TOF-MS檢測(cè)大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑蛋白樣品中，非轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)譜圖有四個(gè)信號(hào)峰，分別為 15739.276m/z、19964.628m/z、20077.782m/z、20284.003mn/z ；轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)譜圖也有四個(gè)信號(hào)峰，分別為15377.423m/z、15747.264m/z、15883.453m/z、19965.445m/zo
[0013]3、MALD1-TOF-MS測(cè)定大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑肽指紋圖譜
[0014]對(duì)kunitz型胰蛋白酶抑制劑的肽段進(jìn)行M ALD1-T0F-MS檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因大豆與其親本相比存在相同的信號(hào)峰，分別為1656m/z、1738/1739m/z、2277m/z、2413m/z，同時(shí)質(zhì)荷比為2445m/z的信號(hào)峰與其親本在1568m/z、2703m/z處信號(hào)峰存在區(qū)別。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1、大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑的凝膠過濾層析純化
[0016]稱取1g葡聚糖凝膠G-75 (superdex G_75)溶解在250ml去離子水中，充分混勾后在100°C水浴中蒸煮3h進(jìn)行充分溶脹。將溶脹好的凝膠連續(xù)沿壁緩緩倒入層析柱(直徑20mm、柱長(zhǎng)60cm)中，待底部自然沉降一定量的凝膠以后，打開柱子下端的流出口，直至凝膠沉積到所需要的高度。用5倍柱體積的去離子水平衡層析柱，使凝膠床穩(wěn)定，并放一個(gè)面積相當(dāng)?shù)臑V紙片。膠面上方保持2?3cm高度的緩沖液。
[0017]稱取50mg大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑粗提物用5ml去離子水充分溶解，4°C下10000Xg離心5min備用。關(guān)閉層析柱的出口，吸出膠面上存留的去離子水，加入5ml樣品溶液，用緩沖液沖洗凝膠上方的柱子內(nèi)壁，待樣品全部進(jìn)入柱床內(nèi)加入2cm高的緩沖液層，連上緩沖液貯存器，打開出口閥，控制流速在0.7ml/min。用干凈的試管分部收集(7ml)流出液，檢測(cè)活性后真空冷凍干燥，置_20°C下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0018]實(shí)施例2、大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑的親和層析純化
[0019]將胰蛋白酶-瓊脂糖凝膠4B 45ml連續(xù)沿壁緩緩注入層析柱(柱長(zhǎng)25cm、直徑20mm)中，用5倍柱床體積的結(jié)合緩沖液(pH = 8.5)平衡層析柱，稱取分子篩凝膠過濾層析純化的大豆樣品溶于結(jié)合緩沖液(PH8.5)上柱，每15ml后用結(jié)合緩沖液沖洗柱子，直至流出液在280nm處的吸光度小于0.02，重復(fù)三次分批上樣，總上樣量為45ml，同時(shí)收集各穿透峰洗液。然后用2倍柱床體積的去離子水沖洗柱子。再用0.05mol/L甘氨酸-HCl溶液(pH = 2.0)進(jìn)行洗脫，流速0.5ml/min收集洗脫液，用濃度為lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為中性，透析除鹽，真空冷凍干燥后純化得到kunitz型胰蛋白酶抑制劑。
[0020]實(shí)施例3、MALD1-TOF-MS檢測(cè)條件
[0021]在離子源I加速電壓為25kV，離子源2加速電壓為22kV，能量85ev，N2激光波長(zhǎng)為337nm，脈沖寬度為5ns，離子延遲提取500ns，真空度5 X 10_9Pa儀器條件下，采用改進(jìn)后的雙層干燥法上樣，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次，正離子反射模式下測(cè)定。使用基質(zhì)峰進(jìn)行內(nèi)部校正，使用多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行外部校準(zhǔn)。
[0022]實(shí)施例4、MALD1-TOF-MS測(cè)定大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑
[0023]吸取I μ Lkunitz型胰蛋白酶抑制劑蛋白樣品溶液(樣品用ΤΑ30溶解)加至點(diǎn)樣靶，待液滴干燥后覆蓋IyL DHB (2, 5- 二羥基苯甲酸)基質(zhì)溶液(用ΤΑ30配制成濃度為20mg/ml)，待干燥后用德國(guó)Bruker公司的AutoFlex型MALD1-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。
[0024]實(shí)施例5、MALD1-TOF-MS測(cè)定大豆kunitz型胰蛋白酶抑制劑酶解肽段
[0025]I)樣品制備
[0026]在質(zhì)量比例為1: 50 (酶:蛋白質(zhì))、酶解反應(yīng)的緩沖體系為50mMNH4HC03的酶解條件，以胰凝乳蛋白酶為主要的水解酶，在37°C恒溫下酶解16h。酶解結(jié)束后，將酶解后的樣品溶液置于_20°C條件下冷凍保藏備用。
[0027]2)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-TOF-MS)檢測(cè)
[0028]吸取I μ L kunitz型胰蛋白酶抑制劑酶解后的樣品溶液加至點(diǎn)樣靶(點(diǎn)樣靶在使用之前用乙腈和乙醇反復(fù)擦洗以消除干擾)，待液滴晾干后，覆蓋I μ L飽和基質(zhì)溶液CHCA ( α -氰基-4-羥基肉桂酸，用30 %的乙腈和70 %的去離子水溶解，充分震蕩后超聲15min離心取上清液使用)，空氣風(fēng)干后用德國(guó)Bruker公司的AutoFlex型MALD1-T0F質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種可以檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑的多級(jí)質(zhì)譜鑒定方法，其特征在于以高純度富集的大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑為樣品，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-TOF-MS)分析技術(shù)，結(jié)合基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，建立大豆種子中kunitz型胰蛋白酶抑制劑的肽指紋圖譜，提供通過指紋圖譜比較鑒定轉(zhuǎn)基因大豆的新方法。2.權(quán)利要求1所述及高純度kunitz型胰蛋白酶抑制劑的分離富集方法包括，使用葡聚糖凝膠(Sephadex G_75)-分子篩凝膠過濾層析及胰蛋白酶-瓊脂糖凝膠4B親和層析方法分離純化。3.權(quán)利要求1所述及的MALD1-TOF-MS檢測(cè)條件，在離子源I加速電壓為25kV，離子源2加速電壓為22kV，能量85ev，N2激光波長(zhǎng)為337nm，脈沖寬度為5ns，離子延遲提取500ns，真空度5X10-9Pa儀器條件下，采用改進(jìn)后的雙層干燥法上樣，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次，正離子反射模式下測(cè)定，使用基質(zhì)峰進(jìn)行內(nèi)部校正，使用多肽標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行外部校準(zhǔn)。4.權(quán)利要求3所述及的改進(jìn)后的雙層干燥法上樣是指上樣基質(zhì)第一層為基質(zhì)層，第二層為基質(zhì)和kunitz型胰蛋白酶抑制劑混合物層。
【文檔編號(hào)】G01N27/64GK105891320SQ201410785161
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年12月18日
【發(fā)明人】王俊英, 王俊平, 林敏
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所