一種新型成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19(fgf19)基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19基因拷貝數(shù)的檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19 (Fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19)基因位于11號(hào)染色體，長(zhǎng)約6.1kb,由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子組成。FGF19基因的氨基酸序列與鼠類的FGF15基因相似，它能夠特異性地與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4 (FGFR4)基因相結(jié)合。
[0003]FGF19與肝細(xì)胞FGFR4的結(jié)合會(huì)通過(guò)抑制膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)基因從而調(diào)控膽汁的合成，而在高脂飲食和瘦素缺陷的小鼠中，F(xiàn)GF19還會(huì)提高代謝速率、降低體重并逆轉(zhuǎn)糖尿病。在小鼠中異位表達(dá)FGF19則會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞增生、肝細(xì)胞發(fā)育不良以及腫瘤形成。有研宄發(fā)現(xiàn)FGF19在結(jié)腸癌以及肝癌中會(huì)出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)，而選擇性抑制FGF19結(jié)合FGFR4的中和抗體則能夠抑制結(jié)腸腫瘤的生長(zhǎng)以及體內(nèi)肝臟腫瘤的形成。此外，有一系列研宄發(fā)現(xiàn)FGF19在一些肝癌細(xì)胞系中存在基因擴(kuò)增即多拷貝現(xiàn)象，在這些細(xì)胞系中對(duì)FGF19基因進(jìn)行基因敲除能夠抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而FGF19基因的拷貝情況還能夠預(yù)測(cè)肝癌細(xì)胞系對(duì)于選擇性FGFR抑制劑的敏感度。因此，對(duì)于FGF19基因拷貝數(shù)的檢測(cè)及分析對(duì)于新型抗腫瘤藥物及其伴隨診斷產(chǎn)品的研發(fā)乃至腫瘤個(gè)性化治療的發(fā)展有著重要的意義。
[0004]目前臨床上普遍應(yīng)用的基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法是熒光原位雜交(FISH)技術(shù)，可以直接在顯微鏡下觀察到基因的拷貝數(shù)變化和染色體異常情況，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本較高、對(duì)技術(shù)和人員要求較高等缺點(diǎn)；而在研宄領(lǐng)域中往往還會(huì)采用高通量的微陣列芯片(Microarray)方法來(lái)檢測(cè)基因拷貝數(shù)變化，但這一方法的原理是通過(guò)熒光雜交信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)判斷基因的拷貝數(shù)高低，而熒光信號(hào)存在一定的飽和性，因此對(duì)于拷貝數(shù)很高的樣品往往無(wú)法進(jìn)行精確定量，也就是說(shuō)，這一方法由于其原理技術(shù)的局限性，導(dǎo)致其檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍相對(duì)較小。
[0005]針對(duì)上述情況，本發(fā)明應(yīng)用一種全新的相對(duì)熒光定量PCR分析技術(shù)，配合成熟的含SYBR Green熒光染料PCR反應(yīng)預(yù)混液和穩(wěn)定的內(nèi)參序列，并結(jié)合人性化的在線分析軟件，最終可以簡(jiǎn)便快捷的實(shí)現(xiàn)FGF19基因拷貝數(shù)的檢測(cè)及分析計(jì)算過(guò)程，并生成完整的圖形報(bào)告。該方法與其它基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法相比，不僅操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，而且具有靈敏度高、特異性好、動(dòng)態(tài)范圍大、成本較低、方便靈活等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單易行的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法。
[0007]為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:
[0008]一種用于確定不同樣本中FGF19基因拷貝數(shù)的檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述的試劑盒由FGF19基因靶序列擴(kuò)增引物、內(nèi)參序列擴(kuò)增引物、PCR反應(yīng)預(yù)混液以及滅菌雙蒸水組合而成。
[0009]一種用于確定不同樣本中FGF19基因拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增方法，所述方法采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系包含F(xiàn)GF19基因靶序列擴(kuò)增引物、內(nèi)參序列擴(kuò)增引物、PCR反應(yīng)預(yù)混液以及滅菌雙蒸水，其特征在于:每個(gè)PCR反應(yīng)體系的體積共20 μ 1，其中靶序列擴(kuò)增引物或內(nèi)參序列擴(kuò)增引物中正向引物和負(fù)向引物體積共I μ I，每個(gè)PCR反應(yīng)所用模板DNA體積為I μ I，每個(gè)PCR反應(yīng)所用PCR反應(yīng)預(yù)混液體積為10 μ I，每個(gè)PCR反應(yīng)所用滅菌雙蒸水體積為8 μ I。
[0010]更具體地，所述的FGF19基因靶序列擴(kuò)增引物位于第2外顯子內(nèi)，其擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 72bp，其正向和反向序列分別為:FGF19-E2-F5’ -TGTCATTACCCCTTGGCGAC-3’ 以及 FGFl9-E2-R5 ’ -TGCAGTGTGTTTACTGCCCA-3 ’ ；所述內(nèi)參序列擴(kuò)增引物針對(duì)的是一段在人類基因組上隨機(jī)且平均出現(xiàn)超過(guò)40次的穩(wěn)定序列，其擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為85bp，其正向和反向序列分別為:MRef-F 5，-AAGGTGGGCCTGGAGAGTTT-3，以及 MRef-R 5，-CCTTTTTTGGCCCAGTTCCTG-3，。
[0011]更具體地，所述的FGF19基因靶序列擴(kuò)增引物和內(nèi)參序列擴(kuò)增引物中正向和反向引物的物質(zhì)的量濃度均為100nmol/l。
[0012]更具體地，所述的PCR反應(yīng)預(yù)混液由DNA聚合酶、MgCl2, dNTP、熒光染料SYBRGreen、參比熒光ROX、PCR反應(yīng)緩沖劑組成。
[0013]更具體地，所述PCR反應(yīng)預(yù)混液中DNA聚合酶的終濃度為1.25u，1%(:12的終濃度為2.0mmo I/I, dNTP的終濃度為每種dNTP各0.2mmol/l，熒光染料SYBR Green的終濃度為IX，參比熒光ROX的終濃度為40nmol/l，PCR反應(yīng)緩沖劑的終濃度為IX。
[0014]更具體地，針對(duì)每個(gè)樣本的FGF19基因革E序列擴(kuò)增，進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的PCR反應(yīng)；針對(duì)每個(gè)樣本的內(nèi)參序列擴(kuò)增，同樣進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的PCR反應(yīng)，以最大程度降低誤差。
[0015]更具體地，所述的DNA模板是自人類組織或細(xì)胞中提取的DNA。
[0016]更具體地，所述的人類組織或細(xì)胞采用硅膠膜吸附法提取基因組DNA，所得DNA模板濃度大于 1ng/ μ I 且 Α260/Α280 大于 1.8、Α260/Α230 大于 1.7。
[0017]更具體地，最后將DNA模板的濃度標(biāo)準(zhǔn)化至1ng/ μ I。
[0018]更具體地，所述熒光定量PCR方法具體實(shí)施如下:95°C變性10分鐘；95°C變性15秒，60°C退火延伸I分鐘，共40個(gè)循環(huán)。
[0019]所述的本試劑盒在針對(duì)不同樣本的FGF19基因拷貝數(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0020]由于以上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0021]I)基于熒光定量PCR技術(shù)，只需普通的PCR擴(kuò)增引物，而無(wú)需特別合成的熒光探針，并采用成熟的SYBR Green熒光染料及PCR預(yù)混液，操作簡(jiǎn)單便捷；
[0022]2)基于PCR技術(shù)，因此靈敏度高、特異性好、動(dòng)態(tài)范圍大、成本較低、方便靈活；
[0023]3)結(jié)果準(zhǔn)確，并且全部反應(yīng)都在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免了可能的交叉污染。
[0024]總之，本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣本中FGF19基因拷貝數(shù)進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)、計(jì)算，從而有助于新型抗癌藥物及其伴隨診斷產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。
【附圖說(shuō)明】
[0025]附圖1為本發(fā)明實(shí)施例樣本的FGF19靶基因序列擴(kuò)增圖，其中不同的曲線代表不同樣本及重復(fù)；
[0026]附圖2為本發(fā)明實(shí)施例樣本的MRef內(nèi)參序列擴(kuò)增圖，其中不同的曲線代表不同的樣本及重復(fù)；
[0027]附圖3為本發(fā)明實(shí)施例樣本的FGF19靶基因序列擴(kuò)增熔解曲線圖；
[0028]附圖4為本發(fā)明實(shí)施例樣本的MRef內(nèi)參序列擴(kuò)增熔解曲線圖。
[0029]附圖5為本發(fā)明實(shí)施例樣本最終計(jì)算所得的FGF19基因拷貝數(shù)柱狀圖，其中正常組織樣本151006N被設(shè)定為基因兩拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品用于計(jì)算。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體使用的不同要求做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。
[0031]下例實(shí)施例以檢測(cè)FGF19基因在9例肝癌、食管癌組織以及癌旁正常組織中的拷貝數(shù)為例，說(shuō)明本試劑盒的高靈敏度、