折疊引物多重pcr瘧疾分子診斷試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒及其檢測方法，屬于醫(yī)學(xué) 檢驗領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 感染人體的瘧原蟲有惡性瘧原蟲（PF)、間日瘧原蟲（PV)、三日瘧原蟲（PM)和卵形 瘧原蟲（PO) 4種，依次引起惡性瘧、間日瘧、三日瘧和卵型瘧。瘧疾與愛滋病、結(jié)核病被列 為全球三大公共衛(wèi)生問題。我國曾流行前2種瘧疾，自2010年起全國瘧疾發(fā)病率已連續(xù)3 年降至1/10萬以下，我國進入消除瘧疾行動階段，但隨著各種國際往來日益頻繁，來自世 界高瘧區(qū)的4種瘧原蟲（包括不同蟲株，混合感染和低密度帶蟲），不斷進入我國，2012年 境外輸入占全國瘧疾報告病例的91. 5%，惡性瘧成為瘧疾發(fā)病的主流，過去罕見的卵形瘧 和三日瘧頻頻出現(xiàn)，對全面消除瘧疾構(gòu)成嚴重威脅。我國瘧疾診斷面臨需要快速、準確地檢 出至少4種瘧原蟲和極低原蟲血癥的新挑戰(zhàn)。因此，及時發(fā)現(xiàn)瘧疾患者，并能準確診斷和分 型，是當(dāng)前瘧疾防治的關(guān)鍵，也是制定防治措施以及研制抗瘧藥和疫苗的迫切需要。
[0003] 現(xiàn)有的診斷方法中，我國常規(guī)使用的厚血膜顯微鏡檢查（鏡檢法）和快速診斷試 驗（RDT)都達不到檢出低原蟲血癥、混合感染和準確鑒定蟲種的要求。更敏感的基于PCR 的分子診斷試驗已有許多報告，如以18S核糖體RNA基因（rRNA)為靶基因的巢式PCR已廣 泛應(yīng)用于研宄和臨床診斷，目前已被我國用作瘧疾參比實驗室確診手段。但巢式PCR檢測 每份樣本需用5管試劑做2輪PCR反應(yīng)，費時、費力、且費用高，容易污染和失誤，要求有設(shè) 備精良的實驗室和由分子診斷專業(yè)技術(shù)人員操作，另外，經(jīng)證實，該法不能檢出卵形瘧原蟲 變異型，這些問題嚴重限制了巢式PCR的實際應(yīng)用，不可能用作普通實驗室常規(guī)診斷手段， 也不適用于大規(guī)模篩查和監(jiān)測。
[0004] 消除瘧疾的行動階段為全面發(fā)現(xiàn)和管理瘧疾病例（包括無癥狀帯蟲者）以阻斷 可能的傳播，需要檢出極低原蟲血癥（低至1個蟲All血）的診斷工具。雖有很多PCR診 斷試驗檢出瘧原蟲的敏感性超過鏡檢法和RDT的檢出極限（50-100個蟲/ μ 1血），但目前 敏感性、特異性最好的仍是作為分子診斷金標(biāo)準的18S巢式PCR?，F(xiàn)有報告巢式PCR檢出濾 紙血樣中PF低限為6個蟲和3個蟲/ μ 1血，如使用樣品濃縮方法可檢出0. 5個蟲/ μ 1血 或更低。近年報告的巢式PCR檢出單一感染的4種瘧原蟲均達到0. 4個蟲/ μ 1，也有低至 0. 086、0. 04個蟲/ μ 1，但其測定方法都采用高密度含蟲血提純DNA進行系列稀釋，不能代 表現(xiàn)場采集的濾紙血樣的實際檢測結(jié)果。
[0005] 混合感染是瘧疾診斷的另一個難題?；旌细腥局懈鞣N原蟲的密度可能相差懸殊， 當(dāng)混合感染中各種原蟲高、低密度之差在10倍及以上時，傳統(tǒng)PCR優(yōu)先擴增高密度模板致 迅速形成壟斷，低密度蟲種的擴增則受抑制甚至被完全掩蓋形成假陰性。2010年Tonya M-H 等用混合的實驗室提取的DNA評估三種PCR(巢式，半巢式多重，和單管多重）檢出模擬混 合感染效率的結(jié)論是：半巢式和單管多重PCR只能檢出和鑒定其中2種原蟲DNA，巢式PCR 是唯一能夠檢出和正確識別實驗混合4種瘧原蟲DNA的最好方法。到目前為止還沒有其他 分子診斷試驗達到或超過巢式PCR檢出4種瘧原蟲混合感染水平的報告。
[0006] 本發(fā)明人員在對巢式PCR的前期研宄中，建立了標(biāo)簽引物-套式/多重PCR檢測 體系，可同時檢出PF及PV，檢測敏感性為PF1-2個蟲/ul血，PV5-10個蟲/ul血；但檢測健 康者血樣易出現(xiàn)非特異擴增，檢測效果不夠穩(wěn)定。其后，進行了新型引物的設(shè)計并試用于克 服標(biāo)簽引物易引發(fā)其他非特異擴增的負面影響，取得明顯效果，但該體系仍需兩步擴增，而 中途開蓋加樣，會增加操作污染，造成假陽性，且只能檢測PV和PF。其后，在2012年研制 出了快速PCR瘧疾分子診斷試劑盒（專利號：201210061134. 5)，使試劑復(fù)雜操作繁重的傳 統(tǒng)套式/多重PCR簡化為單一試劑、單管一步反應(yīng)，可同時檢出和鑒定惡性瘧（PF)與間日 瘧（PV)兩種原蟲的單獨或混合感染，和判定三日瘧（PM)或卵形瘧（PO)的單獨感染，但不 能區(qū)分三日瘧與卵形瘧原蟲。目前尚未見有單管一步擴增可同時檢出和鑒定4種人瘧原蟲 及其混合感染的瘧疾分子診斷技術(shù)的報告。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的：為克服現(xiàn)有巢式PCR同時檢測4種瘧原蟲的診斷實驗需多管兩步 擴增，試驗時間長且試劑、操作復(fù)雜，需中間開管二次加樣，容易污染和失誤；而單管一步反 應(yīng)的快速PCR只能檢出和鑒定PF與PV兩種瘧原蟲的缺陷；提供一種單管一步擴增能同時 檢出和鑒定4種瘧原蟲的單一和混合感染、既靈敏、準確又簡便、快捷的折疊引物多重PCR 瘧疾分子診斷試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] -種折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒包含 樣本模板DNA制備和PCR反應(yīng)的全套試劑，由含鎂模板緩沖液和折疊引物多重PCR無鎂單 一組合試劑組成。其中所述的含鎂模板緩沖液為IX模板緩沖液和0.1 X模板緩沖液；
[0010] 進一步地，所述的IX模板緩沖液包含以下組分：
[0011] 3Ommol Tris-HCl ；30mmol KCl ;15mmol (NH4) 2S04;6. 6mmol MgCl 2;
[0012] 所述的0.1 X模板緩沖液是上述I X模板緩沖液用純水稀釋10倍而成。
[0013] 進一步地，所述的折疊引物多重PCR無鎂單一組合試劑包含以下組分：
[0014] 具有自我封閉功能的引物 6 條；Tris-HCl 3mmol/yL ;KC1 3mmol/yL ; NH4SO4L 5mmol/ μ L ;TMAC 0· OOlmmol/ μ L ;4 種核苷酸-4dNTP 各 20 μ mol/ μ L ;DNA 聚合 酶-Taq 酶 0· 5U/ μ L ;石蠟油 15 μ 1。
[0015] 前述的具有自我封閉功能的引物，包括瘧原蟲屬特異公共引物一對，編號 Uf-1865、Ur-2855 ;PF種特異正向引物1條，編號Ff-2545 ;PV、PM、P0種特異反向引物各1 條，編號 Vr-2343、Mr-2520、0r-2748。
[0016] 所述引物的設(shè)計是在每條引物的5'端添加與3'端互補的核苷酸序列，所述3'端 即第2~4堿基起至第8~18堿基，具體序列如下：
[0017] Uf-1865 5'GTCAAATGGCGTGGAAACACACTTCCCTTCTCGCCATTTGATAG 3'
[0018] Ur-2855 5'CTAAGAAGGTTCGATAACCTGTTATCCCCGGCGAACCTTCTTAC 3'
[0019] Ff-2545 5'GCTTCTGGATATTATGATAGATAACATACCAGAAG 3'
[0020] Vr-2343 5'CGGTGATGCTACTTACTTGGAGAATGTTTTGCATCACCT 3'
[0021] Mr-2520 5'GGTATAAAGGATTTTAGTTTATCTCCATGTCCTTTATACG 3'
[0022] Or-2748 5'CGGAAGGATGTAAAAGCACATTTAATATCTTATCCTTCCA 3'
[0023] 所述引物是根據(jù)4種人瘧原蟲線粒體細胞色素 b(Cyt b)基因?qū)?、種特異位點設(shè) 計的屬、種特異引物。
[0024] 進一步地，所述引物中，屬和種特異引物Uf-1865、Or-2748、Mr-2520、Vr-2343的 濃度均為 87nmol/ μ L ;Ur-2855 和 Ff-2545 的濃度均為 70nmol/ μ L。
[0025] 本發(fā)明設(shè)計的引物為折疊引物，每條種特異引物最佳初始退火溫度間至少相差 2~3°C ;各條引物3' 5'端互補退火的折疊溫度比引物與模板靶序列的初始退火溫度低 1~2°C，各擴增片段之間的大小相差150bp以上。
[0026] 本發(fā)明還提供上述折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒應(yīng)用于檢測和鑒定臨 床、流行病學(xué)樣本中存在的4種瘧原蟲單獨或混合感染的檢測方法。所述4種瘧原蟲為惡 性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲（包括經(jīng)典型和變異型）。
[0027] 利用前述的折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒檢測臨床、流行病學(xué)采集血液 樣本中的瘧原蟲的檢測方法包括樣本模板DNA制備、折疊引物多重PCR(FP-PCR)反應(yīng)和擴 增產(chǎn)物電泳分析鑒定的步驟如下：
[0028] 1、樣本模板DNA制備：
[0029] 1)采用濾紙法采集血樣，自然風(fēng)干后可室溫郵寄；干燥條件下4°C可長期保存；
[0030] 2)將濾紙血樣用打孔器打出6mm直徑圓片，放入0. 5ml錐形管內(nèi)，加入試劑盒中的 〇. IX模板緩沖液400 μ 1 (如試劑盒提供預(yù)裝0.1 X模板緩沖液管，則將濾紙血樣圓片直接 放入管內(nèi)），室溫浸泡5-10分鐘，瞬時離心洗脫血紅蛋白，吸去全部上清；加入IX模板緩 沖液50 μ 1，室溫平衡3分鐘，再吸去全部上清；