ma公司）進(jìn)行乳化后重復(fù)免疫兩次，小鼠尾部取血，用 間接ELISA方法檢測(cè)血清特異性抗體的效價(jià)（結(jié)果如圖1所示），其中2#小鼠效價(jià)可達(dá)1 : 1〇4,分別對(duì)1#、2#、3#、4#和5#小鼠進(jìn)行融合試驗(yàn)。融合前3天，腹腔加強(qiáng)免疫1次。
[0049] 2、雜交瘤細(xì)胞的制備
[0050] 超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌環(huán)境下取免疫BALB/c小鼠的脾臟研制成脾細(xì)胞懸液，用RPMI1640 培養(yǎng)基洗滌2次，收取I X IO8脾細(xì)胞與2 X 10 7-5 X IO7骨髓瘤細(xì)胞SP2/0混合于一支50ml 融合管中，補(bǔ)加 RPMI1640培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。lOOOr/min離心10分鐘，將上清盡 量吸凈。在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻。用Iml吸管在1分鐘左右加預(yù) 熱至37 °C的50% PEG2000 (PH 8. 0) lml，邊加邊輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，肉眼可見(jiàn)有顆粒出現(xiàn)，緩慢加入 RPMI1640培養(yǎng)基至20ml。lOOOr/min離心6分鐘，棄去上清。前10天在HAT選擇性培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng)，之后直至第一次克隆化完成前選用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)。2周后用間接酶聯(lián)免疫吸 附法（ELISA法）檢測(cè)融合細(xì)胞的陽(yáng)性率，選出陽(yáng)性值較高的孔，經(jīng)有限稀釋對(duì)檢測(cè)出的陽(yáng) 性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，連續(xù)克隆化3次使陽(yáng)性克隆孔的陽(yáng)性率達(dá)兩次100%后，選出值高 的孔轉(zhuǎn)孔并擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。獲得了穩(wěn)定分泌抗hNGF單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其編號(hào) 為 IlFl 和 12C11，送保藏，保藏號(hào)分別為：CGMCC No. 8772 和 CGMCC No. 8773。
[0051] 3、抗hNGF單克隆抗體腹水的制備、腹水效價(jià)測(cè)定及抗體純化
[0052] 采用體內(nèi)誘生法大量制備單克隆抗體。取6-8周齡的健康Balb/c雌性小鼠，腹腔 注射石蠟（0. 5ml/只）。1周后，雜交瘤細(xì)胞離心洗滌，用PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)至I X IO6個(gè)/ml， 每只小鼠注射0.5ml。5~7d后，待小鼠腹部膨大后，采集腹水并對(duì)腹水效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。腹 水離心后收集上清，用Protein A Sepharose純化抗體。分裝后于-70°C保存。
[0053] 實(shí)施例2.抗hNGF單克隆抗體亞類(lèi)鑒定
[0054] 米用 Pierce 公司的 Rapid ELISA Mouse Antibody Isotyping Kit (Cat. No. :37503)鑒定單抗的類(lèi)及亞類(lèi)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
[0055] 表1抗hNGF單抗亞型的鑒定結(jié)果
[0056]
[0057] 實(shí)施例3.抗hNGF單克隆抗體親和力常數(shù)測(cè)定
[0058] 采用捕獲抗體的方法，用GE公司生物分子相互作用分析儀Biacore 3000檢測(cè)抗 hNGF單克隆抗體的親和力及結(jié)合動(dòng)力學(xué)。
[0059] 表2Biacore檢測(cè)抗hNGF單克隆抗體與rhNGF抗原的親和力
[0060]
[0061] 實(shí)施例4.抗hNGF單克隆抗體的特異性鑒定
[0062] 采用Western Blot來(lái)鑒定單克隆抗體的特異性?？筯NGF單克隆抗體蛋白的純化 效果用SDS-PAGE鑒定（圖2)，用Gel-blot-pro分析電泳條帶的結(jié)果表明，抗體純度均不低 于90%。對(duì)rhNGF和mNGF進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印后，用制備的單抗（1 μ g/ml)進(jìn)行 孵育，AP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(l : 5000稀釋?zhuān)┳鳛槎?，按Western Blot的一般步驟操作。 抗hNGF單克隆抗體蛋白的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，由于人的NGF與小鼠 NGF 之間同源性高達(dá)89. 1 %，并有資料證明人與小鼠 NGF之間存在免疫交叉反應(yīng)，故在Western 鑒定過(guò)程中也得到了相同的結(jié)果?？筯NGF單克隆抗體與mNGF存在微弱交叉反應(yīng)。
[0063] 實(shí)施例5.抗hNGF單克隆抗體中和活性檢測(cè)
[0064] 根據(jù)NGF依賴(lài)的TF-I細(xì)胞可以依賴(lài)NGF增殖的原理，本實(shí)驗(yàn)用抗hNGF的單克隆 抗體中和rhNGF蛋白的生物學(xué)活性，從而抑制TF-I細(xì)胞增殖。
[0065] 具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0066] 1)用維持培養(yǎng)基配制抗hNGF單克隆抗體樣品溶液，在預(yù)稀釋濃度40 μ g/ml的基 礎(chǔ)上，進(jìn)行2倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度，將待檢測(cè)樣品溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每個(gè)濃度3 個(gè)復(fù)孔，每孔50 μ 1，另選擇3個(gè)孔加入陰性對(duì)照溶液（維持培養(yǎng)基），每孔100 μ 1。
[0067] 2)另用維持培養(yǎng)基配制rhNGF蛋白溶液，濃度200ng/ml，將rhNGF蛋白溶液轉(zhuǎn)移 至含有抗hNGF單克隆抗體樣品溶液的96孔板中，3個(gè)復(fù)孔每孔50 μ 1。陰性對(duì)照孔不添加 含有rhNGF蛋白的培養(yǎng)液。另選擇3個(gè)空白孔加入陽(yáng)性對(duì)照溶液rhNGF蛋白溶液IOOng/ ml，每孔100 μ 1。以上兩步操作完畢后，96孔板放置于37°C培養(yǎng)箱孵育lh。
[0068] 3)取足量TF-1-A2細(xì)胞培養(yǎng)物，離心收集TF-1-A2細(xì)胞，PBS重懸2次，離心收集 細(xì)胞后重懸于維持培養(yǎng)基配成每1ml含5 X IO4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中含有抗hNGF單克隆抗體和rhNGF蛋白的孔、陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔，每孔100 μ 1。置 于37度，5 %二氧化碳培養(yǎng)。72h后，每孔加入MTS溶液20 μ 1，于37度，5 %二氧化碳培養(yǎng)3 小時(shí)。從培養(yǎng)箱中取出96孔板，放入酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果。 按照公式：抗hNGF單克隆抗體孔的中和抑制率（％) = (50ngNGF 0D490nm-陰性孔值）一 (該抗體孔〇D490nm -陰性孔值V(50ngNGF 0D490nm -陰性孔值）計(jì)算中和抑制率。
[0069] 結(jié)果如圖4所示，隨著抗hNGF單克隆抗體濃度的增加，抗hNGF單克隆抗體的中和 抑制率也不斷增加，當(dāng)抗體達(dá)到一定濃度時(shí)，中和抑制率出現(xiàn)平臺(tái)期。如表3所示，IlFl和 12C11的中和抑制率高達(dá)100 %，表明抗hNGF單克隆抗體與rhNGF蛋白具有明顯的中和反 應(yīng)效應(yīng)。
[0070] 表3抗hNGF單克隆抗體每孔抑制率（％ )
[0071]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和性單克隆抗體12C11，由保藏號(hào)為CGMCCNo. 8772的雜交 瘤細(xì)胞所分泌，所述中和單克隆抗體與人神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有中和反應(yīng)效應(yīng)，其分類(lèi)亞型為： 重鏈IgGU輕鏈Kappa。2. 分泌人神經(jīng)生長(zhǎng)因子中和性單克隆抗體12C11的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為CGMCC No.8772〇3. -種止痛藥劑，其特征在于：其藥效成分包含權(quán)利要求1所述的中和性單克隆抗體 12Cll〇4. 一種抗過(guò)敏藥劑，其特征在于：其藥效成分包含權(quán)利要求1所述的中和性單克隆抗 體 12C11。5. -種抗抗哮喘的藥劑，其特征在于：其藥效成分包含權(quán)利要求1所述的中和性單克 隆抗體12C11。6. -種用于治療銀肩病的藥劑，其特征在于：其藥效成分包含權(quán)利要求1所述的中和 性單克隆抗體12C11。7. -種鑒定抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF抗體的中和活性的方法，步驟如下： (1) 用維持培養(yǎng)基配制抗體樣品溶液，在預(yù)稀釋濃度40yg/ml的基礎(chǔ)上，進(jìn)行2倍系列 稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度，將待測(cè)樣品溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，每孔50y1，另 選擇3個(gè)孔加入不含抗體的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，每孔100y1 ; 所述 9 個(gè)稀釋度分別為：10yg/ml、5yg/ml、2. 5yg/ml、l. 25yg/ml、0. 625yg/ml、 0. 3125yg/ml、0. 15625yg/ml、0. 078125yg/ml、0. 039063yg/ml; (2) 另用維持培養(yǎng)基配制200ng/ml的NGF蛋白溶液，將其添加至含有抗NGF抗體樣品 溶液的96孔板中，每孔50y1，陰性對(duì)照孔不添加NGF培養(yǎng)基，另選擇3個(gè)孔加入陽(yáng)性對(duì)照 溶液lOOng/mlNGF，每孔100y1，然后將96孔板放置于37°C培養(yǎng)箱孵育Ih; (3) 取足量TF-I細(xì)胞培養(yǎng)物，離心收集TF-I細(xì)胞，PBS洗滌2次，離心收集的細(xì)胞用維 持培養(yǎng)基重懸，配成每Iml含5XIO4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中含有NGF 蛋白及抗NGF抗體的孔、陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔中，每孔100y1 ;將96孔板置于37°C， 5 %二氧化碳培養(yǎng)；72h后，每孔加入MTS溶液20y1，于37 °C，5 %二氧化碳培養(yǎng)3小時(shí)； (4) 從培養(yǎng)箱中取出96孔板，放入酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定結(jié) 果； (5) 通過(guò)待測(cè)制品的吸光度，按照公式：抗NGF抗體孔的中和抑制率（％) = [(陽(yáng)性孔 0D490nm平均值-陰性孔0D490nm平均值）-(抗體孔0D490nm平均值-陰性孔0D490nm平 均值）V(陽(yáng)性孔〇D490nm平均值-陰性孔0D490nm平均值），計(jì)算每孔的中和抑制率，中和 抑制率越高，則抗NGF抗體的中和活性越強(qiáng)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明“抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和性單克隆抗體12C11及其雜交瘤細(xì)胞株”，涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和性單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCC No.8772的雜交瘤細(xì)胞所分泌，所述中和性單克隆抗體與人神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有中和反應(yīng)效應(yīng)，其分類(lèi)亞型為：重鏈IgG1、輕鏈Kappa。對(duì)人神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有特異性中和活性，可作為人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的拮抗劑。CGMCC No.877220140116CGMCC No.877320140116
【IPC分類(lèi)】G01N33/577, C07K16/22, A61P11/06, A61P17/06, A61P37/08, A61K39/395, C12N5/20, A61P29/00, C12R1/91
【公開(kāi)號(hào)】CN104910274
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510075083
【發(fā)明人】劉荷中, 霍立紅, 何景昌, 樂(lè)偉, 史權(quán)威
【申請(qǐng)人】北京華安科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2015年2月12日