抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和性單克隆抗體12c11及其雜交瘤細(xì)胞株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的單克隆抗體及其雜交瘤 細(xì)胞株。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF)是具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種 神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周?chē)窠?jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表 達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。
[0003] 研宄表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF)是一種在超敏反應(yīng)的發(fā)生和異常性疼痛的產(chǎn)生中 具有關(guān)鍵作用的遞質(zhì)。大量臨床前研宄表明：阻止NGF與其受體的相互作用，即可緩解疼 痛。NGF單克隆抗體與NGF中和，阻斷NGF與其感覺(jué)神經(jīng)元上的受體的相互作用從而達(dá)到緩 解疼痛的效果。（抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子單克隆抗體Tanezumab.藥學(xué)進(jìn)展.2010, 34 (1):526.)。 有報(bào)道顯示采用神經(jīng)生長(zhǎng)因子抗體拮抗劑來(lái)預(yù)防或治療手術(shù)后疼痛，包括來(lái)自手術(shù)或來(lái)自 切割性或創(chuàng)傷性傷口的疼痛。還有報(bào)道顯示抗NGF抗體用于治療各種疾病，包括哮喘、關(guān)節(jié) 炎和銀肩?。―.L.謝爾頓.抗NGF抗體用于治療各種疾病.中國(guó)專(zhuān)利【申請(qǐng)?zhí)枴?2814992. 0)。 然而，目前對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子抗體的報(bào)道多是研宄多克隆抗體（趙小林，由振東.神經(jīng)生長(zhǎng) 因子抗體的制備及其應(yīng)用.中國(guó)神經(jīng)科學(xué)雜志.2004, 20 (2) : 171-173.)。而多克隆抗體的 特異性差，用于免疫組化時(shí)顯色背景高，質(zhì)量不易控制，難以在臨床應(yīng)用推廣。單克隆抗體 具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，在臨床檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，可以在免疫組化、ELISA等多種方 法中使用。國(guó)內(nèi)外對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子單抗的研宄并不常見(jiàn)?，F(xiàn)已有報(bào)道得到的抗rhNGF單克 隆抗體是通過(guò)采用酸處理后的沙門(mén)氏菌菌體吸附純化的NGF(抗原：菌體1 :5)脾內(nèi)注射， 脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG融合后篩選得到雜交瘤細(xì)胞，并對(duì)得到的抗rhNGF單克隆抗體 進(jìn)行了初步的鑒定分析（蘇瑾，張亞莉，尤長(zhǎng)宣，等.抗人NGF單克隆抗體的制備及初步鑒 定.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志.2002, 18 (2) : 168)，但沒(méi)有對(duì)抗rhNGF單克隆抗體的中和活性 進(jìn)行鑒定。因此，目前還需要獲得一種特異性強(qiáng)、中和活性高的抗人NGF單克隆抗體，用于 臨床疼痛的緩解和疾病的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 根據(jù)上述領(lǐng)域的需求，本發(fā)明提供一種抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和性單克隆抗體及 其雜交瘤細(xì)胞株。
[0005] 本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案如下：
[0006] 抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和性單克隆抗體12C11，由保藏號(hào)為CGMCC No. 8772的雜 交瘤細(xì)胞所分泌，所述中和單克隆抗體與人神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有中和反應(yīng)效應(yīng)，其分類(lèi)亞型 為：重鏈IgGl、輕鏈Kappa。
[0007] 分泌人神經(jīng)生長(zhǎng)因子中和性單克隆抗體12C11的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號(hào)為 CGMCCNo. 8773〇
[0008] 基于本領(lǐng)域?qū)τ诳谷松窠?jīng)生長(zhǎng)因子的中和抗體的研宄，還請(qǐng)求保護(hù)上述抗體的以 下：制藥用途：
[0009] -種止痛藥劑，其特征在于：其藥效成分包含所述的中和性單克隆抗體12C11。
[0010] 一種抗過(guò)敏藥劑，其特征在于：其藥效成分包含所述的中和性單克隆抗體12C11。
[0011] 一種抗抗哮喘的藥劑，其特征在于：其藥效成分包含所述的中和性單克隆抗體 12C11。一種用于治療銀肩病的藥劑，其特征在于：其藥效成分包含所述的中和性單克隆抗 體 12C11。
[0012] 一種鑒定抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF抗體的中和活性的方法，步驟如下：
[0013] (1)用維持培養(yǎng)基配制抗體樣品溶液，在預(yù)稀釋濃度40 μ g/ml的基礎(chǔ)上，進(jìn)行2 倍系列稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度，將待測(cè)樣品溶液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，每孔 50 μ 1，另選擇3個(gè)孔加入不含抗體的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，每孔100 μ 1 ;
[0014] 所述 9 個(gè)稀釋度分別為：10 μ g/ml、5 μ g/ml、2. 5 μ g/ml、l. 25 μ g/ml、0. 625 μ g/ ml、0. 3125 μ g/ml、0. 15625 μ g/ml、0. 078125 μ g/ml、0. 039063 μ g/ml ;
[0015] (2)另用維持培養(yǎng)基配制200ng/ml的NGF蛋白溶液，將其添加至含有抗NGF抗體 樣品溶液的96孔板中，每孔50 μ 1，陰性對(duì)照孔不添加 NGF培養(yǎng)基，另選擇3個(gè)孔加入陽(yáng)性 對(duì)照溶液l〇〇ng/ml NGF，每孔100 μ 1，然后將96孔板放置于37°C培養(yǎng)箱孵育Ih ;
[0016] (3)取足量TF-I細(xì)胞培養(yǎng)物，離心收集TF-I細(xì)胞，PBS洗滌2次，離心收集的細(xì)胞 用維持培養(yǎng)基重懸，配成每1ml含5X IO4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中含 有NGF蛋白及抗NGF抗體的孔、陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔中，每孔100 μ 1 ;將96孔板置于 37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)；72h后，每孔加入MTS溶液20 μ 1，于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)3小 時(shí)；
[0017] (4)從培養(yǎng)箱中取出96孔板，放入酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定 結(jié)果；
[0018] (5)通過(guò)待測(cè)制品的吸光度，按照公式：抗NGF抗體孔的中和抑制率（％) =[(陽(yáng) 性孔0D490nm平均值-陰性孔0D490nm平均值）-(抗體孔0D490nm平均值-陰性孔0D490nm 平均值）V (陽(yáng)性孔0D490nm平均值-陰性孔0D490nm平均值），計(jì)算每孔的中和抑制率， 中和抑制率越高，則抗NGF抗體的中和活性越強(qiáng)。
[0019] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的中和單克隆抗體能夠與人神經(jīng)生長(zhǎng) 因子特異性結(jié)合，具有中和反應(yīng)活性，因此可以作為hNGF的拮抗劑。與現(xiàn)有的抗人神經(jīng)生 長(zhǎng)因子多克隆抗體相比，本發(fā)明提供的單抗特異性強(qiáng)，能夠避免交叉反應(yīng)，而且本發(fā)明提供 的單抗經(jīng)過(guò)了中和活性的鑒定，其效價(jià)高、親和力強(qiáng)、特異性好，能夠與人神經(jīng)生長(zhǎng)因子發(fā) 生明顯的中和反應(yīng)。
[0020] 本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)分泌抗人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其保藏 號(hào)分別為 CGMCC No. 8773。
[0021] 另一方面，本發(fā)明還提供一種鑒定抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF抗體的中和活性的方法， 所述方法為T(mén)F-I細(xì)胞增殖法。本發(fā)明首次采用TF-I細(xì)胞增殖法檢測(cè)抗NGF抗體的中和活 性，該方法可以準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)出抗NGF抗體的中和活性，其原理是：NGF依賴(lài)的TF-I細(xì) 胞在NGF蛋白存在的條件下可以促進(jìn)TF-I細(xì)胞增殖，然而在添加了 一定濃度的抗NGF抗體 后，抗NGF抗體與NGF發(fā)生中和作用，從而抑制TF-I細(xì)胞的良好生長(zhǎng)，然后通過(guò)添加 MTS混 合溶劑細(xì)胞顯色，在酶標(biāo)儀上〇D490nm處測(cè)吸光度，計(jì)算每孔的中和抑制率，中和抑制率越 高，抗NGF抗體的中和活性也就越強(qiáng)。
[0022] 生物保藏信息：
[0023] 生物材料名稱(chēng)：12C11
[0024] 分類(lèi)命名：小鼠雜交瘤細(xì)胞
[0025] 保藏日期：2014年1月16日
[0026] 保藏號(hào)：CGMCC No. 8772
[0027] 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)
[0028] 生物材料名稱(chēng)：IlFl
[0029] 分類(lèi)命名：小鼠雜交瘤細(xì)胞
[0030] 保藏日期：2014年1月16日
[0031] 保藏號(hào)：CGMCC No. 8773
[0032] 保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1.免疫后小鼠血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果
[0034] 圖2.抗hNGF單克隆抗體純化效果的SDS-PAGE鑒定
[0035] 圖3.抗hNGF單克隆抗體蛋白的Western Blot結(jié)果
[0036] 圖4.抗hNGF單克隆抗體中和抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述，需要說(shuō)明的是，以下實(shí)施例僅 用于解釋和說(shuō)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。
[0038] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0039] BALB/c小鼠：購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0040] rhNGF :重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子，由申請(qǐng)人單位表達(dá)并純化（樂(lè)偉，彭璐佳，史權(quán) 威，等.重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的高效表達(dá)和生物活性評(píng)價(jià)研宄.中國(guó)藥事.2014, 28(6): 601-606.)〇
[0041] NGF依賴(lài)的TF-1-A2細(xì)胞：由申請(qǐng)人單位本公司馴化后克隆化篩選的TF-I細(xì)胞 (劉荷中、樂(lè)偉、霍立紅，等.亞克隆細(xì)胞株TF-1-A2及其制備方法與用途.中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利 授權(quán)號(hào)：ZL 201210119401. X.)。
[0042] 注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（蘇肽生，北京舒泰神藥業(yè)有限公司，批號(hào)：201211148)
[0043] AP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG :購(gòu)自 SIGMA 公司（Cat. No. :A3562)。
[0044] 本發(fā)明未特別說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可以通過(guò)商購(gòu)或采用本領(lǐng)域 常規(guī)方法制備而得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)純級(jí)即可。
[0045] 實(shí)施例1.抗hNGF單克隆抗體的制備
[0046] l、BALB/c 小鼠免疫
[0047] rhNGF制備：由申請(qǐng)人自行表達(dá)、純化并制備（樂(lè)偉，彭璐佳，史權(quán)威，等.重組人 神經(jīng)生長(zhǎng)因子的高效表達(dá)和生物活性評(píng)價(jià)研宄.中國(guó)藥事.2014, 28 (6) :601-606.)。
[0048] 選取5只雌性BALB/c小鼠，將rhNGF抗原與弗氏完全佐劑（sigma公司）混合，乳 化完全后皮下注射，每只小鼠的免疫劑量為80 μ g免疫。首次免疫后，間隔2周及3周，將 rhNGF抗原與弗式不完全佐劑（sig