香菇多糖及其提取純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于香菇多糖的提取純化領(lǐng)域，具體涉及一種能保持香菇多糖活性三螺旋 結(jié)構(gòu)、產(chǎn)率高、多糖含量高、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的香菇多糖提取純化方法及在該方法下制備得到的香 菇多糖。
【背景技術(shù)】
[0002] 香葫多糖（Ientinan)是傘葫科真菌香葫子實體中提取得到的一種多糖，是由 β- (1，3)_糖苷鍵連接的主鏈和β- (1，6)糖苷鍵連接的支鏈組成的葡聚糖。最新研宄 表明：香菇多糖具有抗腫瘤作用，香菇多糖可通過調(diào)節(jié)人休內(nèi)有免疫功能的T細(xì)胞活性， 從而產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效果，并且對正常的細(xì)胞無毒副作用。香菇多糖還對大多數(shù)生 物體的SOD的活性有促進(jìn)作用，能特異化清除人體超氧自由基[02]，對機(jī)體的保護(hù)有抗衰 老、抗炎病、抗自身免疫病、抗輻射等積極作用，所以香菇多糖是抗衰老、抗癌和提高免疫功 能的有效成份之一。由于香菇多糖的醫(yī)學(xué)功效廣泛且?guī)缀鯖]有任何副作用，因而被認(rèn)為是 繼手術(shù)、放療、化療之后的第4種生物免疫療法。
[0003] 然而，目前對于香菇多糖的提取純化存在如下幾個難題：（1)香菇多糖的提取純 化產(chǎn)率非常低；（2)采用大量有機(jī)溶劑(如氯仿、正丁醇等)，容易造成環(huán)境污染以及成本的 提高；（3)活性成分受提取純化過程影響嚴(yán)重，產(chǎn)率的提高通常造成活性的喪失。
[0004] CN1978467A和CN101643514A雖然避免了有機(jī)溶劑的大量使用，但其產(chǎn)率分別僅 為2. 4g/25kg和0. 67% ;CN103724447A雖然獲得了超過1%的產(chǎn)率(純化率乘以提取率)，但 使用了大量氯苯和Sevage試劑，不僅生產(chǎn)成本高昂且環(huán)境污染性極大；CN103694366A雖然 避免了有機(jī)溶劑的大量使用，但多糖含量和產(chǎn)率均很低。
[0005] 包含上述研宄的現(xiàn)有技術(shù)采用了各種方法(如水提取、酶解提取、水提取與酶解提 取聯(lián)用、醇沉、過層析柱等）對香菇多糖進(jìn)行提取純化，但均未同時解決提高產(chǎn)率、避免環(huán)境 污染和控制成本的三大難題。更進(jìn)一步而言，現(xiàn)有技術(shù)在尚未解決上述難題的前提下，更無 法攻克在解決上述難題下還使得香菇多糖保持活性三螺旋結(jié)構(gòu)的更重大的難題。
[0006] 鑒于上述研宄現(xiàn)狀，本領(lǐng)域亟需尋找一種能保持香菇多糖活性三螺旋結(jié)構(gòu)、產(chǎn)率 高、多糖含量高、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的香菇多糖提取純化方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種香菇多糖的提取純化方法，其 特征在于，所述方法包括步驟： 1) 將香菇子實體切碎或粉碎； 2) 提?。翰捎脡A水提取，過濾得到提取液； 3) 脫蛋白：將步驟2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子實體重量0. 05~0. 1 %的 堿性蛋白酶，于45~60 °C下攪拌酶解1~5小時，將酶解液的pH值調(diào)至6. 0~7. 0,滅活， 得到一次酶解液；向一次酶解液加入香葫子實體重量〇. 05~0. 1 %中性蛋白酶，于40~60 °C下攪拌酶解1~5小時，滅活，得到脫蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步驟3)所得脫蛋白的提取液加無水乙醇，至乙醇終濃度為50%-90 % (v/v)，進(jìn)行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步驟4)所得粗多糖加入重量為香菇子實體干重30倍的水，于攪拌狀態(tài)下，緩慢加 入濃度為10 %(w/v)氫氧化十六烷基三甲胺水溶液，至無沉淀產(chǎn)生，控制加入過程中的pH 為11~12 ;于4°C下靜置至少2小時，離心取出香菇多糖沉淀，用濃度為20-50 % (v/v)醋 酸洗滌，得到香菇多糖中間體沉淀； 6) 采用醇沉方法，得到精制香菇多糖。
[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實驗摸索發(fā)現(xiàn)，采用如上提取純化方法，在避免使用大 量有機(jī)溶劑的基礎(chǔ)上，還可以獲得非常優(yōu)秀的產(chǎn)率，更重要的是獲得的香菇多糖的活性三 螺旋結(jié)構(gòu)沒有喪失。
[0009] 由于在提取多糖的同時，將會產(chǎn)生副產(chǎn)物(如堿性蛋白）。本發(fā)明的發(fā)明人通過摸 索發(fā)現(xiàn)，在利用堿性蛋白酶的同時加一定比例的中性蛋白酶，可得很好的提取效果。
[0010] 另外，采用濃度為10 %(w/v)氫氧化十六烷基三甲胺水溶液可以得到很好的多糖 收率。
[0011] 優(yōu)選的，步驟2)中的提取方法為：加入體積為香菇子實體干重所占體積20倍的濃 度為0. 5%-2% (w/v)的氫氧化鈉水溶液，室溫攪拌提取2-3 h，調(diào)pH至中性，過濾，得到提取 液。
[0012] 優(yōu)選的，步驟3)中所述堿性蛋白酶的酶活不小于40萬U/g，所述中性蛋白酶的酶 活不小于10萬u/g。
[0013] 優(yōu)選的，步驟5)中用20 -50 % (v/v)醋酸洗滌的方法為：加入3~4倍粗多糖干 樣體積的濃度為20 -50 % (v/v)醋酸，攪拌1-2 min，靜置20 min后，于5000 rpm下離心 10 min，得到香菇多糖中間體沉淀。
[0014] 優(yōu)選的，步驟6)中所述醇沉方法為：加入乙醇，至乙醇終濃度為50%_90 % (v/v)， 進(jìn)行沉淀，靜置2~4小時后離心取沉淀用無水乙醇洗滌，干燥得到精制香菇多糖。
[0015] 優(yōu)選的，所述方法在步驟5)之后還包括脫色步驟：向步驟5)所得香菇多糖中間體 加入堿水復(fù)溶，上離子交換樹脂收集洗脫液，得脫色液。具體為：將香菇多糖中間體用濃度 為4%~10% (w/v)氫氧化鈉水溶液復(fù)溶，加入量為10~20倍香菇多糖中間體干重，得到 香菇多糖溶液；香菇多糖溶液調(diào)至pH=6~7,超濾脫去大部分鹽后上樣于陰離子交換樹脂 柱，利用純化水洗脫，收集洗脫液；洗脫液上樣于陽離子交換樹脂柱，純化水洗脫，收集洗脫 液，得到脫色提取液。
[0016] 優(yōu)選的，在脫色步驟之后還包括控制多糖分子量步驟：將所得脫色液依次經(jīng)過微 濾、超濾、濃縮，得到濃縮液。具體為：脫色提取液用2微米微濾膜過濾，得初濾液；對初濾液 用20000Da的中空纖維膜進(jìn)行超濾；濃縮至3~6倍香菇多糖中間體干重量體積，取出，得 到濃縮液。
[0017] 本發(fā)明的另一個目的在于提供由上述方法制備得到的香菇多糖，該香菇多糖為類 白色粉末，含量96~102%，旋光度為0~17°，紅外光譜無 α構(gòu)型吸收峰，具有活性三螺 旋結(jié)構(gòu)，重均分子量為40~80萬Da。
[0018] 本發(fā)明的有益效果： 1) 本發(fā)明避免了有機(jī)溶劑的大量使用，環(huán)保性高，生產(chǎn)成本低； 2) 本發(fā)明精制香菇多糖含量和產(chǎn)率顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)； 3) 本發(fā)明所得香菇多糖具有活性三螺旋結(jié)構(gòu)； 4) 本發(fā)明制備工藝簡單、設(shè)備要求不苛刻，十分利于工業(yè)化。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明所得香菇多糖的紅外光譜結(jié)果； 圖2為本發(fā)明所得香菇多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)分析圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021] 實施例1 1) 將香菇子實體切碎； 2) 提?。翰捎?%氫氧化鈉水溶液，2000轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢杼崛?h 提取，過濾得到提取液； 3) 脫蛋白：將步驟2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子實體重量0. 05 %的堿性蛋 白酶，于60 °C下攪拌酶解1~5小時，將酶解液的pH值調(diào)至6. 0,滅活，得到一次酶解液； 向一次酶解液加入香葫子實體重量〇. 05 %中性蛋白酶，于60 °C下攪拌酶解5小時，滅活， 得到脫蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步驟3)所得脫蛋白的提取液加無水乙醇，至乙醇終濃度為50% % (v/v)，進(jìn)行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步驟4)所得粗多糖加入重量為香菇子實體干重30倍的水，于攪拌狀態(tài)下，緩慢加 入濃度為10 %(w/v)氫氧化十六烷基二甲胺水溶液，至無沉淀產(chǎn)生，控制加入過程中的pH 為11~12 ;于4°C下靜置2小時，離心取出香菇多糖沉淀，用濃度為50 % (v/v)醋酸洗滌， 得到香菇多糖中間體沉淀； 6) 加入無水乙醇至終濃度60%，4°C靜置12h，5000轉(zhuǎn)/分離心6分鐘，得到精制香菇多 糖。
[0022] 實施例2 1) 將香菇子實體粉碎； 2) 提?。杭尤塍w積為香菇子實體干重所占體積20倍的濃度為0. 5%-2% (w/v)氫氧化 鈉水溶液，室溫攪拌提取2h，調(diào)pH至中性，過濾，得到提取液； 3) 脫蛋白：將步驟2)所得提取液的pH至10. 0,加入0. 1 %的堿性蛋白酶，于45 °C下 攪拌酶解1小時，將酶解液的pH值調(diào)至7. 0,滅活，得到一次酶解液；向一次酶解液加入0. 1 %中性蛋白酶，于45 °C下攪拌酶解1小時，滅活，得到脫蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步驟3)所得脫蛋白的提取液加無水乙醇，至乙醇終濃度為90 % (v/v )，進(jìn)行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步驟4)所得粗多糖加入重量為香菇子實體干重30倍的水，于攪拌狀態(tài)下，緩慢加 入濃度為10 %(w/v)氫氧化十六烷基二甲胺水溶液，至無沉淀產(chǎn)生，控制加入過程中的pH 為11~12 ;于4°C下靜置3小時，離心取出香菇多糖沉淀，用濃度為50 % (v/v)醋酸洗滌， 得到香菇多糖中間體沉淀； 6)加入乙醇，至乙醇終濃度為50% (v/v)，進(jìn)行沉淀，靜置4小時后離心取沉淀用無水 乙醇洗滌，干燥得到精制香菇多糖。
[0023] 實施例3 1) 將香菇子實體粉碎； 2) 提?。杭尤塍w積為香菇子實體干重所占體積20倍的濃度為0. 5%-2% (w/v)氫氧化 鈉水溶液，室溫攪拌提取3h)，調(diào)pH至中性，過濾，得到提取液； 3) 脫蛋白：將步驟2)所得提取液的pH至10. 0,加入香菇子實體重量0. 08 %的堿性蛋 白酶，于50 °C下攪拌酶解3小時，將酶解液的pH值調(diào)至6. 5,滅活，得到一次酶解液；向一 次酶解液加入香菇子實體重量〇. 08 %中性蛋白酶，于50 °C下攪拌酶解3小時，滅活，得到 脫蛋白的提取液； 4) 醇沉得粗多糖：向步驟3)所得脫蛋白的提取液加無水乙醇，至乙醇終濃度為80 % (v/v )，進(jìn)行沉淀，得到粗多糖； 5) 向步驟4)所得粗多糖加入重量為香菇子實體干重30倍的水，于攪拌狀態(tài)下，緩慢加 入濃度為10 %(w/v)氫氧化十六烷基二甲胺水溶液，至無沉淀產(chǎn)生，控制加入過程中的pH 為11~12 ;于4°C下靜置4小時，離心取出香菇多糖沉淀，用濃度為20-50 % (v/v)醋酸洗 滌，得到香菇多糖中間體沉淀； 6) 加入乙醇，至乙醇終濃度為90 % (v/v)，進(jìn)行沉淀，靜置2小時后離心取沉淀用無水 乙醇洗滌，干燥得到精制香菇多糖。
[0024] 實施例4 1) 將香菇子實體粉碎； 2) 提?。杭尤塍w積為香菇子實體干重所占體積20倍的氫氧化鈉水溶液0. 5%-2% (w/ V )，室溫攪拌提?。?.