一種檢測水體雞糞污染的巢式pcr試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水體污染檢測領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種檢測糞便污染水體中雞糞 污染的巢式PCR試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，我國水體污染日趨嚴(yán)重，威脅著人們的生存環(huán)境和健康用水，并對社會造 成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。太湖流域畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達，養(yǎng)殖業(yè)廢水是造成太湖流域水體污染的 主要來源之一。糞便污染物進入水體后不僅會增加水體氮磷含量，造成富營養(yǎng)化，并且會帶 入奠便中可能存在的致病菌，引發(fā)疾病的水體傳播（Baldursson，S. and Karanis, P. (2011) Waterborne transmission of protozoan parasites:Review of worldwide outbreaks -An update 2004 - 2010. Water Research 45 (20) ,6603 - 6614·)。進行水體污染的控制和 治理已經(jīng)刻不容緩。
[0003] 糞便污染的潛在污染源種類繁多，呈現(xiàn)點、面源結(jié)合的特征，缺乏對糞便污染來源 的準(zhǔn)確掌握和定位，使得治理工作只停留在"見污治污"階段，在一定程度上增加了污染治 理的成本。如何尋找和區(qū)分水體中糞便污染主要來源，從而快速、準(zhǔn)確地確定污染源，成為 了解決問題的關(guān)鍵。傳統(tǒng)方法通過檢測水中糞便污染指示菌（如大腸桿菌、腸球菌等）來 判斷水體糞便污染情況，耗時長且無法區(qū)分污染源。通過檢測水體宿主特異性微生物或化 學(xué)標(biāo)志物，可以達到糞便污染溯源的目的，但現(xiàn)存的一些微生物及化學(xué)標(biāo)志物特異性不高， 往往導(dǎo)致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。2000年，Pierre等最先證實糞便中的線粒體DNA(mtDNA)具 有其種屬特異性，并且動物糞便中含有較高豐度的mtDNA，通過PCR手段能夠檢測到明顯 的mtDNA信號，因此提出了"水體奠便污染的mtDNA溯源方法"（Caldwell, J.，Payment, P. and Villemur, R. (2011)Mitochondrial DNA as Source Tracking Markers of Fecal Contamination.)〇
[0004] 以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為水體糞便污染的檢測提供了強有 力的工具。通過特異性引物PCR擴增水體中的目標(biāo)線粒體DNA片段，即可檢測樣品是否受 到潛在的糞便污染，用時短且準(zhǔn)確度高。另外通過設(shè)計特異性的巢式PCR引物進行二次擴 增，極大的提高了方法的靈敏度，能夠檢測到水體中的微量糞便污染。
[0005] 目前國內(nèi)對水體糞便污染溯源公開文獻較少，國外針對雞糞污染溯源主要集 中在宿主特異性微生物溯源法上，但微生物溯源法常常會出現(xiàn)特異性不高的現(xiàn)象（K 0 bayashi, A. , Sano, D. , Hatori, J. , Ishii, S. and Okabe, S. (2013) Chicken - and duck -associated Bacteroides - Prevotella genetic markers for detecting fecal contamination in environmental water. Applied Microbiology and Biotechnology 97(16),7427 - 7437.)，相比之下，線粒體DNA溯源法具有更好的特異性。目前尚未公開 基于雞mtDNA設(shè)計的特異性巢式PCR引物及檢測方法，此方法進行雞糞污染溯源，具有 較高的特異性，且相比之前報道的巢式PCR方法具有更高的靈敏度（Kortbaoui，R.，Loc as, A. , Imbeau, Μ. , Payment, Ρ. and Villemur, R. (2009)Universal mitochondrial PCR combined with species -specific dot -blot assay as a source -tracking method of human,bovine, chicken, ovine, and porcine in fecal - contaminated surface water. Water Res 43 (7)，2002 - 2010.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] I、要解決的技術(shù)問題
[0007] 針對傳統(tǒng)檢測糞便污染的方法無法溯源的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測水體 雞糞污染的巢式PCR檢測方法及試劑盒，可以實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地檢測水體微量雞糞污染。
[0008] 2、技術(shù)方案
[0009] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方法實現(xiàn)：
[0010] 一種檢測水體雞糞污染的巢式PCR試劑盒，包括兩對巢式PCR引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg 2+和ddH 20,兩對巢式PCR引物為：
[0011] SCF:5 ' - CACATGTTATCTGCACCAGC - 3 '
[0012] SCR:5 ' - GTTAAGGGTACGAGTTTGTCG - 3 '
[0013] NCF:5，- CCAAATCCATCTTAGCCTCAAC - 3，
[0014] NCR:5 ' - GGCGGGTTTCACATCCTT - 3 '。
[0015] 具體地，所述 PCR buffer 為 10XPCR buffer，dNTP 濃度為各 2. 5mmol/L，Taq 酶濃 度為5U/ul，Mg2+溶液濃度為25mmol/L。
[0016] 采用上述巢式PCR試劑盒檢測水體雞糞污染的方法，其步驟為：
[0017] (1)取待測水樣提取DNA ;
[0018] (2)以水樣DNA為模板，進行第一輪PCR擴增，PCR引物為SCF和SCR ;
[0019] (3)第一輪PCR擴增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物為模板，進行第二輪PCR擴增，PCR引物為 NCF 和 NCR ;
[0020] (4)凝膠電泳，觀察第二輪PCR產(chǎn)物中是否存在長度為403bp的條帶，若存在，則表 明水體受到了雞糞污染。
[0021] 進一步，利用巢式PCR試劑盒檢測水體雞糞污染的方法，其具體步驟為：
[0022] (1)采集待測水樣，提取水樣DNA ;
[0023] (2)以水樣DNA為模板，進行第一輪PCR擴增，反應(yīng)體系為2.5ul的10XPCR buffer;2.5ul dNTP;0.1ul Taq 酶；2ul Mg2+;0.5ul 濃度為 lOumol/L 上、下游引物 SCF、 SCR;2ul模板DNA ;滅菌CldH2O補足至25ul ;反應(yīng)條件為95°C，預(yù)變性5min ;95°C 30s， 58°〇3〇8,72°〇458,40個循環(huán)；72°〇711^11，4°〇保存。
[0024] (3)第一輪PCR擴增結(jié)束后，取0· 5ul PCR產(chǎn)物為模板，進行第二輪PCR擴增，反 應(yīng)體系為 2. 5ul 的 10XPCR buffer ;2· 5ul dNTP ;0· Iul Taq 酶；2ul Mg2+;0. 5ul 濃度為 lOumol/L上、下游引物NCF、NCR ;0. 5ul模板DNA ;滅菌ddH20補足至25ul ;反應(yīng)條件為95°C， 預(yù)變性311^11;95°〇158,58°〇158,72°〇3〇8,40個循環(huán) ；72°〇71^11，4°〇保存。
[0025] (4)對第二輪PCR產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為：電壓120V，電流 440mA，時間25min，觀察第二輪PCR產(chǎn)物中是否存在長度為403的條帶，若存在，則表明水體 受到了雞糞污染。利用本發(fā)明進行水體雞糞污染檢測的檢測限為〇. 〇〇21ng/ul雞糞DNA。 具體的，步驟（4)中凝膠電泳為1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為：電壓120V，電流440mA， 時間25min。
[0026] 上述利用巢式PCR試劑盒檢測水體鴨糞污染的方法中，步驟（2)完成后對第一輪 PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，若存在長度為783bp的條帶，則表明水體受到了較嚴(yán)重的雞糞污 染，檢測閾值為0. 〇34ng/ul雞糞DNA，無需進行步驟（3)和步驟（4)。
[0027] 3、有益效果
[0028] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0029] (1)本發(fā)明選取的雞糞污染標(biāo)志物為雞線粒體DNA，使得檢測方法具有良好的特 異性，減低了對檢測樣品的誤判；
[0030] (2)本發(fā)明采用巢式PCR方法檢測水體雞糞污染，通過兩次PCR擴增使得檢測方法 具有較高的靈敏度，能夠檢測到水體中的微量雞糞污染，在糞便污染防控預(yù)警方面具有很 高的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0031] 圖1 :巢式PCR方法的特異性檢測電泳結(jié)果圖：圖I(A)為第一輪PCR擴增特異性 檢測電泳結(jié)果圖；圖I(B)為第二輪PCR擴增特異性檢測電泳結(jié)果圖。
[0032] 圖2 :巢式PCR方法的第一輪PCR檢測限確定電泳結(jié)果圖。
[0033] 圖3 :巢式PCR方法的第二輪PCR檢測限確定電泳結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0034] 下面結(jié)合說明書附圖和具體的實施例，對本發(fā)明作詳細描述。
[0035] 實施例1 :
[0036] 一種檢測水體雞糞污染的巢式PCR試劑盒，包括兩對巢式PCR引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg 2+和ddH 20,兩對巢式PCR引物為：