長(zhǎng)鏈非編碼rna afap1-as1在制備肺癌輔助診斷和預(yù)后判斷制劑上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及長(zhǎng)鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的原位雜 交探針、檢測(cè)試劑及其應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類基因組計(jì)劃及其后續(xù)的DNA元件百科全書(shū)計(jì)劃（The Encyclopedia of DNA Elements Pr〇ject，ENCODE)研宄成果表明，蛋白編碼基因序列僅占人類基因組序 列的1-3%，而人基因組中絕大部分可轉(zhuǎn)錄的序列為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)。LncRNA廣泛地存在于各種生物中，且隨著生物復(fù)雜程度的升高，基因組中 IncRNA序列的比例也相應(yīng)地增大，提示IncRNA在生物進(jìn)化過(guò)程中有重要意義。隨著IncRNA 不斷被發(fā)現(xiàn)，它們的功能逐漸被詮釋，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)IncRNA廣泛而活躍地參與到生命活動(dòng) 不同層面的功能調(diào)控中，作為一個(gè)嶄新的領(lǐng)域，已經(jīng)成為國(guó)際生命科學(xué)研宄領(lǐng)域新的前沿 與熱點(diǎn)。
[0003] LncRNA可作為功能蛋白質(zhì)的信號(hào)（signal)、誘導(dǎo)（guide)、誘館（decoy)或支架 (scaffold)分子等多種方式，在染色質(zhì)重構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白修飾等多重水平調(diào)控基 因的表達(dá)，并在包括發(fā)育、免疫、生殖等基本生理過(guò)程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表達(dá)與功能失調(diào)已經(jīng)與包括惡性腫瘤在內(nèi)的人類多種疾病緊密聯(lián)系在了一 起。因此，深入研宄IncRNA的功能，揭示由IncRNA介導(dǎo)的遺傳信息傳遞方式和表達(dá)調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)，不僅可以從蛋白編碼基因以外的角度重新注釋和闡明基因組的結(jié)構(gòu)與功能，深入發(fā)現(xiàn) 生命活動(dòng)的本質(zhì)和規(guī)律，還有望從一個(gè)新的視角認(rèn)識(shí)包括腫瘤在內(nèi)的多種人類常見(jiàn)疾病的 發(fā)病機(jī)理，并為這些疾病的診斷與治療提供新的分子標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)。
[0004] 肺癌是對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤，近50年來(lái)全球肺癌的發(fā)病率和 死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，在女性中則占 第二位。研宄表明，這種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，LncRNA 在肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能也起到了重要的作用。最近我們利用IncRNA芯片，構(gòu)建了 肺癌活檢組織及正常對(duì)照樣品中IncRNA的表達(dá)譜，從中篩選了一些在肺癌中差異表達(dá)的 IncRNAs，經(jīng)擴(kuò)大樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，證實(shí)IncRNA AFAP1-AS1 (NCBI accession number: NR_026892)在肺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，針對(duì)該IncRNA的檢測(cè)制劑可以用于肺癌 的輔助診斷。隨后，我們進(jìn)一步增加樣本，在226例有臨床隨訪資料的肺癌石蠟存檔標(biāo)本 中，通過(guò)原位雜交（in situ hybridization)的方法檢測(cè)了 AFAP1-AS1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn) AFAP1-AS1表達(dá)高的患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其生存時(shí)間短于該IncRNA表達(dá)低的患者，因此 針對(duì)該IncRNA的檢測(cè)制劑也可以用于肺癌的預(yù)后判斷。
[0005] 我們通過(guò)設(shè)計(jì)并合成靶向AFAP1-AS1的短發(fā)夾RNA(short-hairpin RNA, shRNAs) 序列，構(gòu)建了靶向AFAP1-AS1的RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞株中，在體外培養(yǎng)細(xì)胞 模型中證實(shí)了靶向干擾AFAP1-AS1的表達(dá)可明顯抑制肺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。將 AFAP1-AS1的RNA干擾載體負(fù)載到多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒上制成納米基因轉(zhuǎn)運(yùn)體， 多聚賴氨酸修飾的硅納米顆?？杀Ｗo(hù)AFAP1-AS1的RNA干擾載體免受核酸酶降解，延長(zhǎng)作 用時(shí)間，且有更高的轉(zhuǎn)染效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供長(zhǎng)鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的原位雜交探針、試劑及其應(yīng)用 方法，利用長(zhǎng)鏈非編碼RNA AFAP1-AS1序列可以制備用于肺癌預(yù)后預(yù)測(cè)的制劑。
[0007] LncRNA AFAP1-AS1的應(yīng)用方法，用于制備肺癌療效預(yù)測(cè)的制劑，該長(zhǎng)鏈非編碼RNA AFAPI-ASl的序列如SEQ NO: 1所示。
[0008] 所述的肺癌療效預(yù)測(cè)的制劑為原位雜交檢測(cè)試劑。
[0009] 所述的原位雜交檢測(cè)試劑中包括用于原位雜交檢測(cè)AFAP1-AS1表達(dá)的寡核苷酸 探針，序列如下：
[0010] AFAP1-AS1 探針 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'，SEQ N0:2，
[0011] AFAP1-AS1 探針 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3'，SEQ NO: 3，
[0012] AFAP1-AS1 探針 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'，SEQ N0:4。
[0013] 所述的原位雜交檢測(cè)試劑為試劑盒。
[0014] 試劑盒中含有上述用于原位雜交檢測(cè)AFAP1-AS1表達(dá)的寡核苷酸探針：
[0015] AFAP1-AS1 探針 1 :5' -ATTCCTTTATTTTATGGGATGTTCTGTAGGGAGTT-3'
[0016] AFAP1-AS1 探針 2 :5' -TAGAAATGAGAAAAGAATCACCAAGAGAGTAAGCA-3，
[0017] AFAP1-AS1 探針 3 :5' -TCCCTACAGCTAGTTTCCTCTTCATTTATTCATTT-3'
[0018] 陽(yáng)性對(duì)照探針（檢測(cè)看豕基因 GAPDH):
[0019] GAPDH 探針 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'，SEQ N0:5，
[0020] GAPDH 探針 2 :5, -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3,，SEQ N0:6，
[0021] GAPDH 探針 3 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3,，SEQ NO: 7。
[0022] 試劑盒中還含有：地高辛寡核苷酸加尾試劑、抗地高辛-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物 檢測(cè)試劑、DAB染色試劑；
[0023] 其它常規(guī)生物化學(xué)試劑，包括20x檸檬酸鈉緩沖溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去離子甲酰胺（Deionized Formamide)， 多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脫氧腺苷酸（polydeoxyadenylic acid， Poly dA)，變性剪切的娃精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)， 酵母轉(zhuǎn)運(yùn) RNA(yeast t-RNA，tRNA)，二硫蘇糖醇（DTT)，50x 鄧罕氏緩沖液（Denhardts' s solution)，磷酸緩沖液（PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白（BSA)，三乙醇胺 (TEA)，醋酸酐，阻斷試劑（Blocking reagent agent)，TNB 緩沖液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 5 % 阻斷試劑），TNT 緩沖液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 05% Tween 20) 〇
[0024] 我們通過(guò)原位雜交在存檔的肺癌石蠟組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1的表達(dá)與肺癌 患者的預(yù)后密切相關(guān)，AFAP1-AS1表達(dá)高的患者生存時(shí)間更短，提示AFAP1-AS1可作為肺癌 預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志。本發(fā)明為肺癌的輔助診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工 具，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證IncRNA AFAP1-AS1在肺癌和癌旁肺組織中的 表達(dá)情況，AFAP1-AS1在肺癌（T)中的表達(dá)比癌旁肺組織（N)中顯著提高；
[0026] 圖2為原位雜交檢測(cè)AFAP1-AS1在肺癌中的表達(dá)情況；
[0027] 在85 %的肺癌（226例肺癌組織中的192例）中檢測(cè)到有AFAP1-AS1的高表達(dá) (左），其余的34例肺癌組織中AFAP1-AS1的表達(dá)較低（右）；
[0028] 圖3為肺癌