山羊atbf1基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物分子育種領(lǐng)域，涉及重要功能基因單核苷酸多態(tài)性（SNP)的檢測(cè) 方法及其應(yīng)用，特別涉及山羊ATBFl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法及其在育種中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 動(dòng)物育種技術(shù)主要包括以表型和表型值為基礎(chǔ)的常規(guī)育種技術(shù)和以DNA多態(tài) 為基礎(chǔ)的分子育種技術(shù)。作為分子育種技術(shù)體系的重要組成部分，分子標(biāo)記輔助選擇 (marker-assisted selection，MAS)育種技術(shù)首先檢測(cè)重要基因的DNA多態(tài)性，然后分析 DNA多態(tài)與遺傳性狀之間的相關(guān)性，最后再根據(jù)與遺傳性狀顯著相關(guān)的DNA標(biāo)記進(jìn)行性狀 選擇。作為現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展過(guò)程中孕育而生的新技術(shù)，MAS育種技術(shù)可以在DNA水 平上快速準(zhǔn)確地分析個(gè)體的遺傳組成，該方法通過(guò)有性雜交將目的基因轉(zhuǎn)移到需要改良的 親本中，將目標(biāo)基因型的鑒定與傳統(tǒng)育種相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇，提高育種 目標(biāo)的定向性。該方法在克服表型鑒定的困難、早期選擇、進(jìn)行無(wú)損害的性狀評(píng)價(jià)和選擇及 提高回交育種效率等方面具有優(yōu)越性。
[0003] 在MAS育種技術(shù)體系中，尋找重要功能基因、篩查重要基因遺傳變異位點(diǎn)，并分 析重要功能基因遺傳變異位點(diǎn)與生長(zhǎng)性能的相關(guān)性，是分子標(biāo)記輔助選擇（MS)技術(shù) 應(yīng)用的前提和關(guān)鍵。作為第三代分子遺傳標(biāo)記，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)是一種新型分子標(biāo)記。SNP是指DNA序列上單個(gè)核苷酸（A/T/C/G) 的變異而引起DNA序列的改變，造成包括人類在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣性。一 般而言，SNP是指變異頻率大于1 %的單核苷酸變異，這種變異包括堿基的替換、插入、缺失 以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。從理論上來(lái)看每一個(gè)SNP位點(diǎn)都可以有4種不同的變異形式， 但實(shí)際上發(fā)生的只有兩種，即轉(zhuǎn)換和顛換，二者之比為2: USNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁， 而且多是C轉(zhuǎn)換為T，原因是CG中的C常為甲基化的，自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。在人 類基因組中，每隔100至300個(gè)堿基就會(huì)存在一處SNP位點(diǎn)。每3個(gè)SNP位點(diǎn)中有2個(gè)會(huì) 是C和T的相互轉(zhuǎn)變。人類遺傳基因的各種差異，90%可歸因于SNP引起的基因變異。由 于同一位點(diǎn)的不同等位基因之間經(jīng)常只有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的差異，利用SNP分析個(gè)體基 因組可以更好地解釋個(gè)體的表型差異，因此從DNA水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行SNP檢 測(cè)在動(dòng)物分子育種的MAS體系中具有重要意義。
[0004] 目前，SNP根據(jù)其在基因組中的位置，可以分為基因編碼區(qū)SNPs(Coding-region SNPs，cSNPs)、基因周邊區(qū) SNPs(Perigenic SNPs，pSNPs)和基因間隔區(qū) SNPs(Intergenic SNPs，iSNPs)。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，處于編碼序列的SNP不一定會(huì)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序 列。所以，編碼區(qū)的SNP有兩種類型：同義突變和錯(cuò)義突變。同義突變并不影響蛋白質(zhì)序 列，但有研宄顯示同義突變會(huì)影響目的蛋白質(zhì)的翻譯效率，進(jìn)而對(duì)基因功能產(chǎn)生重要影響； 錯(cuò)義突變則會(huì)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，最終影響到蛋白質(zhì)的功能。不在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的 SNP仍可能影響轉(zhuǎn)錄子的結(jié)合、基因剪接、信使RNA降解或非編碼區(qū)的RNA序列，所以，在群 體遺傳研宄中，這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研宄中也具有重要意義。 因此，SNP在遺傳病和育種的研宄中具重要意義，倍受動(dòng)物育種專家的青睞。
[0005] 迄今為止，檢測(cè)SNPs的技術(shù)非常多，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng) (PCR-RFLP)、單構(gòu)鏈多態(tài)性PCR(PCR-SSCP)、等位基因特異性PCR(AS-PCR)、直接測(cè)序法、新 型高通量SNP檢測(cè)技術(shù)和引入突變位點(diǎn)的-PCR-RFLP(Forced-PCR-RFLP)法等。在這些技 術(shù)中，PCR-RFLP法是最早應(yīng)用于分子人類學(xué)的SNP檢測(cè)技術(shù)，因?yàn)樵摷夹g(shù)簡(jiǎn)單且易操作， 對(duì)于檢測(cè)單拷貝上（線粒體和Y染色體）的SNP，準(zhǔn)確度非常高，但由于PCR-RFLP分析受 到特定的自然酶切位點(diǎn)的限制，故在實(shí)際應(yīng)用中也有一定的局限性；PCR-SSCP技術(shù)簡(jiǎn)便、 快速、靈敏，但最后確定突變的位置和類型，還需進(jìn)一步測(cè)序，且電泳條件要求較嚴(yán)格，故多 用于DNA研宄中的未知基因突變的檢測(cè)和臨床實(shí)驗(yàn)；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢 測(cè)方法，簡(jiǎn)單且花費(fèi)較小，在未來(lái)的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是該方法需要設(shè) 計(jì)特別的引物，兩個(gè)反應(yīng)才能得到一個(gè)SNP位點(diǎn)的分型，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同 時(shí)由于兩個(gè)等位基因特異性引物只有末端堿基不同，有時(shí)候可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的擴(kuò)增，從而 產(chǎn)生誤檢；直接測(cè)序法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，但其檢測(cè)費(fèi)用極其昂貴，且需要有測(cè) 序儀等大型儀器，還需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，故對(duì)于在一段很短的序列上存在多 個(gè)SNP的檢測(cè)是有優(yōu)勢(shì)的，但不適用于生產(chǎn)實(shí)際；新型高通量SNP檢測(cè)技術(shù)，如SNP芯片、 GWAS和第二代測(cè)序等對(duì)于樣本量較小的實(shí)驗(yàn)研宄，成本過(guò)高，在生產(chǎn)實(shí)際中應(yīng)用較為局限； Forced-PCR-RFLP方法是一種檢測(cè)SNP的有效技術(shù)，與通常的PCR-RFLP分析原理相同，即在 發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯凝膠電泳分析，進(jìn) 而鑒別SNP位點(diǎn)，同時(shí)Forced-PCR-RFLP可以通過(guò)設(shè)計(jì)錯(cuò)配引物，進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而產(chǎn)生 新的酶切位點(diǎn)，克服了通常的PCR-RFLP分析受到特定的自然酶切位點(diǎn)的限制?？傊?，由于 PCR-RFLP技術(shù)和Forced-PCR-RFLP方法的聯(lián)合，不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi) 用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且對(duì)所檢測(cè)的序列位點(diǎn)無(wú)特殊性要求，因此，PCR-RFLP 和Forced-PCR-RFLP方法在育種工作中的受到青睞，在動(dòng)物分子育種的MS體系中具有廣 闊應(yīng)用前景。
[0006] 我國(guó)是傳統(tǒng)的養(yǎng)羊大國(guó)，也是目前世界上羊存欄數(shù)最多的國(guó)家。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和 人們生活水平的提高，社會(huì)對(duì)山羊產(chǎn)品的需求不斷加強(qiáng)，但由于近年來(lái)羊肉、羊奶等羊產(chǎn)品 嚴(yán)重短缺，所以山羊育種專家期望盡快培育出山羊產(chǎn)品的優(yōu)良品種。在高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效的 山羊育種目標(biāo)上，山羊育種專家一直關(guān)注生長(zhǎng)發(fā)育性狀，但僅靠傳統(tǒng)育種手段是不行的，還 需要依靠分子育種技術(shù)。即首先在DNA水平上篩查和檢測(cè)與山羊生長(zhǎng)發(fā)育性狀密切相關(guān)的 DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行基因多態(tài)性的檢測(cè)，最后是進(jìn)行基因多態(tài)性與生長(zhǎng)發(fā)育性狀的關(guān)聯(lián)分 析，從而實(shí)現(xiàn)MAS和實(shí)現(xiàn)早期診斷選擇。
[0007] AT模體結(jié)合因子I (AT motif-binding factor，ATBF1)起初是作為與人類K-甲胎 蛋白（AFP)基因的增強(qiáng)子中AT富含元件結(jié)合的蛋白被分離的，可與甲胎蛋白基因的增強(qiáng)子 中AT富含元件結(jié)合，抑制AFP基因的轉(zhuǎn)錄，是目前發(fā)現(xiàn)的分子量最大的反式作用因子。人 ATBFl基因定位于染色體16q22. 3_q23. 1，通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生ATBFl-A和ATBFl-B兩種轉(zhuǎn) 錄本。其中，ATBFl-A是ATBFl基因全長(zhǎng)的mRNA轉(zhuǎn)錄本所表達(dá)的蛋白質(zhì)，也是ATBFl基因 存在的主要形式，編碼404kD蛋白，3703個(gè)氨基酸，氨基酸序列中有4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域和23個(gè) 鋅指結(jié)構(gòu)，在這23個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)中包括1個(gè)假鋅指結(jié)構(gòu)模序；ATBFl-B是由于在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中， mRNA的剪接加工，使第1外顯子和第4外顯子連接所表達(dá)的蛋白質(zhì)，與ATBFl-A相比，在N 端缺少920個(gè)氨基酸和5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。
[0008] ATBFl不同的異構(gòu)體具有不同的調(diào)節(jié)作用。ATBFl-A能抑制AFP基因的增強(qiáng)子，可 誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡；而ATBFl-B則能激活A(yù)FP的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，促進(jìn)AFP的表達(dá)。目 前，ATBFl作為一個(gè)新的抑癌基因而被廣泛關(guān)注，主要集中在ATBFl異構(gòu)體的選擇性表達(dá)及 其調(diào)控機(jī)制上。有研宄表明，ATBFl在成體器官中都有表達(dá)，ATBFl的異常表達(dá)與很多人類 的慢性疾病有關(guān)。而且，ATBFl用于修復(fù)組織和保護(hù)細(xì)胞氧化應(yīng)激。已有研宄表明，ATBFl 可與PIAS3相互作用抑制STAT3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而STAT3在胚胎早期發(fā)育、細(xì)胞分化、后 哺乳期乳腺的發(fā)育等方面具有很重要的作用。Cha-Gyun Jung等（2005)揭示了 ATBFl可 使細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化。Yingchuan Qi等（2007)揭示，垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子 I(PIT-I)的早期激活需ATBFl的參與，ATBFl是一種新的垂體調(diào)節(jié)因子。眾所周知，PIT-I 基因在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，能調(diào)控生長(zhǎng)激素（GH)和催乳素（PRL)基因的 表達(dá)，對(duì)動(dòng)物泌乳和生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著遺傳效應(yīng)。由此可見(jiàn)，ATBFl對(duì)形成胚胎、調(diào)控生長(zhǎng) 激素和催乳素等具有重要的作用，故研宄中國(guó)地方羊ATBFl基因的遺傳變異和分子遺傳特 征具有重要的理論和實(shí)踐意義。
[0009] 目前，對(duì)ATBF1基因的研宄主要集中在與癌癥相關(guān)方面的研宄上，對(duì)中國(guó)地方山 羊ATBFl基因遺傳變異領(lǐng)域的研宄匱乏，該基因位點(diǎn)的功能研宄更是空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種山羊ATBFl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法及其應(yīng) 用，從而加快良種選育速度。
[0011] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0012] 一種山羊ATBFl基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0013] 以包含ATBF1基因的待測(cè)山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P1為引物，通過(guò)PCR 擴(kuò)增山羊ATBFl基因，用限制性內(nèi)切酶MspI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對(duì)酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物片段 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定山羊ATBFl基因第25748位的單核苷 酸多態(tài)性；所述引物對(duì)Pl為：
[0014] 上游引物：5' GCAAGAAGTGGGTGATCCAGACTGTTTCCC 3'（如 SEQ. ID. NO. 1 所示）
[0015] 下游引物：5' TCGCACCATCAAAGACAAC 3'（如 SEQ. ID. NO. 2 所示）
[0016] 或者，
[0017] 以包含ATBFl基因的待測(cè)山羊全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P2為引物，通過(guò)PCR 擴(kuò)增山羊ATBFl基因，用限制性內(nèi)切酶HpaII酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，然后對(duì)酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物片段 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定山羊ATBFl基因第163517位的單核苷 酸多態(tài)性；所述引物對(duì)P2為：
[0018] 上游引物：5' GACTCTTACCCAGCACGTACCCT 3'（如 SEQ. ID. NO. 3 所示）
[0019] 下游引物：5' TAACAGAAACCCACCATCCACAA 3'（如 SEQ. ID. NO. 4