cupin蛋白結(jié)構(gòu)域在制備α-淀粉酶抑制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及cupin蛋白結(jié)構(gòu)域在制備α -淀粉酶抑制劑中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 高等植物在種子成熟過程中能夠合成大量的貯藏蛋白并作為種子萌發(fā)過程中最 初的物質(zhì)和能量來源，其含量一般能夠占到種子中總蛋白的80%左右。種子中貯藏蛋白根 據(jù)溶解性不同將其分為溶于水的白蛋白、溶于稀鹽溶液的球蛋白、溶于乙醇/水混合物的 醇溶蛋白和溶于稀酸或稀堿的谷蛋白。某些貯藏蛋白能夠有效地抑制真菌和細(xì)菌的生長， 幫助植物抵抗外界病原體的侵染，對植物體的防御體系起到重要作用；貯藏蛋白除了能夠 為人類提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)外，其中一些蛋白還具有臨床應(yīng)用研宄價值，已有研宄表明植 物種子中一些貯藏蛋白屬于食物致敏原蛋白，能夠引起人體免疫反應(yīng)，如大豆、鷹嘴豆、黃 芥、蓖麻等植物種子中的一些貯藏蛋白能夠與過敏病人體內(nèi)的血清IgE抗體結(jié)合，引發(fā)過 敏反應(yīng)，所以對種子中貯藏蛋白功能的研宄具有重要的研宄和利用價值。
[0003] 蛋白類α-淀粉酶抑制劑廣泛分布存在于動物、植物和微生物體內(nèi)。植物在生 物進(jìn)化過程中由于不斷受到來自于昆蟲和病原微生物的侵害而進(jìn)化產(chǎn)生淀粉酶抑制劑 等生物防御物質(zhì)來提高自身的生存幾率，獲得生存進(jìn)化上的優(yōu)勢。在植物籽實(shí)中α-淀 粉酶抑制劑含量尤為豐富多樣，尤其在禾本科和豆科植物的種子果實(shí)中存在著多種類型 的蛋白類α-淀粉酶抑制劑，對植物本身起到重要的保護(hù)作用。植物來源蛋白類α-淀 粉酶抑制劑目前可分為六類：Kunitz_like、Knottin-like、Cereal-like、Lectin-like、 γ -Purothionin-Iike和Thaumatin-like。α -淀粉酶能夠?qū)⒌矸鬯鉃閱翁瞧咸烟亲鳛?機(jī)體吸收的能量來源，在人們?nèi)粘Ｉ钌攀持邪l(fā)揮著重要的作用。α -淀粉酶抑制劑能夠有 效地不同來源的α-淀粉酶結(jié)合形成酶-抑制劑的復(fù)合物，使α-淀粉酶活性喪失或降低 來阻礙食物中碳水化合物的水解和消化?；讦?淀粉酶抑制劑自身的特點(diǎn)，α-淀粉酶 抑制劑在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用前景，一方面α-淀粉酶抑制劑可以作為防治和 治療高血糖、糖尿病及高血脂等疾病的藥物，另一方面也可以應(yīng)用于日常生活中保健，控制 飲食，減少肥胖；同時α-淀粉酶抑制劑基因及產(chǎn)物對農(nóng)業(yè)昆蟲防治和減少殺蟲劑使用、保 護(hù)生態(tài)環(huán)境有重要的應(yīng)用價值。
[0004] 與其他蛋白家族相比，cupin結(jié)構(gòu)域蛋白家族是迄今為止發(fā)現(xiàn)的生物化學(xué)功能范 圍最廣的蛋白家族，cupin家族蛋白功能涉及到細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中碳水化合物修飾所需的 異構(gòu)酶與表異構(gòu)酶、植物種子中貯藏蛋白以及哺乳動物中轉(zhuǎn)錄因子等。目前初步將cupin 家族蛋白至少分為18個種類，但隨著對此家族蛋白的深入研宄，關(guān)于cupin蛋白更多的生 物功能將被陸續(xù)揭示，但在cupin結(jié)構(gòu)域蛋白中尚未有具有α -淀粉酶抑制劑活性的蛋白 種類得以相關(guān)研宄與報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的提供具有cupin結(jié)構(gòu)域的蛋白在制備α -淀粉酶抑制劑中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] cupin蛋白結(jié)構(gòu)域在制備α -淀粉酶抑制劑中的應(yīng)用。
[0008] 所述的α-淀粉酶優(yōu)選來源于哺乳動物、植物、昆蟲、真菌或細(xì)菌的α-淀粉酶； 進(jìn)一步優(yōu)選來源于人唾液的α-淀粉酶，來源于棉鈴蟲幼蟲唾液、中腸和血液中的α-淀粉 酶，來源于馬鈴薯甲蟲幼蟲唾液和中腸中的α-淀粉酶，來源于豬胰腺、玉米、枯草芽孢桿 菌或米曲霉的α -淀粉酶。
[0009] 所述的cupin蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)樘烊淮嬖诨蛉藶檫M(jìn)行改造的與cupin結(jié)構(gòu)具有相同或 相似性的蛋白結(jié)構(gòu)域。
[0010] cupin結(jié)構(gòu)是指由至少6個β -折疊片形成的桶狀結(jié)構(gòu)，cupin結(jié)構(gòu)域由兩個保守 的基本區(qū)域組成，每個區(qū)域中個含有兩個β折疊二級結(jié)構(gòu)，兩個基本保守區(qū)域之間通過一 段可變化的環(huán)狀結(jié)構(gòu)相連接；一個保守區(qū)域的基本構(gòu)成為G(X) 5HXH(X)mE(X)6G，另一個保 守區(qū)域基本構(gòu)成為G (X) 5PXG (X) 2H(X) 3Ν，但保守區(qū)域中的氨基酸在一些cupin家族蛋白中 表現(xiàn)出非保守性。
[0011] 所述的cupin蛋白結(jié)構(gòu)域來源于高等綠色植物、芽孢桿菌、子囊菌中，含有cupin 結(jié)構(gòu)域蛋白家族包括種子IlS和7S貯藏蛋白、萌發(fā)素以及多種功能性蛋白。
[0012] 所述的具有cupin結(jié)構(gòu)域的蛋白優(yōu)選來自鷹嘴豆IC藏蛋白Q9SMJ4蛋白。所述的 鷹嘴豆貯藏蛋白Q9SMJ4蛋白含有2個cupin結(jié)構(gòu)域，分別位于其α和β亞基鏈上，其結(jié) 構(gòu)域范圍分別為36-189aa和333-444aa。
[0013] 原核表達(dá)鷹嘴豆種子中具有cupin結(jié)構(gòu)的α -淀粉酶抑制劑蛋白CL-AI-α對來 源于人唾液、豬胰腺、玉米、枯草芽孢桿菌和米曲霉的α-淀粉酶表現(xiàn)出抑制作用，抑制率 分別為 71. 58%、74· 32%、67· 74%、53· 45%和 71. 11%。
[0014] 原核表達(dá)鷹嘴豆種子中具有cupin結(jié)構(gòu)的α -淀粉酶抑制劑蛋白CL-ΑΙ-α對 來源于棉鈴蟲幼蟲唾液、中腸和血液中的a -淀粉酶有抑制作用，抑制率分別為39. 09%、 68. 42%和96. 21%，表明對棉鈴蟲的防治有一定的利用價值。
[0015] cupin蛋白結(jié)構(gòu)域在制備防治昆蟲的制劑中的應(yīng)用。
[0016] cupin蛋白結(jié)構(gòu)域優(yōu)選來自鷹嘴豆IC藏蛋白Q9SMJ4蛋白的2個cupin結(jié)構(gòu)域。
[0017] 所述的昆蟲優(yōu)選馬鈴薯甲蟲，但還包括其他種類的昆蟲。
[0018] 原核表達(dá)鷹嘴豆種子中具有cupin結(jié)構(gòu)的a -淀粉酶抑制劑蛋白CL-AI-a對 來源于馬鈴薯甲蟲幼蟲唾液和中腸中的a -淀粉酶有抑制作用，抑制率分別為28. 71%、 55. 26 %，表明對馬鈴薯甲蟲的防治有一定的利用價值。
[0019] 用浸有原核表達(dá)鷹嘴豆種子中具有cupin結(jié)構(gòu)的a -淀粉酶抑制劑蛋白CL-AI的 葉片飼喂馬鈴薯甲蟲幼蟲能夠減緩幼蟲體重的增加從而抑制其生長發(fā)育，飼喂CL-AI-a、 CL-AI及CL-AI包涵體復(fù)性蛋白CL-AI (R)的馬鈴薯幼蟲體重沒有增加反而略有減輕，體重 分別減輕了 4. 38%、0. 83%和7. 77%，而飼喂CL-ΑΙ-β蛋白的幼蟲體重略有增加，其增加 率僅為0. 91% ;而對照組馬鈴薯幼蟲體重增加明顯，增加了 50. 62%，說明對馬鈴薯甲蟲田 間防治有一定的實(shí)用價值。
[0020] cupin蛋白結(jié)構(gòu)域在制備種子萌發(fā)抑制劑中的應(yīng)用。
[0021] 所述的cupin蛋白結(jié)構(gòu)域優(yōu)選來自鷹嘴豆IC藏蛋白Q9SMJ4蛋白的2個cupin結(jié) 構(gòu)域。
[0022] 所屬的種子包含但不限于水稻、玉米、小麥。
[0023] 用原核表達(dá)鷹嘴豆種子中具有cupin結(jié)構(gòu)的α -淀粉酶抑制劑蛋白CL-AI- α處 理發(fā)芽中的水稻、小麥及玉米種子，結(jié)果表明CL-ΑΙ-α蛋白對種子的發(fā)芽率影響不明顯， 但明顯地抑制種子萌動后的生長速度，種子根長和芽長相對于對照，都表現(xiàn)出明顯生長緩 慢的現(xiàn)象，而植株在干重和鮮重方面沒有太大差異，表明其在抑制種子發(fā)芽方面具有利用 價值。
[0024] 有益效果
[0025] 本發(fā)明針對一種IC藏蛋白類型α -淀粉酶抑制劑抑制活性相關(guān)結(jié)構(gòu)域（cupin)， 從理論與實(shí)踐中闡明IC藏蛋白類型α -淀粉酶抑制劑cupin結(jié)構(gòu)域與抑制活性之間的相關(guān) 性及此cupin結(jié)構(gòu)域引起蛋白具有α -淀粉酶抑制活性現(xiàn)象的普遍和廣泛性的科學(xué)問題， 首次從多個方面證明了 cupin結(jié)構(gòu)域與蛋白α -淀粉酶抑制活性之間的關(guān)系。
[0026] 本發(fā)明中提及的鷹嘴豆種子中貯藏蛋白類型α -淀粉酶抑制劑蛋白CL-AI蛋白及 α和β亞基中含有cupin結(jié)構(gòu)域并具有α-淀粉酶抑制活性，而cupin結(jié)構(gòu)域的缺失會使 抑制活性顯著降低或消失，效果明顯；同時針對CL-AI蛋白α亞基中cupin結(jié)構(gòu)保守區(qū)域 氨基酸點(diǎn)突變可以使其α-淀粉酶抑制活性顯著降低或改變其酶學(xué)特性，效果顯著；同時， 原核表達(dá)并純化的具有cupin結(jié)構(gòu)域的大豆Glycinin Gl和水稻Glutelin蛋白對人唾液 淀粉酶的抑制作用明顯，效果顯著，充分說明cupin結(jié)構(gòu)域與貯藏蛋白類型α -淀粉酶抑制 劑活性之間的相關(guān)性，以及此結(jié)構(gòu)域影響蛋白α -淀粉酶抑制活性的普遍性和廣泛性。
[0027] 本發(fā)明中提及的鷹嘴豆種子中貯藏蛋白類型α -淀粉酶抑制劑蛋白CL-AI蛋白對 棉鈴蟲幼蟲及馬鈴薯甲蟲幼蟲體內(nèi)的α -淀粉酶有明顯的抑制作用，活體飼喂試驗(yàn)說明其 能夠有效地抑制馬鈴薯甲蟲幼蟲體重的增加，減緩幼蟲的生長發(fā)育。此外，其還能夠抑制小 麥、玉米及水稻種子萌發(fā)過程中的根和芽的生長速度，明顯的減緩種子的萌發(fā)過程。
【附圖說明】
[0028] 圖I CL-AI-α蛋白對馬鈴薯甲蟲幼蟲生長的影響
[0029] A :體重變化圖；B :馬鈴薯甲蟲幼蟲生長圖
[0030] 圖2 CL-AI-α蛋白對小麥、玉米及水稻種子發(fā)芽的影響
[0031] A :小麥；B :水稻；C :玉米
[0032] 圖3 Cupin蛋白在自然界中分布情況，統(tǒng)計數(shù)據(jù)來源于EBI-EMBL數(shù)據(jù)庫
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 一、CL-AI全長及兩個亞基原核表達(dá)載體和系統(tǒng)的構(gòu)建
[0035] 1)以Desi型鷹嘴豆發(fā)育中種子的cDNA為模板，利用PCR技術(shù)在目的片段序列的 5'和3'端分別添加限制性酶切位點(diǎn)序列EcoR I和Not I，獲得目的基因片段；
[0036] CL-AI全長（CL-AI)引物序列為：
[0037] Fl :5' -CGGAATTCTTGAGAGATCAACCT-3' (SEQ ID NO. 1)
[0038] Rl :5, -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCAGCTGCTGCTTTGTT-3? (SEQ ID NO. 2)
[0039] CL-AI蛋白α -亞基引物序列為：
[0040] F2 :5' -CGGAATTCTTGAGAGATCAACCT-3' (SEQ ID NO. 3)
[0041] R2:5, -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCATTGTCTCTTTGGC-3' (SEQ ID NO. 4)
[0042] CL-AI蛋白β -亞基引物序列為：
[0043] F3 :5' -CGGAATTCGGGTTTGAGGAAACCAT-3' (SEQ ID NO. 5)
[0044] R3:5, -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCAGCTGCTGCTTTGTT-3? (SEQ ID NO. 6)
[0045] 2)利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I對步驟1中獲得的目的基因片段在37°C 條件下進(jìn)行4h酶切處理，用OMEGA離心柱式膠回收試劑盒回收處理過的DNA片段；
[0046] 3)將含pET_28a載體的DH5 α菌液接種到含Kan (50 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C條件下培養(yǎng)12h，收集菌液并用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒；
[0047] 4)利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I對pET_28a(+)原核表達(dá)載體質(zhì)粒在37°C 條件下進(jìn)行酶切4h，酶切體系參照限制性內(nèi)切酶使用說明書，膠回收處理過的質(zhì)粒DNA片 段；
[0048] 5)將步驟2)和步驟4)中獲得的已用限制性內(nèi)切酶處理過的DNA片段用T4連接 酶在16°C條件下連接12h，連接體系參照T4連接酶說明書；
[0049] 6)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，并將菌液涂布在含有Kan (50 μ g/mL) 的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性重組子，并將篩選到的重組子送華大基因測序確定構(gòu)建載體 序列的正確性；
[0050] 7)將獲