超穩(wěn)定免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的篩選和改造方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 以下公開涉及被稱作Tat相關(guān)蛋白質(zhì)改造工程（TAPE)的方法，通過將靶蛋白和抗 生素抗性蛋白融合到Tat信號序列并在大腸桿菌內(nèi)表達它，篩選具有更高的溶解性和優(yōu)異 的熱穩(wěn)定性的靶蛋白，特別是源自人種系的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域（VH或VL)。本發(fā)明還涉 及由TAPE法篩選的、具有優(yōu)異的溶解性和熱穩(wěn)定性的、人重鏈可變結(jié)構(gòu)域抗體（下文稱為 "VH結(jié)構(gòu)域抗體"）和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域抗體（下文稱為"VL結(jié)構(gòu)域抗體"）和人或改造的VH 和VL結(jié)構(gòu)域抗體支架。此外，以下公開內(nèi)容涉及VH和VL結(jié)構(gòu)域抗體和抗體支架的氨基酸 序列，以及編碼所述氨基酸序列的多核苷酸。
[0002] 在含有根據(jù)本發(fā)明篩選的人或改造的VH或VL支架的VH或VL結(jié)構(gòu)域抗體具有相 應(yīng)的人或改造的VH或VL結(jié)構(gòu)域抗體支架（不管CDR序列）的情況下，它仍保留溶解性和 熱穩(wěn)定性。
[0003] 此外，以下公開內(nèi)容涉及在由TAPE法篩選的人或改造的VH或VL結(jié)構(gòu)域抗體支架 中包括隨機CDR序列的文庫，以及其制備方法。
[0004] 此外，以下公開內(nèi)容涉及使用所述文庫篩選的、對靶蛋白質(zhì)具有結(jié)合能力的VH或 VL結(jié)構(gòu)域抗體，所述結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列，編碼所述氨基酸序列的多核苷酸。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 片段化的小尺寸抗體因為它與全長單克隆抗體（mAb)的不同理化性質(zhì)而是一種 能夠克服現(xiàn)有抗體療法的局限性的有前途的抗體。存在單鏈抗體（scFv)、Fab(片段抗體結(jié) 合）抗體、免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域抗體，例如VH或VL等作為一般抗體片段，以及串聯(lián)scFv、 雙抗體、微型抗體等作為其修飾形式（Betteretal.，Science1988 240 (4855): 1041-3; Hustonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1988 85 (16) : 5879-83；Birdetal.,Science 1988 242(4877) : 423-6；Peietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997 94 (18) : 9637-42 ； Iliadesetal.,FEBSLett. 1997 409 (3) :437-41；ffardetal.,Nature1989 341(6242):544-6)〇
[0007] 抗體片段或小尺寸的抗體與全長單克隆抗體相比主要是喪失了Fc(可結(jié)晶片段） 的功能，因此，沒有由于Fc的存在而產(chǎn)生的預(yù)期效果，如，增加的循環(huán)半衰期、效應(yīng)子功能 等。
[0008] 然而，小尺寸的片段化抗體被放大作為能夠克服由于現(xiàn)有完整抗體的 大尺寸造成的局限下一代抗體，所述局限例如對結(jié)構(gòu)上隱藏的表位的可及性、 藥物滲透和生物分布、形式靈活性、高生產(chǎn)成本等（Zhao et al.，Blood 2007 110 (7):2569-77 ；Holliger et al.,Nat.Biotechnol.2005 23 (9):1126-36 ；Hudson et al.,Med. Microbiol. Immunol. 2009 198(3):157-74 ；Enever et al.,Curr. Opin. Biotechnol. 200920(4):405-ll)。
[0009] 此外，各種抗體片段和小尺寸抗體的優(yōu)點在于可以通過化學方法或重組蛋白融合 的方法進行連接來實現(xiàn)雙重或多重特異性。
[0010] 近來，這種優(yōu)點已被用來引入多特異性，使得Fc功能被模塊化，從而補充了已被 指出作為缺點的效應(yīng)子功能和短的循環(huán)半衰期。例如，將對人血清白蛋白具有結(jié)合特異性 的片段或小尺寸抗體引入模塊中以實現(xiàn)雙特異性抗體，從而提高了循環(huán)半衰期，或?qū)γ?疫細胞，如自然殺傷或T細胞具有特異親合力的小尺寸抗體引入模塊中，從而賦予它細胞 殺傷功能（Elsetal.，JBiolChem. 2001 9 ;276 (10): 7346-50;Bargouetal.，Science 2008 321 (5891): 974-7;etal.，Mol.CancerTher. 20087 (8): 2288-97)。另外，由于單個抗 體可以被設(shè)計成向預(yù)期具有不同作用模式的兩個或更多個分子靶標賦予特異性，開啟了顯 著改善抗體的效力和經(jīng)濟可行性的可能性。
[0011] 人抗體結(jié)構(gòu)中具有抗原特異性結(jié)合功能的最小單元是重鏈可變結(jié)構(gòu)域（VH)或輕 鏈可變結(jié)構(gòu)域（VL)，這是定位在輕鏈或重鏈N-末端的可變結(jié)構(gòu)域。由于各自兩個N-末端 已進化成具有互補結(jié)構(gòu)，在從血漿B細胞生產(chǎn)單克隆抗體時組裝重鏈和輕鏈過程中，VH和 VL構(gòu)成非共價結(jié)合型復合體，從而保持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。人抗體可變結(jié)構(gòu)域VH節(jié)段根據(jù)在 框架部分的氨基酸序列的同源性被分為7個家族（VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7)，但不 包括CDR(互補決定區(qū)）結(jié)合表位，每個家族中含有3至22種不同的氨基酸序列。輕鏈的 VL分為Vk和VA，Vk分為六個家族而VA分為10個家族（〇1〇1:1113 6丨31.，1992]\]/[01. Biol.227, 799-917；Tomlinsonetal.,1995EMB0J. 14,4628-4638；ffilliamsetal. ,J. Mol.Biol. 264, 220-232)。人們已經(jīng)知道，一些VH和VL根據(jù)相互親和力的程度而具有優(yōu)選 的VH/VL配對組合，并且因此，已經(jīng)知曉基因的這種組合重排在擴大抗體庫的多樣性中起 重要作用（Ruudetal.，J.Mol.Biol. 1999, 285, 895-901)。
[0012] 根據(jù)6個⑶R的組合，結(jié)合型的VH/VL向特定抗原賦予互補結(jié)合特異性。輕 鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3和重鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3,共有6個⑶R，參與抗原的結(jié) 合。根據(jù)人類種系序列的分析，發(fā)現(xiàn)各種各自的CDR大多依賴于重鏈可變結(jié)構(gòu)域的 ⑶R3。因此，這一分析表明抗體的結(jié)合特異性主要取決于重鏈的⑶R3的可變性（J.Mol. Recogni. 2000, 13, 167-187)。
[0013] 與此不同，動物如駱駝和美洲駝以及具有軟骨骨架的魚如鯊魚具有單重鏈結(jié)構(gòu) 而沒有輕鏈結(jié)構(gòu)的抗體。因此，這些抗體的可變結(jié)構(gòu)域僅包括單個重鏈可變結(jié)構(gòu)域（對 于駱駝和鯊魚分別是VHH和VNAK)，并且公知的是這種抗體在抗原結(jié)合和中和功能方面不比 VH和VL同時參與抗原結(jié)合的人抗體差。除了在具有重鏈疾病的人類患者中，VH或VL單 獨很少存在（Hendershotetal.，J.Cell.Biol. 1987 104(3):761-7;Prellietal.，J. Immunol. 1992 148(3) :949-52)。其原因是VH或VL在VH或VL單獨分離時由于其結(jié)構(gòu)互補 體而在結(jié)構(gòu)上是不穩(wěn)定的，并且因此，可能容易發(fā)生蛋白質(zhì)聚集。已知的是這種蛋白質(zhì)聚集 部分地是由主要在VH和VL界面處分布的疏水性氨基酸殘基所造成的疏水性相互作用而引 起。不同于人抗體，在駱駝抗體的情況下，具有親水性的氨基酸殘基可以特別地定位在VH/ VL邊界區(qū)域的表面上。具體地，在駱駝抗體的四個位點處的氨基酸（它們是特異地與人VH3 家族的那些不同的）被稱為四分體。這些氨基酸位于Kabat編號系統(tǒng)的位置37、44、45和 47 處（Kabatetal.，1991J.Immunol. 147 (5) ,1709-1719)。在氛基酸序列中這種差異可以 解釋單可變結(jié)構(gòu)域抗體（VHH)的穩(wěn)定性。有人試圖通過將人可變結(jié)構(gòu)域抗體中在四分體位 置的氨基酸替換為駱駝抗體（G44E/L45R/W47G)的親水性氨基酸，產(chǎn)生改善的駱駝科抗體。
[0014] 結(jié)果是，從理化性質(zhì)的角度講它們的溶解性會有所改善（Coppieters etal.,ArthritisRheum. 2006 54 (6):1856-66；Dolketal.,Proteins. 2005 59(3) :555-64；Ewertetal. ,Biochem. 200241 (11) :3628-36；Korttetal.,J.Protein Chem. 199514 (3): 167-78;Martinetal.,ProteinEng. 1997 10 (5): 607-14)。然而，與 駱駝抗體相比難以得到它們的穩(wěn)定性，例如，降低的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)率和熱穩(wěn)定性O(shè)avies etal.,FEBSLett.1994Feb21 ；339 (3) :285-90；Airesetal. ,J.Mol.Biol.2004 340 (3) : 525-42)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，其理由是，在VH/VL邊界區(qū)域的氨基酸修飾會導致相應(yīng)區(qū)域的 0-折疊結(jié)構(gòu)的修飾（Riechmannetal.，J.Mol.Biol.l996 259(5):957-69)。與人抗體 相比較，駱駝單結(jié)構(gòu)域抗體的CDR3具有異常長的環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這種環(huán)結(jié)構(gòu) 折疊成人抗體的VH/VL邊界區(qū)域，并且已經(jīng)提出，這種獨特的結(jié)構(gòu)部分地遮蔽了位于邊界 區(qū)域中的疏水補丁，從而幫助穩(wěn)定駱蛇單結(jié)構(gòu)域抗體（Joostetal.，2010DrugDiscovery Today:Technologies7 (2), 139-14)〇
[0015] 在人類抗體中由于CDR3的相對較短的環(huán)結(jié)構(gòu)而難以預(yù)期該屏蔽作用。總之，與駱 駝單結(jié)構(gòu)域抗體相比，人單可變結(jié)構(gòu)域本身有缺陷的理化性質(zhì)，由此不足以被用作特定抗 原的結(jié)合配體的支架。作為克服這一點的方法，僅僅替換作為駱駝抗體的結(jié)構(gòu)特征的四分 體氨基酸是不夠的，進一步需要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計和VH或VL的定向進化。
[0016] 存在于自然界的人免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域（VH或VL)是能夠維持抗原結(jié)合特性的 最小尺寸的抗體（單克隆抗體大小的1/12)，因此，預(yù)計與常規(guī)的單克隆抗體在物理性質(zhì)和 作為治療性蛋白質(zhì)的治療效果方面不同。因此，開發(fā)僅具有一個可變結(jié)構(gòu)域的人抗體的需 求也增加了。然而，當VH或VL單獨存在時，蛋白質(zhì)的聚集和不穩(wěn)定傾向仍然是主要障礙， 應(yīng)該在開發(fā)特定抗原的結(jié)合支架時被克服。
[0017]因此，為了使抗體片段和小尺寸抗體提供一般的單克隆抗體不能實現(xiàn)的優(yōu)點并保 持本身的競爭力，確保物質(zhì)本身的穩(wěn)健的藥物和理