治療癌癥和纖維化疾病的化合物組合物和方法
【專利說明】治療癌癥和纖維化疾病的化合物組合物和方法
[0001] 本申請是申請日為2010年3月23日，申請?zhí)枮?01080012287. X，發(fā)明名稱為"治 療癌癥和纖維化疾病的化合物組合物和方法"的申請的分案申請。
[0002] 本申請要求2009年3月23日提交的美國臨時專利申請No. 61/162348的優(yōu)先權， 并且該申請在此通過引用整體并入本文。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明涉及靶向END0180多肽并由此內(nèi)化的分子、包含該分子的偶聯(lián)物、包含該 分子和偶聯(lián)物的組合物，以及使用它們將治療劑遞送至在細胞表面上表達END0180多肽的 細胞用以治療細胞增生性疾病或病癥以及纖維化并且用以控制（調(diào)控）腫瘤進展的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] END0180# 體
[0006] END0180也稱為⑶280、uPARAP(尿激酶纖溶酶原激活物受體相關蛋白）和2型甘 露糖受體C(MRC2)，它是指導所結合的配體在內(nèi)涵體內(nèi)降解的循環(huán)型胞吞受體。它是與尿激 酶型纖溶酶激活物（uPA)和尿激酶型纖溶酶激活物受體（uPAR)形成的三體復合物的一部 分，因而參與纖溶酶原至纖溶酶的生成過程。已知纖溶酶在胞外基質(zhì)（ECM)轉(zhuǎn)換和將休眠 型TGF-β至其活性形式的蛋白水解性轉(zhuǎn)化中起作用。
[0007] 三體復合物除了在產(chǎn)生纖溶酶中起作用之外，還顯示出參與基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)酶原的激活，作用于纖維蛋白以結合若干膠原蛋白，并參與胞外基質(zhì)的常規(guī)轉(zhuǎn)換。該 復合物還參與細胞粘附和信號轉(zhuǎn)導（Bherendt等，2000. JBC 275:1993-2002)。
[0008] END0180是通過促進細胞迀移并攝入膠原蛋白用于細胞內(nèi)降解而在細胞活動性 和胞外基質(zhì)重構中起作用的循環(huán)型胞吞受體（Niels. 2004 Biol Chem. 385(2):103-36; Kjoller 等，2004 Exp Cell Res.293 (l):106-16;Wienke 等，2007 Cancer Res. 67 (21) : 10230-40)。END0180與巨噬細胞甘露糖受體家族共享同源性，該家族包括 甘露糖受體、磷脂酶八2和 DEC-205/MR6(Isacke 等，1990 Mol. Cell. Biol. 10:2606-2618 ; Sheikh 等，2000, J. Cell. Sci. 113 :1021-1032 ;Behrendt 等，2000, J. Biol. Chem. 275 : 1993-2002)。此家族構成是基于總體結構保守性：大的胞外結構域包含N末端信號序列， 隨后是富含半胱氨酸的結構域，II型纖連蛋白結構域（FNII)和8或10個C型凝集素樣結 構域（CTLDs)以及小的跨膜和胞內(nèi)結構域（共約66個氨基酸）。作為一個家族，這些受體 具有兩個明顯特征：第一，盡管它們屬于大的C型凝集素超家族，但是它們?nèi)栽趩蝹€多肽骨 架中獨特地包含多個 CTLDs (Taylor M.E·，1997 Glycobiology 7 :v_vii;McKay 等，1998， Eur. J. Immunol. 28 :4071-4083 ;Howard 和 Isacke，2002,見上文）。第二，它們共享在細胞 的質(zhì)膜和胞間區(qū)室之間循環(huán)的能力（Isacke等，1990,見上文；Zvaritch等，1996, J. Biol. Chem. 271 :250-257)。在甘露糖受體家族中，END0180的不尋常之處在于它從質(zhì)膜靶向循環(huán) 的內(nèi)涵體而不是隨后的內(nèi)涵體/溶酶體區(qū)室（Howard和Isacke，2002,見上文）。
[0009] END0180 位于細胞表面上，被膜小窩（Isacke 等，1990M〇1. Cell. Biol. 10 : 2606-2618 ;Sheikh 等，2000, J. Cell. Sci. 113 :1021-1032)和內(nèi)涵體中。它主要表達 于成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞中。原位雜交顯示它表達于高度血管化的器官中。 END0180還發(fā)現(xiàn)于小鼠胚胎的骨形成區(qū)（Wu等，1996, J. Biol. Chem. 271:21323-21330)和 發(fā)育期間處于軟骨內(nèi)和膜內(nèi)骨化位置的成骨細胞和骨細胞中（Engelholm等，2001，Trends Cardiovasc. Med. 11:7-13) 〇
[0010] 以下的專利公布也涉及 END0180 受體：US 6, 117, 977、US 7, 399, 468、WO 97/40154和WO 00/58473。轉(zhuǎn)讓給本發(fā)明受讓人的并在此通過引用整體并入本文的PCT專 利公布No. WO 2004/100759以及美國專利公布No. 2007/0072244和2009/0202566涉及鑒 定能調(diào)控人END0180受體活性的化合物的方法。
[0011] 抗體療法
[0012] 對治療癌癥及其它疾病的新療法的尋求使人們開發(fā)了能抑制受體功能的人抗體 和人源化抗體。國際專利公布WO 2006/023491提供了 RNA干擾方法，其包括使細胞接觸融 合蛋白-雙鏈RNA復合物，該復合物包含含感興趣的雙鏈RNA的雙鏈RNA區(qū)段及為抗體Fab 片段-魚精蛋白融合蛋白的融合蛋白。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明部分基于對特異性結合細胞表面上的END0180多肽的分離的分子的鑒定。 在一些實施方案中，該分子結合END0180多肽的胞外結構域并通過所述多肽內(nèi)化到細胞 中，從而給表達END0180多肽的細胞提供用于遞送治療和診斷藥物（cargo)的媒介物。因 此在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含特異性結合END0180多肽的分子和治療劑以用于將 該治療劑遞送到細胞的偶聯(lián)物。在一些實施方案中，所述END0180多肽與SEQ ID NO: 2所 示的氨基酸序列具有基本同一性，由與SEQ ID NO: 1所示的核酸序列具有基本同一性的多 核苷酸編碼。
[0015] 一方面，本發(fā)明還提供抗END0180抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的重鏈⑶R3片段。
[0016] 在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段還可包含具有SEQ ID NO:8所示 的氨基酸序列的輕鏈CDR3片段。
[0017] 在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段可選自由以下組成的組：全IgG、 Fab片段、Fab'片段、F(ab'）2片段、其重鏈和/或輕鏈的可變部分、Fab微抗體和scFv。優(yōu) 選地，所述抗體包含SEQ ID N0:5所示的多肽序列。優(yōu)選地，所述抗體或抗原結合片段可為 人源化的。優(yōu)選地，所述抗體或抗原結合片段可為嵌合的。
[0018] 一方面，本發(fā)明提供由命名為E3-8D8的雜交瘤細胞系（BCCM登記號LMBP 7203CB) 產(chǎn)生的抗END0180抗體或該抗體的片段，其結合細胞表面上的END0180受體。在一些實施 方案中，抗體與受體的結合使抗體內(nèi)化到細胞中。本發(fā)明還提供了 E3-8D8雜交瘤細胞系。
[0019] 本發(fā)明還提供分離的抗END0180抗體或其抗原結合片段，由所述E3-8D8雜交瘤細 胞系分泌。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結合片段，與由所述E3-8D8雜交瘤細胞系分泌的抗 體結合相同的表位。
[0020] 在一些實施方案中，抗體或其片段是人源化的或嵌合的抗體或其片段。
[0021] 本發(fā)明提供包含至少一個抗END0180抗體或其片段（所述抗體由E3-8D8雜交瘤 產(chǎn)生）、或其人源化分子、嵌合抗體或其片段以及載體的組合物。
[0022] 在一些實施方案中，該分離的抗體選自由以下組成的組：全IgG、Fab片段、Fab'片 段、F(ab'）2片段、其重鏈和/或輕鏈的可變部分、Fab微抗體和scFv。在一些實施方案中， 所述抗體是包含具有SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列的重鏈CDR3結構域的重組多肽，或其 仍保留特異性結合END0180能力的變體。在一些實施方案中，所述抗體還包含具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列的輕鏈CDR3結構域，或其仍保留特異性結合END0180能力的變體。
[0023] 在一些實施方案中，所述抗體是包含SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列的scFv重組 多肽，或其仍保留特異性結合END0180能力的變體。在具體實施方案中，顯示與END0180受 體的結合親和力并包含SEQ ID NO: 7和8所示的CDR3結構域的抗體當與受體接觸時，由受 體內(nèi)化到表達END0180的細胞中。
[0024] 本發(fā)明還提供組合物，其包含至少一種如上所述的抗END0180抗體或其片段，和 包括放射性同位素、治療劑、細胞毒劑或可檢測標記的部分（moiety)。在一些實施方案中， 該部分共價地（通過接頭或化學鍵）或非共價地（通過離子、范德華力、靜電或氫鍵）與 抗體相連（或連接或偶聯(lián)）。
[0025] 在一些實施方案提供抗END0180抗體或其抗原結合片段，其選自以下：
[0026] a)由雜交瘤細胞系E3-8D8 (BCCM登記號LMBP 7203CB)產(chǎn)生的單克隆抗體；
[0027] b)與（a)中的抗體結合相同表位的抗體或其片段；
[0028] c) (a)或（b)的人源化抗體；
[0029] d)包含與SEQ ID NO :6基本相似的多肽的抗體片段；和
[0030] e)包含氨基酸序列與SEQ ID NO:7和8所示的氨基酸序列基本相似的⑶R3的重 組多肽。
[0031]