衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC#1和#2)在通 常條件（對(duì)照）、添加鈣的條件（Ca 2+)、低氧條件和CMH條件下培養(yǎng)后干性（sternness)標(biāo)志 物0ct4和nanog以及衰老標(biāo)志物P16的mRNA表達(dá)水平。
[0026] 圖8示出了在通常條件（對(duì)照）和CMH條件下傳代后用SA-0 -gal染色的臍帶 血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞的照片（上），以及臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞在通常條件（對(duì)照）、添 加鈣的條件（Ca 2+)、低氧條件和CMH條件下培養(yǎng)后根據(jù)培養(yǎng)條件描繪的0-gal活性的圖 (下）。
[0027] 圖9示出了在誘導(dǎo)培養(yǎng)在通常條件（對(duì)照）和CMH條件下的細(xì)胞以使其分化成軟 骨和骨后，來(lái)源于兩種不同來(lái)源的臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC#1和#2)的照片。
[0028] 圖10示出了這樣的圖，其說(shuō)明了培養(yǎng)在通常條件（對(duì)照）和CMH條件下的兩種不 同臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC#1和#2)是否刺激應(yīng)答細(xì)胞（responding cell) (A)，其中 A、B和H分別表示應(yīng)答細(xì)胞、刺激細(xì)胞和PHA。
[0029] 圖11示出了由培養(yǎng)在圖10條件下之臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC#1和#2)釋 放的PGE 2 (前列腺素E2)的水平的圖。
[0030] 圖12是示出了由在通常條件（對(duì)照）和CMH條件下培養(yǎng)24小時(shí)之4種不同臍帶 血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC#1至#4)釋放的Tsp-2的水平的圖。
[0031] 發(fā)明詳述
[0032] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方 法包括在2 %至5 %氧氣的低氧條件下于含有濃度為2. 1至3. 8mM的鈣和濃度為1. 0至 3. OmM的鎂的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0033] 本發(fā)明的培養(yǎng)方法可適用于多種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。可用于本發(fā)明的間充質(zhì)干 細(xì)胞的實(shí)例包括來(lái)源于臍帶血、骨髓、脂肪、肌肉、皮膚、羊水、臍帶或牙齒的那些，但不限于 此。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)方法適用于臍帶血衍生的間充質(zhì)干細(xì) 胞。
[0034] 另外，可應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)方法的間充質(zhì)干細(xì)胞可來(lái)源于多種對(duì)象。例如，可用于本 發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞可獲自哺乳動(dòng)物（包括人），但不限于此。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 案中，使用人來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0035] 本發(fā)明培養(yǎng)方法的主要特征在于使用含有濃度為2. 1至3. 8mM的鈣和濃度 為1. 0至3. OmM的鎂的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可通過(guò)調(diào)節(jié)鈣和鎂的濃度由用于干細(xì)胞的典型 培養(yǎng)基制備。典型培養(yǎng)基的實(shí)例包括Dulbecco改良eagle培養(yǎng)基（DMEM)、最小必需培 養(yǎng)基（MEM)、a -MEM、McCoys 5A 培養(yǎng)基、eagle 基本培養(yǎng)基、CMRL(Connaught Medical Research Laboratory)培養(yǎng)基、Glasgow 最小必需培養(yǎng)基、Ham F-12 培養(yǎng)基、IMDM(Iscove 改良 Dulbecco 培養(yǎng)基）、Leibovitz L-15 培養(yǎng)基、RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640培養(yǎng)基、培養(yǎng)基199和Hank培養(yǎng)基199,但不限于此。
[0036] 任選地，培養(yǎng)基可以含有或可不合血清。另外，可在培養(yǎng)基中使用血清替代物而不 是血清。
[0037] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有5%至30%的胎牛血清（FBS)。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有血清替代物。除了市售產(chǎn)品外，可使用人血清或人血小板裂解物中 的多種生長(zhǎng)因子（包括H)GF、TGF、IGF)和這些蛋白質(zhì)家族的細(xì)胞因子可用作血清替代物。
[0038] 在本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，鈣用于促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、抑制免疫原性并刺激 細(xì)胞因子分泌。在這點(diǎn)上，可以在培養(yǎng)基中使用2. 1至3. 8mM的濃度、優(yōu)選3. 3至3. 8mM的 濃度、并且更優(yōu)選約3. 6mM的濃度的鈣。例如，當(dāng)使用a -MEM作為培養(yǎng)基時(shí)，可以添加0. 3 至2. OmM的濃度、優(yōu)選1. 5至2. OmM的濃度、并且更優(yōu)選約1. 8mM的濃度的鈣，這是因?yàn)榕?養(yǎng)基已經(jīng)含有1.8mM的鈣。同樣地，考慮到培養(yǎng)基自身的鈣濃度，可減去典型培養(yǎng)基的鈣濃 度容易地計(jì)算待添加的鈣濃度，以獲得實(shí)施本發(fā)明培養(yǎng)方法所需的期望濃度。
[0039] 在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，使用鎂來(lái)防止鈣的沉淀?？梢栽谂囵B(yǎng)基中使用1. 0至3. OmM 的濃度、并且優(yōu)選約1. 8mM的濃度的鎂。例如，當(dāng)鎂在培養(yǎng)基中以小于1. OmM的濃度存在時(shí)， 鈣傾向于沉淀。另一方面，培養(yǎng)基中高于3. OmM的鎂濃度可能阻斷胞外基質(zhì)（ECM)的形成， 干擾細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部的附著，從而使得其易受剪切應(yīng)力的影響，并且提高細(xì)胞內(nèi)的礦化。 例如，當(dāng)使用a -MEM作為培養(yǎng)基時(shí)，可添加0. 2至2. 2mM的濃度，并且優(yōu)選1. OmM的濃度的 鎂，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中已經(jīng)含有〇. 8mM鎂。同樣地，考慮到培養(yǎng)基自身的鎂濃度，可減去典型培 養(yǎng)基的鎂濃度容易地計(jì)算待添加的鎂濃度，以獲得實(shí)施本發(fā)明培養(yǎng)方法所需的期望濃度。
[0040] 因此，根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的培養(yǎng)基可基于補(bǔ)充有5%至30%胎牛血清 (FBS)、0. 3至2. OmM鈣和0. 2至2. 2mM鎂的a -MEM，以使得鈣和鎂分別總計(jì)為2. 1至3. 8mM 和1. 0至3. OmM的總量。
[0041] 此外，本發(fā)明培養(yǎng)方法的另一個(gè)特征在于間充質(zhì)干細(xì)胞的低氧培養(yǎng)條件。與常氧 氣條件相比，低氧條件促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，并且抑制免疫原性并刺激細(xì)胞因子分泌。 在此情形上，低氧條件是氧氣含量為2%至5%的氣氛。氧氣濃度低于2%或高于5%時(shí)的 問(wèn)題是間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖顯著降低。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，間充質(zhì)干細(xì)胞培 養(yǎng)在約3%氧氣的氣氛中?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞孵育器的氧氣濃度來(lái)達(dá)到低氧條件。例如，可用 氮?dú)猓?00% )或氮?dú)?二氧化碳（95% /5% )凈化孵育器以將常氧氣氛調(diào)節(jié)為低氧氣氛。 可通過(guò)安裝在孵育器上的氧傳感器來(lái)監(jiān)測(cè)孵育器中的氧氣條件。
[0042] 除了本發(fā)明的前述條件外，可以以常規(guī)方式培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。例如，可在三維生 物反應(yīng)器或旋轉(zhuǎn)器（spinner)或典型貼壁培養(yǎng)容器中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0043] 當(dāng)鈣和鎂的濃度的主要特征與低氧條件的次要特征組合時(shí)，可獲得協(xié)同效應(yīng)。即， 與單獨(dú)條件相比，鈣和鎂的濃度與低氧條件的組合允許間充質(zhì)干細(xì)胞更加有效地增殖，同 時(shí)進(jìn)一步提高對(duì)免疫原性的抑制和對(duì)細(xì)胞因子分泌的刺激。例如，與單獨(dú)條件相比，在組合 條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)一步增殖1. 5至5倍，免疫原性降低1至3倍，并且細(xì)胞因子分泌增 加1. 5至3倍。用于本發(fā)明培養(yǎng)方法的組合條件被稱為"CMH條件"（鈣+鎂+低氧條件）。
[0044] 本發(fā)明的培養(yǎng)方法可應(yīng)用于間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代。換言之，使用本發(fā)明培養(yǎng)方法 培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞可以以相同的方式傳代培養(yǎng)。通過(guò)使間充質(zhì)干細(xì)胞更有效地增殖，本 發(fā)明的培養(yǎng)方法具有即使進(jìn)行更少傳代也能產(chǎn)生更多數(shù)目之間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。例如， 在接種相同數(shù)目的細(xì)胞并且每一代的持續(xù)時(shí)間統(tǒng)一的情況下培養(yǎng)5代后，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明培養(yǎng) 方法產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目的是常規(guī)方法的100至1000倍。
[0045] 另外，通過(guò)本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞不僅無(wú)免疫原性因而不引起免疫 應(yīng)答，而且還可有效用作人的細(xì)胞治療劑或軟骨再生劑。
[0046] 因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，預(yù)期使用所述培養(yǎng)方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞具 有改善的增殖能力、生存力、回收率和免疫學(xué)特性。改善的免疫學(xué)特性包括