用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于有效培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 術(shù)語(yǔ)"干細(xì)胞"是在胚胎、胎兒和成人的組織中發(fā)現(xiàn)的一種未分化類型的體細(xì)胞的 總稱，其具有分化成多種特定細(xì)胞類型的潛力。干細(xì)胞的特征在于：能夠通過(guò)多個(gè)細(xì)胞分裂 周期（同時(shí)保持未分化狀態(tài)）的自我更新，能夠響應(yīng)于特定刺激（環(huán)境）而分化成特定細(xì) 胞類型的潛能，以及甚至是能夠跨過(guò)譜系屏障（lineage barrier)并采取相對(duì)于其他組織 獨(dú)特的表達(dá)譜和細(xì)胞功能表型的可塑性。
[0003] 可根據(jù)多種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)干細(xì)胞分類。根據(jù)潛能可將干細(xì)胞分為：多潛能干細(xì) 胞（pluripotent stem cell)、多能干細(xì)胞（multipotent stem cell)和單能干細(xì)胞 (unipotent stem cell)。多潛能干細(xì)胞具有分化成任意類型細(xì)胞的多潛能性。最近受到 科學(xué)家強(qiáng)烈關(guān)注的胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell， iPS)是多潛能干細(xì)胞的代表。成體干細(xì)胞（adult stem cell)表現(xiàn)出多能性和單能性。其 中包括造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等。
[0004] 盡管對(duì)在細(xì)胞治療中利用人胚胎干細(xì)胞的多潛能性進(jìn)行了許多嘗試，但是依然保 持著腫瘤發(fā)生和免疫排斥反應(yīng)的高可能性，并且這是難以克服的障礙。
[0005] 最近已經(jīng)建議將誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）作為這些問(wèn)題的解決方案。iPS 細(xì)胞是通過(guò)重編程由已分化的成年體細(xì)胞人工衍生的一類多潛能干細(xì)胞。由于其完全來(lái)自 患者，因此iPS細(xì)胞可避免免疫排斥反應(yīng)的問(wèn)題，但是，iPS細(xì)胞的腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)依然是需 要解決的問(wèn)題。
[0006] 作為替代選擇，正推進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用并且沒(méi)有表 現(xiàn)出腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞是可分化成多種細(xì)胞類型的多能干細(xì)胞，所述多種細(xì)胞 包括脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島0 細(xì)胞、血管細(xì)胞等，并且已知具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能。
[0007] 間充質(zhì)干細(xì)胞可分離自多種組織（例如骨髓、臍帶血、脂肪組織等），但是并沒(méi)有 對(duì)其進(jìn)行充分定義，因?yàn)楦鶕?jù)間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的來(lái)源，其彼此的細(xì)胞表面標(biāo)志物具有一 些差異。大體上，如果它們可分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞，具有紡錘狀形態(tài)，并且 表達(dá)表面標(biāo)志物⑶73 (+)、⑶105 (+)、⑶34 (-)和⑶45 (-)，則將這種干細(xì)胞定義為間充質(zhì)干 細(xì)胞。在這種情形下，不同遺傳來(lái)源和/或背景的間充質(zhì)干細(xì)胞彼此在其定義（即，間充質(zhì) 干細(xì)胞的定義）方面不具有顯著差異，但是彼此通常在體內(nèi)活性方面具有差異。另外，當(dāng)使 用間充質(zhì)干細(xì)胞作為外源細(xì)胞治療劑時(shí)，有限的間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)（pool)并不允許進(jìn)行許 多選擇和可用選擇，甚至不顧低的體內(nèi)活性。
[0008] 另外，對(duì)于用作再生醫(yī)學(xué)和/或細(xì)胞療法中的細(xì)胞治療劑的間充質(zhì)干細(xì)胞，所需 的間充質(zhì)干細(xì)胞的最小數(shù)目為約1X10 9個(gè)細(xì)胞。在實(shí)踐中，考慮到用于設(shè)置合適條件和測(cè) 定標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)，最小數(shù)目還進(jìn)一步增加。由多種來(lái)源供應(yīng)這樣數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞需要至 少十個(gè)體外傳代。但是，在這種情況下，細(xì)胞變得衰老和變形，使得其不適合用作細(xì)胞治療 劑。
[0009] 因此，需要有效地大量產(chǎn)生間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
[0010] 用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法描述在韓國(guó)專利早期公開(kāi)No. 2003-0069115 以及文獻(xiàn)[Pittinger MF 等 Science，284 :143-7,1999 ;Lazarus HM 等 Bone Marrow Transplant，16 :557-64,1995 ;和 Kern 等，Stem Cells，24 :1294-1301，2006]中，但是發(fā)現(xiàn) 難以保證可用于大量生產(chǎn)的細(xì)胞的數(shù)目。另外，這些方法有每次傳代降低具有增殖能力的 間充質(zhì)干細(xì)胞之?dāng)?shù)目的缺點(diǎn)。例如，臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞在9~10代后將不能增殖 而是迅速老化，并且在骨髓或脂肪衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（lipid-derived mesenchymal stem cell)中，這種現(xiàn)象在5~6代后被發(fā)現(xiàn)。因此，需要與常規(guī)方法相比以更高簡(jiǎn)化和更高經(jīng) 濟(jì)效益的方式使間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)目增加到足夠工業(yè)應(yīng)用之程度的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于有效培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過(guò)所述方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述間充質(zhì)干細(xì) 胞表現(xiàn)出優(yōu)異的增殖能力和免疫學(xué)特性。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含所述間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞治療劑。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包括在 2%~5%氧氣濃度的低氧條件（hypoxiccondition)下于含有濃度為2. 1至3. 8mM的媽和 濃度為1. 〇至3.OmM的鎂的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了通過(guò)所述方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞，其具有改 善的增殖能力、生存力、回收率（recovery rate)和免疫特性。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含本發(fā)明之間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞治療劑。
[0017] 本發(fā)明的培養(yǎng)方法通過(guò)提高間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力和生存力可在甚至很少的 傳代數(shù)內(nèi)增加間充質(zhì)干細(xì)胞的群。另外，通過(guò)本發(fā)明培養(yǎng)方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞不僅由 于其缺乏免疫原性可有效用作安全的細(xì)胞治療劑，而且由于其優(yōu)異的細(xì)胞因子分泌作用而 可作為軟骨再生藥物。
[0018]附圖簡(jiǎn)沐
[0019] 圖1A和1B是示出了來(lái)源于兩種不同來(lái)源的臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC#1和 MSC#2)在鈣離子濃度為1. 8至9. 3mM的a-MEM中培養(yǎng)后第7天時(shí)的相對(duì)于接種細(xì)胞計(jì)數(shù) 的細(xì)胞計(jì)數(shù)倍數(shù)（上）以及直到21天的累積細(xì)胞計(jì)數(shù)（下）的圖。在上圖中，P1至P3表 示傳代數(shù)。
[0020] 圖2A和2B是示出了來(lái)源于兩種不同來(lái)源的臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC#1和 MSC#2)在1. 8至3. 6mM的總鈣濃度的存在下培養(yǎng)7天后的細(xì)胞計(jì)數(shù)（上）以及在1. 8mM至 4. 4mM的總鈣濃度的存在下培養(yǎng)6天后的細(xì)胞計(jì)數(shù)（下）的圖。
[0021] 圖3A和3B是示出了當(dāng)來(lái)源于兩種不同來(lái)源的臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC#1 和MSC#2)在多種氧氣條件（正常、3%和5%)下培養(yǎng)時(shí)的倍增時(shí)間（上）以及臍帶血衍生 間充質(zhì)干細(xì)胞在所述氧氣條件下培養(yǎng)后直到21天的累積細(xì)胞計(jì)數(shù)（下）的圖。在上圖中， P1至P3表示傳代數(shù)。
[0022] 圖4示出了臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC#1)在通常條件（對(duì)照）、增加的鈣條件 (Ca2+)、低氧條件和CMH條件下培養(yǎng)后的倍增時(shí)間（上）和累積細(xì)胞計(jì)數(shù)（下）。在每幅圖 中，P5至P12代表傳代數(shù)，并且CMH條件意指添加鈣和鎂的條件和低氧條件的組合。
[0023] 圖5示出了臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞在通常條件（對(duì)照）、添加鈣的條件（Ca2+)、 低氧條件和CMH條件下培養(yǎng)后1和2天的細(xì)胞生存力（上圖）和回收率（下圖）。
[0024] 圖6A和6B示出了臍帶血衍生間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC#1至#4)在通常條件（對(duì)照） 和CMH條件下培養(yǎng)后的倍增時(shí)間（上）和累積細(xì)胞計(jì)數(shù)（下）。在每幅圖中，P1至P9代表 傳代數(shù)。
[0025] 圖7示出了來(lái)源于兩種不同來(lái)源的臍帶血