羊水間充質干細胞的原代分離培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)技術領域，尤其涉及羊水間充質干細胞的原代分離培養(yǎng)方 法。
【背景技術】
[0002] 干細胞是一類具有自我復制能力和多向分化潛能的原始未分化細胞，處于未定向 分化狀態(tài)并具有增殖能力。在特定條件下，干細胞可分化成不同類型的具有特征性形態(tài)、特 異分子標志和特殊功能的成熟細胞。根據(jù)干細胞來源的不同可分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC)和來源于出生后器官或成年個體組織的組織干細胞或成體干細胞（adult stem cell，ASC)。從來源看，要獲取大量干細胞較困難。因此，尋找新的干細胞源成為熱 點。
[0003] 近年研宄表明：羊水（amniotic fluid，AF)中存在干細胞，可以分化為多種成體 細胞，有望成為一種新的干細胞來源，且可避免ESC的倫理問題以及ASC的局限性。羊水干 細胞（amniotic fluid-derived stem cell，AFS)可通過AF穿刺獲取，較ESC易獲取。羊 水細胞比其它普通類型的細胞有著很多優(yōu)點：首先，正常情況下羊水細胞在孕婦臨產前就 能夠被提取。其次，羊水混合物中所包含細胞的"年齡"都比較小，因此這些細胞遭受周圍 環(huán)境引起的誘發(fā)突變的可能性就很小，從遺傳學角度來說它們會更穩(wěn)定。
[0004] 羊水中含有較多類型的細胞，如內皮細胞等，在分離和培養(yǎng)的過程中需要去除。目 前，對羊水干細胞的分選多采用免疫磁珠分選法，但該方法對細胞活性存在一定影響，且費 用較高。還有些方法采用機械分離，但人為刮除內皮細胞的方法操作十分繁瑣且極易引起 污染，并且，極易造成細胞的損傷，導致細胞活性的降低。

【發(fā)明內容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供羊水間充質干細胞的原代分離培養(yǎng) 方法；本發(fā)明提供的方法利用差速貼壁原理，簡化了操作，獲得的干細胞純度較高，活性良 好，經傳代后仍保持良好的干性。
[0006] 本發(fā)明提供的羊水間充質干細胞的原代分離培養(yǎng)方法包括：
[0007] 步驟1 :明膠鋪板后接種羊水組織細胞，培養(yǎng)llh~13h后轉移培養(yǎng)液；
[0008] 步驟2 :將所述培養(yǎng)液培養(yǎng)至細胞融合率不低于85 %，獲得初步純化的細胞；
[0009] 步驟3 :將所述初步純化的細胞重懸，培養(yǎng)3h~5h后，更新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至細 胞貼壁，棄除培養(yǎng)液，獲得羊水間充質干細胞。
[0010] 本發(fā)明提供的方法，利用差速貼壁原理，在適宜條件下，使內皮細胞先貼壁生長。 本發(fā)明準確控制培養(yǎng)時間，待內皮細胞貼壁完成后，轉移包含羊水間充質干細胞的培養(yǎng)液。 對培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)后獲得羊水間充質干細胞。本發(fā)明提供的方法操作簡單，無需更多 的儀器，且無需人為刮除的操作，避免了細胞的損傷和污染。檢測結果表明，步驟1中獲得 的培養(yǎng)液中所包含的羊水間充質干細胞的活力不低于89. 28%，經傳代3代，流式細胞檢測 結果表明，其表面抗體仍符合干細胞特性，未見分化趨勢。
[0011] 在本發(fā)明的實施例中，步驟1中接種的羊水組織細胞密度為5X105個/mL。
[0012] 在本發(fā)明的實施例中，步驟1中接種羊水組織細胞的量為2mL。
[0013] 步驟1中接種密度和細胞量直接影響細胞增殖速率和貼壁效果，密度過高則內皮 細胞不能完全貼壁，而密度過低則細胞貼壁速度過緩，影響細胞活力。
[0014] 在本發(fā)明的實施例中，步驟1中培養(yǎng)的培養(yǎng)基為Lonza完全培養(yǎng)基；步驟1中培養(yǎng) 的溫度為37°C，5%C02、濕度為95%。
[0015]Lonza完全培養(yǎng)基包括：無血清培養(yǎng)基（LonzaUltra⑶LTURETM)、血清替代物 (PALLUltroserG)、谷氨酰胺和NEAA。
[0016] 其中，血清代替物的質量分數(shù)為10%。
[0017] 谷氨酰胺的質量分數(shù)為1%。
[0018] NEAA的質量分數(shù)為1 %。
[0019] 明膠可促進細胞貼壁，明膠鋪板的方法為：向細胞培養(yǎng)板中加入質量分數(shù)為 〇. 1 %的明膠溶液，lmL/孔，常溫下孵育30min，結束后棄去明膠溶液。
[0020] 在本發(fā)明的實施例中，步驟1中所述培養(yǎng)的時間為12h。
[0021] 在本發(fā)明的實施例中，步驟2中培養(yǎng)的時間為72h。
[0022] 在本發(fā)明的實施例中，步驟3中重懸至細胞密度為IX105個/mL。
[0023] 在本發(fā)明的是實施例中，步驟3重懸采用Lonza完全培養(yǎng)基；步驟3中所述培養(yǎng)的 溫度為37°C，5%C02、濕度為95%。
[0024] 在一些實施例中，重懸具體為：將初步純化的細胞經胰酶酶解后，以Lonza完全培 養(yǎng)基重懸。
[0025] 作為優(yōu)選，胰酶酶解的酶解液中，胰酶的質量分數(shù)為0. 25%，EDTA的質量分數(shù)為 0? 02%〇
[0026] 在一些實施例中，步驟3中培養(yǎng)在平皿中進行，培養(yǎng)量為8mL。
[0027] 在一些實施例中，步驟3所述培養(yǎng)的時間為4h，繼續(xù)培養(yǎng)的時間為120h。
[0028] 在一些實施例中，步驟3中更新培養(yǎng)基具體為，棄除平皿中的上清液，加入新的 Lonza完全培養(yǎng)基。
[0029] 加入新的Lonza完全培養(yǎng)基的量為8mL。
[0030] 在一些實施例中，羊水組織細胞的獲取方法為：將羊水離心后取沉淀，以PBS緩沖 液洗滌，獲得羊水組織細胞。
[0031] 優(yōu)選的，羊水為剖腹產產婦的羊水。
[0032] 優(yōu)選的，離心的速度為2000rpm，時間為5min。
[0033] PBS緩沖液洗滌的體積為40mL。
[0034] 在本發(fā)明的實施例中，本發(fā)明分離培養(yǎng)的羊水組織細胞為人羊水組織細胞。
[0035] 本發(fā)明提供的方法，利用差速貼壁原理，在適宜條件下，使內皮細胞先貼壁生長， 而此時間充質干細胞尚未貼壁。本發(fā)明準確控制培養(yǎng)時間，待內皮細胞貼壁完成后，轉移 包含羊水間充質干細胞的培養(yǎng)液。對培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)后獲得羊水間充質干細胞。本 發(fā)明提供的方法操作簡單，無需更多的儀器，且無需人為刮除的操作，避免了細胞的損傷和 污染。檢測結果表明，步驟1中獲得的培養(yǎng)液中所包含的羊水間充質干細胞的活力不低于 89. 28%，經傳代3代，流式細胞檢測結果表明，其表面抗體仍符合干細胞特性，未見分化趨 勢。
【附圖說明】
[0036] 圖l_a示實施例1經原代培養(yǎng)（24h)后的貼壁細胞形態(tài)，放大4倍；
[0037] 圖l_b示實施例1經原代培養(yǎng)（72h)后的貼壁細胞形態(tài)，放大4倍；
[0038] 圖2示實施例1和對比例1~2細胞增殖曲線；其中，線1示實施例1的細胞增殖 曲線；線2示對比例1的細胞增殖曲線，線3示對比例2的細胞增長曲線；
[0039] 圖3-a示同型對照抗體檢測實施例1制得的第3代羊水間充質干細胞的結果；分 別表示了所檢測的細胞數(shù)量；以及根據(jù)對照組細胞所設定抗體⑶73、⑶90、⑶105、HLA-DR、 CD45、CD34 的門；
[0040]圖3-b示實施例1制得的第3代示羊水間充質干細胞的流式檢測結果；分別表達CD73、CD90、CD105、HLA-DR、CD45、CD34 的細胞含量。
【具體實施方式】
[0041] 本發(fā)明提供了羊水間充質干細胞的原代分離培養(yǎng)方法，本領域技術人員可以借鑒 本文內容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技 術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較 佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內容】
、精神和范圍內對本文的方法 和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
[0042] 本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0043] 下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0044] 實施例1
[0045] 本發(fā)明提供的羊水間充質干細胞的純化過程具體為：
[0046] -、原代培養(yǎng)：
[0047] 1、取剖腹產產婦的羊水，用無菌容器盛裝后，放入超凈臺中。
[0048] 2、把羊水分裝至50mL離心管中，2000rpm離心5min，棄上清。
[0049] 3、每個50mL離心管中加入40mLPBS進行重懸，2000rpm離心5min，棄上清。
[0050] 4、往六孔板中加入0. 1 %明膠，lmL/孔，常溫下孵育30min，結束后棄去明膠溶液。
[0051] 5、用lonza完全培養(yǎng)基重懸沉淀，調整細胞密度為5X105cell/mL，接種至孵育過 明膠的六孔板中，2mL/孔；轉移至細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。
[0052] 6、培養(yǎng)12h后，將培養(yǎng)液轉移至新的六孔板中（切勿吹打，貼壁的均為內皮細胞）， 轉移至細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。
[0053] 7、24h后觀察到貼壁的細胞多為間充質干細胞（倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，圖 l_a)，共培養(yǎng)72h(倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，圖1-b)。
[0054] 二、傳代培養(yǎng)：
[0055] 待原代細胞融合率達85 %時，用0.25 %胰酶-0.02%EDTA進行酶解傳代。
[0056] 調整細胞密度為lX105cell/mL，接種8mL至9cm平皿中，轉移至細胞培養(yǎng)箱進行 培養(yǎng)4h。
[0057] 4h后，取出平皿，吸棄上清，加入新lonza完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
[0058] 繼續(xù)培養(yǎng)4h至細胞貼壁，棄除培養(yǎng)液，貼壁的細胞為進一步純化的間充質干細 胞。
[0059] 經檢測，間充質干細胞純度為99. 3%。
[0060] 實施例2
[0061] 本發(fā)明提供的羊水間充質干細胞的純化過程具體為：
[0062] -、原代培養(yǎng)：
[0063] 1、取剖腹產產婦的羊水，用無菌容器盛裝后，放入超凈臺中。
[0064] 2、把羊水分裝至50mL離心管中，2000rpm離心5min，棄上清。
[0065] 3、每個50mL離心管中加入