專利名稱：穩(wěn)定的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的制作方法
穩(wěn)定的免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域本發(fā)明涉及一種包含至少一個恒定抗體結(jié)構(gòu)域的多結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白，其是穩(wěn)定的。多克隆抗體已經(jīng)廣泛用作治療結(jié)合劑。本文使用完整的IgGl免疫球蛋白作為實例闡釋基本的抗體結(jié)構(gòu)。兩條相同的重鏈(H)和兩條相同的輕鏈(L)組合形成Y型抗體分子。每個重鏈具有四個結(jié)構(gòu)域。氨基端可變結(jié)構(gòu)域(VH)位于Y的頂端。在IgG、IgD和IgA的情形中，這些之后接著三個恒定結(jié)構(gòu)域CH1，CH2，和羧基端CH3，其位于Y莖干的基底部。在IgM和IgE 的情形中，有四個不同的恒定結(jié)構(gòu)域。一個短片段，“轉(zhuǎn)換區(qū)(switch)”，連接重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)。鉸合部將CH2和CH3(Fc片段)與抗體其余部分(Fab片段)連接。通過蛋白水解分解完整抗體分子中的鉸合部可以產(chǎn)生一個Fc和兩個相同的Fab片段。輕鏈由被轉(zhuǎn)換區(qū)分開的兩個結(jié)構(gòu)域(即，可變(VL)和恒定(CL)結(jié)構(gòu)域)構(gòu)成。鉸鏈區(qū)中的二硫鍵連接兩條重鏈。輕鏈通過另外的二硫鍵偶聯(lián)到重鏈上。取決于免疫球蛋白的種類，Asn-連接的糖類結(jié)構(gòu)部分附著在恒定結(jié)構(gòu)域中的不同位置。對于人 IgGl，鉸鏈區(qū)中位于Cys2^和Cys2^對之間的兩個二硫鍵將兩條重鏈聯(lián)合起來。輕鏈通過兩個另外的二硫鍵而偶聯(lián)到重鏈上，所述二硫鍵位于CHl結(jié)構(gòu)域中kr221之后的Cys和 CL結(jié)構(gòu)域中Cys2Hs之間。糖類結(jié)構(gòu)部分附著在每個CH2的Asn297上，在Y莖干產(chǎn)生明顯的凸出。此處的數(shù)字按照Kabat編號方案給出。這些特征具有意義深遠的功能結(jié)果。重鏈和輕鏈(VH)和(VL)的可變區(qū)位于Y的 “頂端”，它們位于此處與抗原反應(yīng)。分子的這一頂端是氨基酸序列的N端所在的一側(cè)。Y的莖干以足以介導(dǎo)效應(yīng)子功能(諸如補體激活和與Fc受體的相互作用、或ADCC和ADCP)的方式凸出。其CH2和CH3結(jié)構(gòu)域凸出，以促進與效應(yīng)蛋白的相互作用。氨基酸序列的C端位于頂端的對側(cè)(其可以稱為Y的“底部”)。在抗體中發(fā)現(xiàn)兩種類型的輕鏈，稱為IambdaU )和kappa ( κ )。給定的免疫球蛋白或者具有κ鏈或者具有λ鏈，從不具有每種類型各一條鏈。在具有λ或Κ輕鏈的抗體之間沒有發(fā)現(xiàn)功能差異?？贵w分子中的每個結(jié)構(gòu)域具有相似的結(jié)構(gòu)，即兩個β折疊彼此相對緊密包裝在壓縮的反向平行的β桶(beta barrel)中。這種保守的結(jié)構(gòu)稱為免疫球蛋白折疊。恒定結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白折疊包含相對4-鏈折疊包裝的3-鏈折疊。該折疊通過每個折疊的 β鏈之間的氫鍵、通過內(nèi)部相反折疊的殘基之間的疏水鍵、和通過折疊之間的二硫鍵穩(wěn)定。 3-鏈折疊包含C，F(xiàn)，和G鏈，并且4-鏈折疊包含Α，B，Ε，和D鏈。字母A至G表示β鏈沿著免疫球蛋白折疊氨基酸序列的順次位置。可變結(jié)構(gòu)域的折疊具有9個β鏈，排列在4鏈和5鏈的兩個折疊中。5-鏈折疊與恒定結(jié)構(gòu)域的3-鏈折疊在結(jié)構(gòu)上同源，但是包含額外的C'和C"鏈。其余的鏈(Α，B, C， D，Ε，F(xiàn)，G)具有與它們在恒定結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白折疊中的對應(yīng)體相同的拓撲結(jié)構(gòu)和相似的結(jié)構(gòu)。二硫鍵連接位于相反折疊中的B鏈和F鏈，如同在恒定結(jié)構(gòu)域中一樣。免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈二者的可變結(jié)構(gòu)域包含三個超變環(huán)，或互補性決定區(qū)(⑶Rs)。V結(jié)構(gòu)域的三個⑶Rs (⑶R1，⑶R2，⑶R3)簇集在β桶的一個末端。⑶Rs 是連接免疫球蛋白折疊的β鏈B-C，C' -C"，和F-G的環(huán)。在一種免疫球蛋白分子和另一種之間，CDRs中的殘基是不同的，這賦予每種抗體的抗原特異性。在抗體分子頂端的VL和VH結(jié)構(gòu)域緊密包裝，以致6個⑶Rs (每個結(jié)構(gòu)域上3個) 協(xié)作構(gòu)建成用于抗原特異性結(jié)合的表面(或腔)。因此，抗體的天然抗原結(jié)合位點由連接輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的鏈B-C，C' -C"，和F-G與重鏈可變結(jié)構(gòu)域的鏈B-C，C' -C"，和F-G的環(huán)組成。不是天然免疫球蛋白中的CDR-環(huán)、與抗原結(jié)合口袋分開的環(huán)(抗原結(jié)合口袋由 CDR環(huán)和在CDR環(huán)區(qū)內(nèi)有助于抗原結(jié)合口袋的任選相鄰的環(huán)確定)，不具有抗原結(jié)合或表位結(jié)合特異性，但是有助于完整的免疫球蛋白分子的正確折疊，因此其被稱為用于本發(fā)明目的的結(jié)構(gòu)環(huán)。現(xiàn)有技術(shù)文獻表明，目前已將免疫球蛋白支架用于操作現(xiàn)有的抗原結(jié)合位點由此引入新的結(jié)合特性的目的。在大部分情形中，CDR區(qū)已被改造用于不同的抗原結(jié)合，換言之， 在免疫球蛋白折疊的情形中，僅天然抗原結(jié)合位點被修飾，從而改變其結(jié)合親和性或特異性。存在大量的文獻，它們記述不同形式的這樣操作的免疫球蛋白，其通常以單鏈Fv片段 (scFv)或Fab片段形式表達，展示在噬菌體顆粒表面上或可溶性表達在各種原核或真核表達系統(tǒng)中。在本領(lǐng)域中已經(jīng)提議各種免疫球蛋白文庫，用來獲得特異性的免疫球蛋白結(jié)合齊U。然而，由于在改造抗原結(jié)合口袋時對構(gòu)架的可能的破壞，因此用于制備這樣的文庫的支架是有限的?，F(xiàn)有技術(shù)還涉及穩(wěn)定單CH2抗體結(jié)構(gòu)域。Gong等(J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志) (2009)284(21) :14203-14210)記述了分離的、未糖基化的人CH2單結(jié)構(gòu)域，其對熱誘導(dǎo)的解折疊相對不穩(wěn)定。將突變CH2結(jié)構(gòu)域改造，其在天然二硫鍵區(qū)內(nèi)，即在N端A鏈和C端G 鏈之間，具有另外的二硫鍵。由此用單體CH2獲得Tm為至多73°C的熱穩(wěn)定性。改造的單結(jié)構(gòu)域CH2結(jié)構(gòu)域還稱為納米抗體，其可以用作支架(Dimitrov(2009)mAbsl :1,26-28) 0記述CH3結(jié)構(gòu)域的二聚體化在抗體組裝中起關(guān)鍵作用。Mcauley等(Protein Science (蛋白質(zhì)科學(xué))(2008) 17 :95-106)教導(dǎo)CH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)在Cys367和Cys425(按照 Kabat編號方案)之間的二硫鍵是包埋的且高度保守。該二硫鍵不是二聚體化必需的，原因在于重組的人CH3結(jié)構(gòu)域，甚至在還原狀態(tài)，以二聚體存在。W006072620A1記述了改造免疫球蛋白的方法，其包括在結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)中的修飾以獲得新的抗原結(jié)合位點。該方法廣泛適用于免疫球蛋白，并且可以用來產(chǎn)生靶向各種抗原的免疫球蛋白文庫。已經(jīng)表明CH3文庫有效用于選擇針對抗原的特異性結(jié)合劑。W02009/000006A1記述了產(chǎn)生與靶標(biāo)和支架配體結(jié)合的抗體結(jié)構(gòu)域的寡聚體的方法。W02006/036834A1記述了結(jié)合到Fc結(jié)構(gòu)域中的生物活性的肽。存在對于提供用于制備各種文庫的穩(wěn)定的免疫球蛋白的需求。因此，本發(fā)明的目的是提供改進的免疫球蛋白作為抗體改造的支架。該目的通過所要求的主題解決。發(fā)明_既述按照本發(fā)明，提供了包含至少一個恒定抗體結(jié)構(gòu)域的多結(jié)構(gòu)域模塊式抗體
4(modular antibody)，所述抗體被突變形成人工二硫鍵，其通過誘變所述恒定結(jié)構(gòu)域來向氨基酸序列中引入至少一個Cys殘基，從而獲得構(gòu)架區(qū)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域內(nèi)或結(jié)構(gòu)域間二硫鍵而進行。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的模塊式抗體包含由所述人工二硫鍵連接的至少兩個恒定結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明所述的優(yōu)選的模塊式抗體具有抗原結(jié)合區(qū)，優(yōu)選地在突變位點旁邊的抗原結(jié)合區(qū)。因此，本發(fā)明所述的優(yōu)選的模塊式抗體具有在抗體的抗原結(jié)合位點旁引入的所述至少一個Cys殘基。本發(fā)明所述的模塊式抗體優(yōu)選地是全長抗體或抗體的一部分，諸如Fab，F(xiàn)e,或至少一個恒定結(jié)構(gòu)域與恒定結(jié)構(gòu)域或可變結(jié)構(gòu)域中的至少一個的其它組合。本發(fā)明所述的模塊式抗體優(yōu)選地包含通過引入至少一個Cys殘基形成的人工二硫鍵，其中優(yōu)選地改造單個Cys殘基以獲得結(jié)構(gòu)域間的鍵，諸如在同型二聚體結(jié)構(gòu)域之間的鍵。一個結(jié)構(gòu)域內(nèi)的兩個另外的Cys殘基將優(yōu)選地被改造，以獲得另外的結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵。本發(fā)明所述的優(yōu)選的模塊式抗體包含有助于所述模塊式抗體的抗原結(jié)合功能的恒定結(jié)構(gòu)域，諸如形成抗原結(jié)合位點的至少一部分的恒定結(jié)構(gòu)域。按照優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明所述的模塊式抗體用來提供用于產(chǎn)生模塊式抗體文庫的新型支架。按照本發(fā)明，還提供模塊式抗體文庫，其被誘變以獲得在環(huán)區(qū)內(nèi)的隨機化氨基酸序列。按照本發(fā)明，還提供產(chǎn)生本發(fā)明所述的模塊式抗體的方法，所述方法包括下述步驟-提供包含至少兩個抗體結(jié)構(gòu)域的模塊式抗體，其中至少一個所述抗體結(jié)構(gòu)域是恒定結(jié)構(gòu)域，-將所述恒定結(jié)構(gòu)域突變，以在所述結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)內(nèi)引入Cys殘基，和-在氧化條件下表達所述模塊式抗體以在分子內(nèi)形成新的二硫鍵。按照優(yōu)選的方法，至少兩個恒定結(jié)構(gòu)域被突變以引入Cys殘基。在等價實施方案中，任何其它人工的或備選的硫醇形成氨基酸或氨基酸類似物可以被改造成形成人工二硫鍵的氨基酸序列。氨基酸序列優(yōu)選地通過插入、或置換而突變。在本發(fā)明所述的優(yōu)選的方法中，在抗體的抗原結(jié)合位點旁引入Cys殘基。因此，生物學(xué)活性或抗原結(jié)合特性不會被這樣的Cys改造或二硫鍵形成而阻礙。本發(fā)明所述的另一個優(yōu)選方法提供所述恒定結(jié)構(gòu)域在所述結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)內(nèi) (例如，在結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)或β折疊區(qū)內(nèi))的位置處的突變，諸如選自由下述氨基酸位置組成的組折疊A :1-15.1ffftB :16-26折疊C :39-45.1折疊 D :77-84折疊 E 85. 1-96
折疊F :96. 2-104折疊G :118-1 編號按照IMGT編號方案進行。引入適當(dāng)?shù)娜斯ざ蜴I的優(yōu)選的位點顯示在表1中。盡管編號是指人IgGl抗體
結(jié)構(gòu)域，但是其它抗體結(jié)構(gòu)域的類似位置，例如，不同抗體種類或不同來源(如除人外的哺
乳動物物種)、或突變或變體抗體結(jié)構(gòu)域的相似位置，可以被選擇用于該改造人工二硫鍵的目的。表1 在恒定免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)(特別是人來源的IgGl)人工二硫鍵的橋基
(bridge piers)的優(yōu)選位點。
權(quán)利要求
1.包含至少一個恒定抗體結(jié)構(gòu)域的多結(jié)構(gòu)域模塊式抗體，其被突變以形成人工二硫鍵，這通過誘變所述恒定結(jié)構(gòu)域來向氨基酸序列中引入至少一個Cys殘基，從而獲得構(gòu)架區(qū)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域內(nèi)或結(jié)構(gòu)域間二硫鍵而進行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模塊式抗體，其包含由所述人工二硫鍵連接的至少兩個恒定結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的模塊式抗體，其具有抗原結(jié)合區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的模塊式抗體，其是全長抗體或抗體的一部分，諸如Fab、Fe，或至少一個恒定結(jié)構(gòu)域與恒定結(jié)構(gòu)域或可變結(jié)構(gòu)域中的至少一個的其它組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的模塊式抗體，其中所述恒定結(jié)構(gòu)域有助于所述模塊式抗體的抗原結(jié)合功能。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的模塊式抗體，其中所述至少一個Cys殘基被引入在所述抗體的抗原結(jié)合位點的旁邊。
7.用于產(chǎn)生基于權(quán)利要求1-6中任一項所述的模塊式抗體的模塊式抗體文庫的支架。
8.權(quán)利要求1-6中任一項所述的模塊式抗體的文庫，其中所述模塊式抗體被誘變，從而獲得環(huán)區(qū)內(nèi)的隨機化的氨基酸序列。
9.產(chǎn)生權(quán)利要求1-6中任一項所述的模塊式抗體的方法，所述方法包括下述步驟-提供包含至少兩個抗體結(jié)構(gòu)域的模塊式抗體，其中所述抗體結(jié)構(gòu)域中的至少一個是恒定結(jié)構(gòu)域，-突變所述恒定結(jié)構(gòu)域，以在所述結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)內(nèi)引入Cys殘基，和 -在氧化條件下表達所述模塊式抗體，從而在分子內(nèi)形成新的二硫鍵。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中至少兩個恒定結(jié)構(gòu)域被突變以引入Cys殘基。
11.根據(jù)權(quán)利要求9-10中任一項的方法，其中所述恒定結(jié)構(gòu)域有助于抗原結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項的方法，其中所述Cys殘基被引入到所述抗體的抗原結(jié)合位點的旁邊。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12中任一項的方法，其中所述模塊式抗體由宿主細胞在二硫化物形成的條件下表達。
14.權(quán)利要求9-13中任一項所述的方法用于增加多結(jié)構(gòu)域模塊式抗體的熱穩(wěn)定性的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求9-13中任一項所述的方法用于提高多結(jié)構(gòu)域模塊式抗體的抗原結(jié)合的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含至少一個恒定抗體結(jié)構(gòu)域的多結(jié)構(gòu)域模塊式抗體、基于所述抗體的文庫以及生產(chǎn)方法，所述抗體被突變形成人工二硫鍵，這通過誘變所述恒定結(jié)構(gòu)域來向氨基酸序列中引入至少一個Cys殘基，從而獲得構(gòu)架區(qū)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域內(nèi)或結(jié)構(gòu)域間二硫鍵而進行。
文檔編號C07K16/00GK102471375SQ201080028885
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日
發(fā)明者弗洛里安·呂爾克, 戈爾達娜·沃伊尼亞克-克諾普, 戈特弗里德·希姆萊 申請人:F-斯塔生物技術(shù)研究和發(fā)展有限公司