分子中互補決定區(qū)以外的區(qū)域中工程改造了的具有結合特性的合成免疫球蛋白結構域的制作方法
【專利摘要】用于工程改造免疫球蛋白從而在所述免疫球蛋白的結構環(huán)區(qū)域中包含至少一處修飾并測定所述免疫球蛋白對抗原表位的結合的方法，其中未修飾的免疫球蛋白不顯著結合所述表位，包括下列步驟：提供編碼包含至少一個結構環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白的核酸，修飾至少一個所述結構環(huán)區(qū)域的至少一個核苷酸殘基，將所述經(jīng)修飾的核酸轉移至表達系統(tǒng)，表達所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白，使表達的經(jīng)修飾的免疫球蛋白接觸表位，并測定所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白是否結合所述表位，以及經(jīng)過修飾的免疫球蛋白。
【專利說明】分子中互補決定區(qū)以外的區(qū)域中工程改造了的具有結合特性的合成免疫球蛋白結構域
[0001]本申請是國際申請日為2006年01月05日的申請?zhí)枮?00680001831.4的中國發(fā)明專利申請“分子中互補決定區(qū)以外的區(qū)域中工程改造了的具有結合特性的合成免疫球蛋白結構域”的分案申請。
[0002]本發(fā)明涉及用于工程改造(engineer)和制造經(jīng)修飾的免疫球蛋白的方法。
[0003]一般領域是以賦予蛋白質以特異性結合特性為目的的蛋白質工程。更具體的說，本發(fā)明中工程改造的實用蛋白質是免疫球蛋白(抗體)，甚至更具體的說，是免疫球蛋白的單一結構域或者成對或組合的單一結構域。免疫球蛋白的特異性結合特性是重要特征，因為它們決定了與其它分子諸如抗原的相互作用，并使得免疫球蛋白可用于診斷和治療應用。[0004]本文將以完整IgGl免疫球蛋白為例解釋基本的抗體結構。
[0005]兩條相同的重鏈(H)和兩條相同的輕鏈(L)聯(lián)合，形成Y形抗體分子。每條重鏈具有四個結構域。氨基末端可變區(qū)(VH)位于Y的尖端。接著是三個恒定區(qū):CHl、CH2和羧基末端CH3，位于Y主干的底部。一小段轉換區(qū)(switch)連接重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)。鉸鏈連接CH2和CH3 (Fe片段)與抗體的剩余部分(Fab片段)。通過蛋白水解切割完整抗體分子中的鉸鏈可生成一個Fe和兩個相同的Fab片段。輕鏈由兩個結構域構成，可變區(qū)(VL)和恒定區(qū)(CL)，以轉換區(qū)分開。
[0006]鉸鏈區(qū)中的二硫鍵連接兩條重鏈。輕鏈通過另外的二硫鍵與重鏈偶聯(lián)。根據(jù)免疫球蛋白的類別，Asn連接的碳水化合物部分附著于恒定區(qū)中的不同位置。對于IgGl，鉸鏈區(qū)中的兩個二硫鍵，在Cys235和Cys238對之間，聯(lián)合兩條重鏈。輕鏈通過另外兩個二硫鍵與重鏈偶聯(lián)，在CHl結構域的Cys229s和CL結構域的Cys214s之間。碳水化合物部分附著于每個CH2的Asn306，在Y的主干中產(chǎn)生顯著的凸出。
[0007]這些特征具有深刻的功能后果。重鏈和輕鏈二者的可變區(qū)(VH和VL)位于Y的“尖端”，它們在此站位，與抗原起反應。分子的這個尖端是氨基酸序列N末端所在的一側。Y的主干以有效介導效應物功能的方式凸出，諸如激活補體和與Fe受體的相互作用，或者ADCC和ADCP。其CH2和CH3結構域凸出，便于與效應物蛋白質相互作用。氨基酸序列的C末端位于尖端的對側，可稱為Y的“底部”。完整IgGl的結構見圖la。
[0008]在抗體中找到兩種類型的輕鏈，稱為拉姆達(λ )和卡帕(K )。給定免疫球蛋白或具有K鏈或具有λ鏈，從未具有每種各一條。在具有λ或Κ鏈的抗體之間沒有發(fā)現(xiàn)功倉泛壟I#。
[0009]人免疫球蛋白主要類別單體的結構組織見圖lb。各類別的差異在于其各自重鏈的組成和序列。IgM和IgE都缺乏鉸鏈區(qū)，但都包含額外的重鏈結構域(CH4)。連接各鏈的二硫鍵(線)的數(shù)目和位置在各同種型之間有不同。它們還在N連接碳水化合物基團的分布中有不同，以圓象征性表示。
[0010]抗體分子的每個結構域具有相似的結構，即兩組壓緊的β片層在壓縮的反平行β桶中彼此對立。此保守結構稱為免疫球蛋白折疊結構(fold)。恒定區(qū)的免疫球蛋白折疊結構包含對立壓緊的3鏈片層和4鏈片層。折疊結構通過每個片層的β折疊鏈之間的氫鍵、內部對立片層的殘基之間的疏水鍵、和片層之間的二硫鍵得到穩(wěn)定。3鏈片層包含C、F和G鏈，4鏈片層包含Α、Β、Ε和D鏈。字母A-G表示β折疊鏈沿免疫球蛋白折疊結構的氨基酸序列的順序位置。
[0011]可變區(qū)的折疊結構具有9條β折疊鏈，排列成4條鏈和5條鏈的兩組片層。5鏈片層在結構上與恒定區(qū)的3鏈片層類似，但包含額外的C'和C"鏈。其余鏈(A、B、C、D、E、F、G)與它們在恒定區(qū)免疫球蛋白折疊結構中的對應物具有相同的拓撲和相似的結構。一個二硫鍵連接對立片層中的B和F鏈，與恒定區(qū)中的一樣。圖2圖示了免疫球蛋白恒定區(qū)和可變區(qū)的免疫球蛋白折疊結構。
[0012]免疫球蛋白輕鏈和重鏈的恒定區(qū)都包含三個高變環(huán)或互補決定區(qū)(⑶R)。V結構域的三個⑶R(⑶R1、⑶R2、⑶R3)在β折疊桶的一端簇集。CDR是連接免疫球蛋白折疊結構的β折疊鏈B-C、C' -C"和F-G的環(huán)。⑶R中的殘基在免疫球蛋白分子間有變化，賦予各抗體以抗原特異性。
[0013]抗體分子尖端的VL和VH結構域壓緊，使得6個CDR (每個結構域3個)協(xié)作而構建供抗原特異性結合的表面(或空腔)。如此，抗體的天然抗原結合位點由連接輕鏈可變區(qū)的B-C、C -C''和F-G鏈及重鏈可變區(qū)的B-C、C -C''和F-G鏈的環(huán)構成。
[0014]使用蛋白質的三維結構作為設計的輔助手段，已經(jīng)使用蛋白質的核心結構作為支架將位于許多蛋白質的表面上的氨基酸殘基隨機化。此策略的例子的描述或綜述見下列參考文獻(收入本文作為參考):Nygren PA, Uhlen Μ., Curr Opin Struct Biol.(1997)7:463-9;Binz HK, Amstutz P,Kohl A, Stumpp MT, Briand C,Forrer P,GrutterMG,Pluckthun A.Nat Biotechnol.(2004)22:575-82;Vogt M, Skerra A.Chembiochem.(2004) 5:191-9; US 6,562,617。
[0015]此技術的基本原理基`于如下觀察結果:許多蛋白質具有穩(wěn)定的核心，它通過二級結構元件諸如β折疊片層或α螺旋的特定排列形成，所述二級結構元件通過諸如環(huán)、轉角或隨機螺旋的結構相互連接。典型的，這后三種結構元件對蛋白質的整體結構不太重要，這些結構元件中的氨基酸殘基常?？山粨Q而不破壞蛋白質的總體折疊結構。此設計原理的一個天然存在例子是抗體的⑶R。人工例子包括脂籠蛋白(Iipocalin)、錨蛋白(ankyrin)和其它蛋白質支架。
[0016]天然免疫球蛋白中CDR環(huán)以外的環(huán)不具有抗原結合或表位結合特異性，但促成整個免疫球蛋白分子的正確折疊和/或其效應物或其它功能，因此為了本發(fā)明的目的稱為結構環(huán)。
[0017]在美國專利第6，294，654號中顯示了可生成改變的抗體，其中可將肽抗原在鉸鏈區(qū)和可變區(qū)之間的CHl區(qū)中摻入抗體(Ab)的非CDR環(huán)，所得Ab可在APC中攝取，使得該肽抗原在MHC II的背景中呈遞在APC的表面，由此產(chǎn)生免疫應答。這些插入的肽是表位，而載體分子的整體結構不重要。演示了可將ras肽置于免疫球蛋白的(非⑶R)環(huán)上，而免疫球蛋白仍然分泌。細胞中有嚴格的“質量控制”，阻止免疫球蛋白分泌，除非它正確折疊，而改變環(huán)的氨基酸序列可能引起蛋白質折疊成細胞將檢測為不正確并因此降解它的結構。如此，在所示例子以外，認為進一步修飾結構環(huán)而不改變免疫球蛋白的性質是困難的。
[0018]美國專利申請2004/0101905記載了包含靶結合位點和Fe效應物肽的結合分子。Fe效應物肽指與效應物分子相互作用的肽。已經(jīng)顯示了將效應物肽插入免疫球蛋白片段的CHl結構域的非⑶R環(huán)。
[0019]Fe效應物肽是在抗體的非CDR環(huán)中天然存在的結構，因此預期在移植到免疫球蛋白的不同的相當位置上時不會干擾免疫球蛋白的結構。
[0020]無論如何，依照本公開書移植到非CDR環(huán)中的每種肽很有可能在它被選擇的不同結構環(huán)境中是沒有活性的。
[0021]上文提到的兩份現(xiàn)有技術文件中都聲明難以將肽插入應當保持其結構和功能的環(huán)，因為不干擾免疫球蛋白折疊結構是至關重要的，因為這對于功能和分泌是重要的。
[0022]美國專利申請2004/0132101和2005/0244403記載了對效應物配體具有改變的結合親和力的突變型免疫球蛋白，所述效應物配體是該抗體結構環(huán)的天然配體。在此文件中，記載了橫跨整個免疫球蛋白分子的多個區(qū)域中影響完整抗體的效應物功能的許多突變。
[0023]其它現(xiàn)有技術文件顯示，為了操作現(xiàn)有抗原結合位點的目的，由此引入新的結合特性，至今已經(jīng)采用免疫球蛋白樣支架。然而，至今只有CDR區(qū)為抗原結合進行了工程改造，換言之，在免疫球蛋白折疊結構的情況中，只修飾了天然抗原結合位點以改變其結合親和力或特異性。有極大量的文獻記載了不同形式的此類經(jīng)操作免疫球蛋白，其常常以單鏈Fv片段(scFv)或Fab片段的形式表達，或是展示在噬菌體顆粒的表面上或是在各種原核或真核表達系統(tǒng)中可溶性表達。在本領域領先的作者中有Greg Winter、Andreas Pliickthun和 Hennie Hoogenboom0
[0024]本發(fā)明的一個目標是提供引入了新的抗原結合位點的免疫球蛋白，及用于工程改造和制造所述免疫球蛋白的方法。
[0025]因此，本發(fā)明涉及用于工程改造免疫球蛋白的方法，包含在所述免疫球蛋白的結構環(huán)區(qū)域中的至少一處修飾，并測定所述免疫球蛋白對抗原表位的結合，其中未修飾的免疫球蛋白不顯著結合所述表位，包括下列步驟:
[0026]一提供編碼包含至少一個結構環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白的核酸，
[0027]一修飾至少一個所述結構環(huán)區(qū)域的至少一個核苷酸殘基，
[0028]一將所述經(jīng)修飾的核酸轉移入表達系統(tǒng)，
[0029]一表達所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白，
[0030]一使表達的經(jīng)修飾的免疫球蛋白與表位接觸，并
[0031]一測定所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白是否結合所述表位。
[0032]具體而言，本發(fā)明涉及用于工程改造特異性結合選自下組的抗原的表位的免疫球蛋白的方法:變應原、腫瘤相關抗原、自身抗原、酶、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原和病毒抗原。通過結構環(huán)區(qū)域中的修飾，免疫球蛋白可工程改造成結合該表位。在一個優(yōu)選的實施方案中，免疫球蛋白特異性結合至少兩種彼此不同的此類表位，所述表位或是相同抗原的或是不同抗原的。
[0033]例如，依照本發(fā)明的方法指工程改造特異性結合至少一種第一表位的免疫球蛋白，且在所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)域中包含至少一個修飾，并測定所述至少一個環(huán)區(qū)域對至少一種第二表位 的特異性結合，所述表位選自上文所述抗原的組，其中未修飾的結構環(huán)區(qū)域(非⑶R區(qū))不特異性結合所述至少一種第二表位，包括下列步驟:
[0034]一提供編碼特異性結合至少一種第一表位、包含至少一個結構環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白的核酸，
[0035]一修飾由所述核酸編碼的至少一個所述環(huán)區(qū)域的至少一個核苷酸殘基，
[0036]一將所述經(jīng)修飾的核酸轉移入表達系統(tǒng)中，
[0037]一表達所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白，
[0038]一使表達的經(jīng)修飾的免疫球蛋白與所述至少一種第二表位接觸，并
[0039]一測定所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白是否特異性結合第二表位。 [0040]依照本發(fā)明的方法優(yōu)選指所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)域中的至少一處修飾并測定所述至少一個環(huán)區(qū)域對至少一種選自下組的抗原的特異性結合:變應原、腫瘤相關抗原、自身抗原、酶、細菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和原生動物抗原，其中包含未修飾的結構環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白不特異性結合所述至少一種抗原。
[0041]依照本發(fā)明待修飾的術語“免疫球蛋白”(在用于本文時術語免疫球蛋白和抗體可互換)可展現(xiàn)單特異性或多特異性，或者多價結合特性，至少兩個、優(yōu)選至少三個對例如抗原、效應物分子/蛋白質的表位的特異性結合位點。依照本發(fā)明的免疫球蛋白還有本領域公認的功能性片段，諸如Fe、Fab、scFv、CH/CL結構域的單鏈二聚體、Fv、或者免疫球蛋白、完整抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)(諸如Fd、V1、Vk、Vh)和恒定區(qū)(諸如CH1、CH2、CH3、CH4、Cl和Ck)的結構域的其它衍生物或組合，以及由以結構環(huán)相連的免疫球蛋白結構域的兩條β折疊鏈組成的微型結構域(min1-domain)。
[0042]應當理解，術語“免疫球蛋白”、“經(jīng)修飾的免疫球蛋白”或“依照本發(fā)明的免疫球蛋白”同樣包括免疫球蛋白的衍生物。衍生物指一種或多種本發(fā)明免疫球蛋白的任意組合和/或其中本發(fā)明免疫球蛋白的任何結構域或微型結構域可在一種或多種其它蛋白質(諸如其它免疫球蛋白、配體、支架蛋白、酶、毒素等等)的任何位置融合的融合蛋白。本發(fā)明免疫球蛋白的衍生物還可通過以各種化學技術諸如共價偶聯(lián)、靜電相互作用、二硫鍵等結合其它物質來獲得。
[0043]結合免疫球蛋白的其它物質可以是脂質、碳水化合物、核酸、有機和無機分子、或其任意組合(例如PEG、前藥或藥物)。衍生物還有具有相同氨基酸序列但完全或部分由非天然或化學修飾氨基酸制備的免疫球蛋白。
[0044]依照本發(fā)明的工程改造分子作為獨立的蛋白質以及融合蛋白或衍生物都是有用的，最典型的是作為更大抗體結構或完整抗體分子或其部分諸如Fab、Fc片段、Fv片段及其它的一部分融合。將有可能使用工程改造的蛋白質來生成單特異性、雙特異性、三特異性分子，甚至可能同時攜帶多種特異性，而且同時將有可能依照此類分子的計劃用途的要求同時控制和預先選擇結合的效價。
[0045]依照本發(fā)明，可將所有種類的變應原、腫瘤相關抗原、自身抗原、酶、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原和病毒抗原的抗原結合區(qū)或抗原結合位點引入給定抗體結構的結構環(huán)。
[0046]依照本發(fā)明的術語“抗原”應當指已知與免疫球蛋白的⑶R環(huán)區(qū)域相互作用或能夠相互作用的分子或結構?，F(xiàn)有技術的結構環(huán)區(qū)域不與抗原相互作用，但是促成整體結構和/或對效應物分子的結合。
[0047]依照本發(fā)明的術語“變應原、腫瘤相關抗原、自身抗原、酶、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原和病毒抗原”應當包括能夠為抗體結構所識別的所有變應原和抗原及此類分子的片段(尤其是通常稱為“表位”(例如B細胞表位)的子結構(substructure))，只要它們是免疫學相關的，即也受到天然或單克隆抗體的識別。
[0048]依照本發(fā)明的術語“表位”應當指可完全構成本發(fā)明免疫球蛋白的結合結構域的特定結合配偶體或是特定結合配偶體的一部分的分子結構。
[0049]在化學上，表位可以由碳水化合物、肽、脂肪酸、無機物質、或其衍生物、及其任意組合構成。若表位是多肽，則它將通常在肽中包含至少3個氨基酸，優(yōu)選8-50個氨基酸，更優(yōu)選約10-20個氨基酸。肽的長度沒有臨界上限(critical upper limit),它可包含多肽序列的幾乎全長。表位可以是線性或構象表位。線性表位由多肽鏈的一段一級序列構成。線性表位可以是連續(xù)的或交疊的。構象表位由通過多肽的折疊而聚到一起，形成三級結構的氨基酸構成，而且所述氨基酸在線性序列中不必彼此相鄰。
[0050]具體而言，表位是診斷相關分子的至少一部分，即樣品中表位的存在與否與疾病或與健康狀況或與制造中的進程狀態(tài)或與環(huán)境和食物狀況定性或定量相關。表位還可以是治療相關分子的至少一部分，即可由改變疾病進程的特異性結合結構域靶向的分子。
[0051]優(yōu)選的“變應原、腫瘤相關抗原、自身抗原、酶、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原和病毒抗原”指那些早已證明就是或者能夠成為免疫學或治療相關的變應原或抗原，尤其是那些已經(jīng)測試了臨床功效的。
[0052]另一方面，依照本發(fā)明的另一個方面，還可在結構環(huán)區(qū)域中引入其它結合性能，例如對小分子諸如藥物或酶、酶的催化位點或酶底物，或者對酶底物轉變狀態(tài)類似物的結合性能。
[0053]優(yōu)選的是，結構環(huán)中的新的抗原結合位點對未修飾的免疫球蛋白而言是外源的。如此，像效應物分子或Fe受體的靶物優(yōu)選排除在依照本發(fā)明的免疫球蛋白的結合分子和特異性以外。
[0054]優(yōu)選的是，結構環(huán)中的新的抗原結合位點是通過由選定核酸編碼的免疫球蛋白的替換、缺失和/或插入而引入的。
[0055]依照本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，至少一個核苷酸的修飾導致由所述核酸編碼的免疫球蛋白的替換、缺失和/或插入。
[0056]至少一個環(huán)區(qū)域的修飾可導致一個或多個氨基酸的替換、缺失和/或插入，優(yōu)選點突變、整個環(huán)的交換，更優(yōu)選至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、多至30
個氨基酸的改變。
[0057]還優(yōu)選定點隨機突變。通過這種方法，使用隨機生成的插入物在此類結構環(huán)中交換或引入環(huán)的一個或多個特定氨基酸殘基?；蛘?，優(yōu)選使用組合方法。
[0058]優(yōu)選通過隨機、半隨機或特別是通過定點隨機誘變方法突變或修飾至少一個環(huán)區(qū)域。這些方法可用于在本發(fā)明免疫球蛋白的期望位置產(chǎn)生氨基酸修飾。在這些情況中，位置是隨機選擇的，或者氨基酸變化是使用過分簡單化原則(simplistic rule)產(chǎn)生的。例如，可將所有殘基突變成丙氨酸，稱為丙氨酸掃描。此類方法可偶聯(lián)更加復雜的工程改造方法，它們采用選擇方法來篩選更高水平的序列多樣性。
[0059]依照本發(fā)明的一種優(yōu)選方法涉及隨機修飾的核酸分子，它包含至少一個具有序列5' -NNS-3'、5’ -NNN-3’ 或 5’ -NNK-3’ 的核苷酸重復單元。
[0060]隨機修飾的核酸分子可包含上文鑒定的重復單元，它們編碼所有已知的天然存在氨基酸。
[0061]正如本領域眾所周知的，有多種選擇技術可用于鑒定和分離具有某些結合特性和親和力的蛋白質，包括例如展示技術諸如噬菌體展示、核糖體展示、細胞表面展示、等等，見下文所述。用于生成和篩選抗體變體的方法是本領域眾所周知的。用于抗體分子生物學、表達、純化、和篩選的通用方法記載于《Antibody Engineering)),Duebel & Kontermann編，Springer-Verlag, Heidelberg, 2001 ^Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Bio15:683-689;Maynard&Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76。
[0062]依照本發(fā)明的“結構環(huán)”或“非⑶R環(huán)”以如下方式理解:免疫球蛋白由具有所謂的免疫球蛋白折疊結構的結構域構成。本質上，反平行β片層由環(huán)相連而形成壓縮的反平行β折疊桶。在可變區(qū)中，結構域的有些環(huán)本質上促成抗體的特異性，即對抗原的結合。這些環(huán)稱為CDR環(huán)。相反，抗體結構域的所有其它環(huán)促成分子的結構和/或效應物功能。這些環(huán)在本文中定義為結構環(huán)或非CDR環(huán)。
[0063]可將編碼經(jīng)修飾的免疫球蛋白(而且在下文整篇說明書中總是包括免疫球蛋白片段)的核酸分子克隆到宿主細胞中，表達，并測定它們的結合特異性。這些實踐使用眾所周知的程序進行，可用于本發(fā)明的多種方法記載于《Molecular Cloning—A LaboratoryManual》，第 3 版，Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,2001及((Current Protocols in Molecular Biology)), John Wiley & Sons?？蓪⒕幋a本發(fā)明經(jīng)修飾的免疫球蛋白的核酸摻入表達載體以表達所述免疫球蛋白。表達載體典型的包含與控制或調節(jié)序列、選擇標志、任何融合配偶體、和/或另外的元件可操作連接的免疫球蛋白，即置于功能性關系中。為了生成本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白，可以在適于誘導或引起經(jīng)修飾的免疫球蛋白表達的條件下培養(yǎng)經(jīng)包含編碼經(jīng)修飾的免疫球蛋白的核酸的核酸，優(yōu)選表達載體轉化的宿主細胞。將外源核酸分子導入宿主的方法是本領域眾所周知的，而且將隨所用宿主而變化。當然，還可采用非細胞或無細胞表達系統(tǒng)來表達經(jīng)修飾的免疫球蛋白。
[0064]在本發(fā)明的一個`優(yōu)選實施方案中，在表達后純化或分離經(jīng)修飾的免疫球蛋白。經(jīng)修飾的免疫球蛋白可以以本領域技術人員知道的多種方式分離或純化。標準純化方法包括層析技術、電泳、免疫學、沉淀、透析、過濾、濃縮、和層析聚焦技術。特定融合配偶體常?？商峁┘兓椒ā＠?，若采用GST融合，則可使用谷胱甘肽樹脂來純化抗體；若采用His標簽，則可使用Ni+2親和層析；若采用flag標簽，則可使用固定化抗flag抗體。關于合適純化技術的一般指導，參閱《Antibody Purification:Principles and Practice》,第 3 版，Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994。當然,還有可能在宿主的表面上表達依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白，特別是在細菌、昆蟲或酵母細胞的表面上或者在噬菌體或病毒的表面上。
[0065]經(jīng)修飾的免疫球蛋白可使用多種方法篩選，包括但不限于那些使用體外測定法、體內和基于細胞的測定法、和選擇技術的?？稍诤Y選程序中利用自動化和高通量篩選技術。篩選可采用融合配偶體或標記物，例如酶、免疫標記物、同位素標記物、或小分子標記物諸如熒光或比色染料或發(fā)光分子。
[0066]在一個優(yōu)選的實施方案中，在體外測定法中篩選免疫球蛋白的功能性和/或生物物理學特性。在一個優(yōu)選的實施方案中,對抗體篩選功能性,例如它催化反應的能力或它對其靶物的結合親和力。[0067]測定法可采用多種檢測方法，包括但不限于顯色、熒光、發(fā)光、或同位素標記物。
[0068]正如本領域知道的，有些篩選方法選擇文庫的有利成員。這些方法在本文中稱為“選擇方法”，而且這些方法可在本發(fā)明中用于篩選經(jīng)修飾的免疫球蛋白。在使用篩選方法篩選免疫球蛋白文庫時，只有文庫中那些有利的，即達到有些選擇標準的成員得到繁殖、分離、和/或觀察。應當領會，因為只觀察到最合適的變體，所以此類方法能夠篩選比那些可通過個別測定文庫成員合適性的方法篩選的文庫更大的文庫?？赏ㄟ^共價或非共價連接免疫球蛋白的表型與其基因型，即抗體的功能與編碼它的核酸的任何方法、技術、或融合配偶體來進行選擇。例如，通過將文庫成員與基因III蛋白融合，從而能夠使用噬菌體展示作為選擇方法。這樣,達到有些標準例如對免疫球蛋白的靶物的結合親和力的經(jīng)修飾的免疫球蛋白的選擇或分離還選擇或分離了編碼它的核酸。一旦分離，然后可擴增編碼經(jīng)修飾的免疫球蛋白的一個或多個基因?？芍貜头Q為淘選的這個分離和擴增過程，從而富集文庫中有利的抗體變體。所附核酸的核酸測序最終容許基因的鑒定。
[0069]本領域知道多種選擇方法可在本發(fā)明中用于篩選免疫球蛋白文庫。這些包括但不限于卩遼菌體展不(《Phage display of peptides and antibodies:a laboratorymanual》，Kay 等人，1996, Academic Press, San Diego, Calif.,1996;Lowman etal.，1991，Biochemistry 30:10832-10838;Smith, 1985，Science 228:1315-1317)及其衍生物，諸如選擇性嗤菌體感染(selective phage infection) (Malmborg etal., 1997, J Mol Biol 273:544-551)、選擇性感染性卩遼菌體(selectively infectivepahge) (Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268:619-630)、和延遲感染性淘選(delayed infectivity panning)(Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893-904)，細胞表面展不(ffitrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399)諸如展不在細菌(Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34;Georgiou et al.,1993,TrendsBiotechnol 11:6-10;Lee et al.,2000,Nat Biotechnol 18:645-648;Jun etal., 1998, Nat Biotechnol 16:576-80)、酵母(Boder & Wittrup, 2000, MethodsEnzymol 328:430-44; Boder & Wittrup, 1997，Nat Biotechnol 15:553-557)、和哺乳動物細胞(ffhitehorn et al., 1995, Bio/technologyl3:1215-1219)上，以及體外展不技術(Amstutz et al., 2001`, Curr Opin Biotechnol 12:400-405),諸如多核糖體展7]\ (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026)、核糖體展不(Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942)、mRNA 展不(Roberts &Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302;Nemoto et al., 1997, FEBSLett 414:405-408)、和核糖體滅活展不系統(tǒng)(Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc124，538-543)。
[0070]可用于本發(fā)明的其它選擇方法包括不依賴于展示的方法，諸如體內方法，包括但不限于周質表達和細胞計量篩選(Chen et al., 2001, Nat Biotechnoll9:537_542)、抗體片段互補測定法(Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc NatlAcad Sci USA91:10340-10344;Pelletier et al., 1998,Proc Natl Acad Sci USA95:12141-12146)、和酵母雙雜交體篩選(Fields & Song, 1989，Nature340:245-246)，以選擇模式使用(Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA96:11723-11728)。在一個備選實施方案中，通過結合表達載體上的特定序列從而將融合配偶體和相關Fe變體文庫成員與編碼它們的核酸的融合配偶體共價或非共價連接來進行選擇。例如，PCT WO 00/22906; PCT WO01/49058; PCT WO 02/04852;PCT WO 02/04853;PCT WO 02/08023;PCT WO 01/28702;及PCT WO 02/07466記載了這樣的融合配偶體和可用于本發(fā)明的技術。在一個備選實施方案中，若抗體的表達賦予細胞以有些生長、繁殖、或存活優(yōu)勢，則可發(fā)生體內選擇。 [0071]稱為“定向進化”方法的有些選擇方法包括在選擇過程中交配或繁殖有利序列，有時摻入新的突變。本領域技術人員應當領會，定向進化方法可便于文庫中最有利序列的鑒定，而且可提高所篩選序列的多樣性。本領域知道多種定向進化方法可在本發(fā)明中用于篩選抗體變體，包括但不限于DNA改組(PCT WO 00/42561 A3; PCT WO01/70947 A3)、外顯子改組(美國專利第 6，365，377 號；Kolkman & Stemmer, 2001, NatBiotechnol 19:423-428)> 家族改組(Crameri et al., 1998, Nature 391:288-291;美國專利第 6,376,246 號)、RACHITT?(Coco et al., 2001, Nat Biotechnol19:354-359; PCT WO 02/06469)、STEP 和體外重組的隨機引發(fā)(Zhao et al., 1998, NatBiotechnol 16:258-261; Shao et al., 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683)、外切核酸酶介導的基因裝配(美國專利第6，352，842號；美國專利第6，361，974號)、基因位點飽和誘變?(美國專利第6，358，709號)、基因再裝配?(美國專利第6，358，709號)、SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-11253)、DNA 片段化法(Kikuchi et al., Gene 236:159-167)、單鏈 DNA 改組(Kikuchi et al., 2000, Gene243:133-137)、和 AMEsystem? 定向進化抗體工程改造技術(Applied MolecularEvolution)(美國專利第5，824，514號;美國專利第5，817，483號;美國專利第5，814，476號；美國專利第5，763，192號；美國專利第5，723，323號)。
[0072]在一個優(yōu)選的實施方案中，使用一種或多種基于細胞的或體內測定法篩選抗體變體。對于此類測定法，典型的是外源添加已純化或未純化的經(jīng)修飾的免疫球蛋白，使得細胞暴露于屬于文庫的個別免疫球蛋白或免疫球蛋白集合。這些測定法典型的但非總是基于免疫球蛋白的功能；即，抗體結合其靶物和介導有些生物化學事件，例如效應物功能、配體/受體結合抑制、凋亡、等等的能力。此類測定法常常牽涉監(jiān)測細胞對抗體的應答，例如細胞存活、細胞死亡、細胞形態(tài)的改變、或轉錄激活諸如天然基因或報道基因的細胞表達。例如，此類測定法可測量抗體變體引發(fā)ADCC、ADCP或CDC的能力。對于有些測定法，可能需要添加靶細胞以外的額外細胞或成分，例如血清補體或效應細胞諸如外周血單核細胞(PBMC)、NK細胞、巨噬細胞等等。此類額外細胞可以來自任何生物體，優(yōu)選人、小鼠、大鼠、兔和猴。免疫球蛋白可引起表達靶物的某些細胞系凋亡，或者它們可介導已經(jīng)添加到測定法中的免疫細胞對靶細胞的攻擊。用于監(jiān)測細胞死亡或存活力的方法是本領域知道的，包括使用染料、免疫化學、細胞化學和放射性試劑。例如，通過胱天蛋白酶染色測定法可測量凋亡，通過放射性物質或突光染料諸如alamar blue的攝取或釋放可監(jiān)測細胞生長或激活。在一個優(yōu)選的實施方案中，可使用DELFIA CD' ?基于EuTDA的細胞毒性測定法(Perkin Elmer, MA)?；蛘?，可通過測量一種或多種天然胞內成分例如乳酸脫氫酶的釋放來監(jiān)測死亡的或損傷的靶細胞。轉錄激活也可在基于細胞的測定法中充當測定功能的方法。在這種情況中，可通過測定可上調的天然基因或免疫球蛋白來監(jiān)測應答，例如可測量某些白介素的釋放，或者可經(jīng)由報道構建物讀出結果?；诩毎臏y定法還可牽涉測量作為對存在經(jīng)修飾的免疫球蛋白的應答的細胞形態(tài)變化。用于測量測定法的細胞類型可以是原核的或真核的，可采用本領域知道的多種細胞系?；蛘?，使用已經(jīng)用編碼變體的核酸轉化或轉染的細胞進行基于細胞的篩選。即，抗體變體不是外源添加給細胞的。例如，在一個實施方案中，基于細胞的篩選利用細胞表面展示?？刹捎萌诤吓渑俭w，從而能夠在細胞表面上展示經(jīng)修飾的免疫球蛋白(ffitrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399)。
[0073]在一個優(yōu)選的實施方案中，可使用一種或多種基于細胞的測定法通過實驗測定經(jīng)修飾的免疫球蛋白的免疫原性。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用先體外后體內(ex vivo) T細胞激活測定法通過實驗對免疫原性定量。在這種方法中，用目的肽或完整抗體一次或多次激發(fā)(challenge)來自匹配供體的抗原呈遞細胞和幼稚T細胞。然后，可使用許多方法檢測T細胞激活，例如通過監(jiān)測細胞因子的生成或測量氚化胸苷的攝取。在最優(yōu)選的實施方案中，使用 Elispot 測定法(Schmittel et.al., 2000, J.1mmunol.Meth., 24:17-24)監(jiān)測干擾素Y生成。
[0074]可在細胞、組織、和完整生物體實驗中表征本發(fā)明經(jīng)修飾的免疫球蛋白的生物學特性。正如本領域知道的，為了測量藥物治療疾病或疾病模型的功效或者測量藥物的藥動學、毒性和其它特性，常常在動物中測試藥物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、犬、貓、豬和猴。這些動物可稱為疾病模型。常常在小鼠中測試治療劑，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、異種移植物小鼠和轉基因小鼠(包括敲入和敲除)。此類實驗可為確定抗體用作治療劑的潛力提供有意義的數(shù)據(jù)。測試可使用任何生物體，優(yōu)選哺乳動物。例如，由于猴與人的遺傳相似性，猴可以是合適的治療模型，因而可用于測試本發(fā)明經(jīng)修飾的免疫球蛋白的功效、毒性、藥動學或其它特性。批準作為藥物最終要求在人體中測試，因此當然設想了這些實驗。如此，可以在人體中測試本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白以測定它們的治療功效、毒性、免疫原性、藥動學和/或其它臨床特性。
[0075]本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白可用于廣泛的抗體產(chǎn)品。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體變體用于治療或預防，用于制備或分析用途，用作診斷劑、工業(yè)化合物或研究試劑，優(yōu)選治療劑?？贵w變體可用于單克隆的或多克隆的抗體組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白用于殺傷攜帶靶抗原的靶細胞，例如癌細胞。在一個備選實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修`飾的免疫球蛋白用于阻斷、拮抗或激動(agonize)靶抗原，例如通過拮抗細胞因子或細胞因子受體。在一個備選的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白用于阻斷、拮抗或激動靶抗原和殺傷攜帶靶抗原的靶細胞。
[0076]在一個備選的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白用于阻斷、拮抗或激動生長因子或生長因子受體和殺傷攜帶或需要靶抗原的靶細胞。在一個備選的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白用于阻斷、拮抗或激動酶和酶的底物。
[0077]本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白可用于各種治療目的。在一個優(yōu)選的實施方案中，將包含經(jīng)修飾的免疫球蛋白的抗體施用于患者以治療特定紊亂。為了本發(fā)明的目的，“患者”包括人和其它動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人?！疤囟ㄎ蓙y”在本文中指可通過施用包含本發(fā)明經(jīng)修飾的免疫球蛋白的藥用組合物而改善的紊亂。
[0078]在一個實施方案中，依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白是施用于患者的唯一治療活性劑?；蛘?，依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白聯(lián)合一種或多種其它治療劑施用，包括但不限于細胞毒劑、化療劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素劑、激酶抑制劑、抗血管發(fā)生劑、心臟保護劑、或其它治療劑。經(jīng)修飾的免疫球蛋白可以與一種或多種其它治療方案相伴施用。例如，本發(fā)明的抗體變體可以與化療、放療、或化療和放療二者一起施用。在一個實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白可以與一種或多種抗體(可以包含或不包含本發(fā)明的抗體變體)聯(lián)合施用。依照本發(fā)明的另一個實施方案，采用本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白和一種或多種其它抗癌療法來先體外后體內處理癌細胞。設想了此類先體外后體內處理在骨髓移植和特別是自體骨髓移植中可能是有用的。當然設想了可以聯(lián)合其它治療技術諸如外科手術而采用本發(fā)明的抗體。
[0079]多種其它治療劑可用于與本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白一起施用。在一個實施方案中，經(jīng)修飾的免疫球蛋白與抗血管發(fā)生劑一起施用，后者是阻斷或一定程度干擾血管發(fā)育的化合物?？寡馨l(fā)生因子可以是例如結合牽涉促進血管發(fā)生的生長因子或生長因子受體的小分子或蛋白質，例如抗體、Fe融合物、或細胞因子。在本文中優(yōu)選的抗血管發(fā)生因子是結合血管內皮生長因子(VEGF)的抗體。在一個備選的實施方案中，經(jīng)修飾的免疫球蛋白與誘導或增強適應性免疫應答的治療劑一起施用，例如靶向CTLA-4的抗體。在一個備選的實施方案中，經(jīng)修飾的免疫球蛋白與酪氨酸激酶抑制劑一起施用，后者是一定程度抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在一個備選的實施方案中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白與細胞因子一起施用?！凹毎蜃印痹谟糜诒疚臅r指由一種細胞群釋放、作為細胞間介質作用于另一細胞的蛋白質的通稱，包括趨化因子。
[0080]設想了其中配制了本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白和一種或多種治療活性劑的藥用組合物。通過將具有期望純度的所述免疫球蛋白與任選的藥學可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(〈〈Remington' s Pharmaceutical Sciences》，第 16 版,Osol, A.編，1980)混合，制備本發(fā)明抗體變體的配制劑供貯存，采取凍干配制劑或水溶液的形式。將用于體內施用的配制劑優(yōu)選是無菌的。這易于通過無菌濾膜過濾或其它方法來實現(xiàn)。本文中所公開的經(jīng)修飾的免疫球蛋白和其它治療活性劑還可配制成免疫脂質體和/或包裹在微膠囊中。
[0081]包含本發(fā)明經(jīng)修 飾的免疫球蛋白的藥用組合物的施用，優(yōu)選無菌水溶液的形式，可以多種方式進行，包括但不限于口服、皮下、靜脈內、鼻內、耳內、經(jīng)皮、局部(例如凝膠劑、軟膏劑、洗劑、乳膏劑等)、腹膜內、肌肉內、肺內(例如AERx?可吸入技術，可從Aradigm購買；或Inhance?肺部投遞系統(tǒng),可從Inhale Therapeutics購買)、陰道、腸胃外、直腸、或眼內。
[0082]在用于本文時，術語“特異性結合”指異質分子群中目的關聯(lián)配體決定性的結合反應。如此，在指定條件(例如在免疫球蛋白的情況中是免疫測定條件)下，指定抗體結合其特定“靶物”且不以顯著量結合樣品中存在的其它分子。與抗體的CDR相當，經(jīng)修飾的結構環(huán)區(qū)域是結合抗原或分子的蛋白質模塊，而非抗原。
[0083]術語“表達系統(tǒng)”指包含可操作連接的期望編碼序列和控制序列，使得用這些序列轉化的宿主能夠生成所編碼蛋白質的核酸分子。為了實現(xiàn)轉化，表達系統(tǒng)可包含在載體上；然而，相關DNA然后還可整合到宿主染色體中。
[0084]依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案,表達系統(tǒng)包含載體。本領域知道的任何表達載體都可在適當時用于此目的。
[0085]經(jīng)修飾的免疫球蛋白優(yōu)選在宿主中表達，優(yōu)選在細菌、酵母、植物細胞、動物細胞中或者在植物或動物中表達。
[0086]極多種適當?shù)乃拗骷毎捎糜诒磉_經(jīng)修飾的免疫球蛋白，包括但不限于哺乳動物細胞(動物細胞)、植物細胞、細菌(例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli))、昆蟲細胞、和酵母(例如巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae))。例如，可從美國典型培養(yǎng)物收藏中心(American Type Culture Collection)獲得的ATCC細胞系目錄中記載了可用于本發(fā)明的多種細胞系。此外，植物和動物也可作為宿主用于表達依照本發(fā)明的免疫球蛋白?？筛鶕?jù)所用宿主來選擇表達以及轉染載體或盒。
[0087]當然，也可使用非細胞或無細胞蛋白質表達系統(tǒng)。生成足夠量蛋白質的體外轉錄/翻譯蛋白質表達平臺提供了無細胞表達的許多優(yōu)勢，消除了對典型的與基于細胞的表達系統(tǒng)有關的費力的上游和下游步驟(例如宿主細胞轉化、培養(yǎng)、或溶解)的需要。
[0088]本發(fā)明的另一個方面涉及用于制造免疫球蛋白或其藥用制劑的方法，包含在所述免疫球蛋白的結構環(huán)區(qū)域中至少一處修飾，并測定所述免疫球蛋白對抗原表位的結合，其中未修飾的免疫球蛋白不顯著結合所述表位，包括下列步驟:
[0089]一提供編碼包含至少一個環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白的核酸，
[0090]一修飾至少一個所述環(huán)區(qū)域的至少一個核苷酸殘基，
[0091]一將所述經(jīng)修飾的核酸轉移入表達系統(tǒng)，
[0092]一表達所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白，
[0093]-使表達的經(jīng)修飾的免疫球蛋白與表位接觸，
[0094]一測定所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白是否結合所述表位，并
[0095]一提供結合所述表位的經(jīng)修飾的免疫球蛋白并任選將其制成藥用制劑。
[0096]具體而言，本發(fā)明涉及`用于制造特異性結合至少一種第一分子的多特異性免疫球蛋白或其藥用制劑的方法，包含在所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)域中的至少一處修飾，并測定所述至少一個環(huán)區(qū)域對至少一種選自下組的第二分子的特異性結合:變應原、腫瘤相關抗原、自身抗原、酶、細菌抗原、真菌抗原、原生動物抗原和病毒抗原，其中包含未修飾結構環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白不特異性結合所述至少一種第二分子，包括下列步驟:
[0097]—提供編碼特異性結合至少一種第一分子、包含至少一個結構環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白的核酸，
[0098]一修飾由所述核酸編碼的至少一個所述環(huán)區(qū)域的至少一個核苷酸殘基，
[0099]一在表達系統(tǒng)中轉移所述經(jīng)修飾的核酸，
[0100]一表達所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白，
[0101]一使表達的經(jīng)修飾的免疫球蛋白與所述至少一種第二分子接觸，
[0102]一測定所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白是否特異性結合第二分子，并
[0103]一提供對所述至少一種第二分子特異的經(jīng)修飾的免疫球蛋白并任選將其制成藥用制劑。
[0104]將超過一種特異性工程改造到特異性結合對的一個成員中是優(yōu)選的(Kufer etal.(2004)Trends in Biotechnology vol.22 pages 238-244)。
[0105]已經(jīng)做了許多嘗試來生成多特異性，例如雙特異性的單克隆抗體或抗體片段。生成由兩條不同多肽鏈(重鏈和輕鏈)構成的雙特異性抗體中的一個問題是必需在一個細胞中表達四種不同的鏈(兩種重鏈和兩種輕鏈)，產(chǎn)生許多不同的不得不與混合物中的期望雙特異性分子分開的分子組合。由于它們的相似性，將這些分子分開是困難且昂貴的。已經(jīng)采用許多技術使此類不想要的配對的出現(xiàn)最小化(Carter(2001) Journal of ImmunologicalMethods, vol 248, pages 7-15)。
[0106]這個問題的一種解決辦法是生成一條具有兩種特異性的多肽鏈，像例如彼此相連的兩種scFv，或者生成所謂的雙抗體。此類分子已經(jīng)顯示出與天然分子的折疊結構相距甚遠，而且出了名的難以生成(LeGall et al.(2004)Protein Engineering, Design &Selection vol 17 pages 357-366)。
[0107]當前雙特異性抗體設計的另一個問題在于即使親本抗體雙價結合其各自結合配偶體(例如IgG)，所得雙特異性抗體對每一種各自結合配偶體仍是單價的事實。
[0108]本發(fā)明的優(yōu)選多特異性分子解決了這些問題:
[0109]將雙特異性分子表達成一條多肽鏈是可能的(具有兩種結合特異性的經(jīng)修飾的Ig結構域，見實施例部分)，這比表達兩條抗體多肽鏈更加易于實現(xiàn)(Cabilly et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 81:3273-3277(1984))。
[0110]由于第二特異性位于分子的非可變部分，因而不需要兩條不同重鏈或不同輕鏈的事實，它也可生成為抗體樣分子(即由2條多肽鏈構成)。如此，不可能有兩條鏈的錯誤配對。
[0111]本發(fā)明的抗體可以由一條重鏈和一條輕鏈組成，它們一起形成結合特定結合配偶體的可變區(qū)。第二特異性可以由重鏈或輕鏈的任何結構環(huán)的經(jīng)修飾的環(huán)形成。結合位點也可以由超過一個非CDR環(huán)形成，它們可以是結構上相鄰的(或是在重鏈上或是在輕鏈上或是在兩條鏈上)。
[0112]經(jīng)修飾的抗體或衍生物可以是完整抗體或抗體片段(例如Fab、CH1-CH2、CH2-CH3)。
[0113]根據(jù)設計，它可單價或多價結合結合配偶體，甚至對不同結合配偶體具有不同效價。
[0114]既然重鏈和輕鏈非CDR區(qū)有許多不同環(huán)可用于選擇和設計特異性結合位點，有可能設計具有甚至超過兩種特異性的抗體衍生物而沒有上文提到的問題。
[0115]—條多肽鏈內的特異性結合位點可以用或不用肽接頭相連。
[0116]有些抗體類別天生可視為多特異性的，特別是雙特異性:它們以可變區(qū)結合抗原(典型的是例如外源結構或癌相關結構)并以Fe部分結合Fe效應物分子(例如各種免疫細胞上的Fe受體或補體蛋白)，從而能夠實現(xiàn)諸如ADCC、ADCP或⑶C的效應。
[0117]Fe效應物分子通過免疫球蛋白分子Fe部分(對于IgGl，它由CH2和CH3結構域組成)結合，而且已經(jīng)記載了許多方法通過改進抗體分子的Fe部分的結合來優(yōu)化效應物功能，或是通過糖工程技術(glycoengineering technique) (US 6，602，684)或是通過蛋白質工程，后者或是直接在Fe處(US2005/0054832)或是間接通過Fe以外的工程改造(US2005/02444403)。Fe區(qū)與Fe受體的結合和/或與補體蛋白諸如Cql的結合二者都已經(jīng)通過此類技術改變。通常試圖改進對此類Fe效應物分子的結合親和力，因為它與改良的效應物功能有關。
[0118]通過本發(fā)明，有可能設計在天然Fe結合區(qū)以外結合Fe效應物分子的抗體?？贵w結構域中除牽涉“天然”Fe效應物分子結合的環(huán)以外的經(jīng)修飾的環(huán)可從文庫中選擇或者設計成結合一種或多種Fe效應物分子。具有此類額外Fe效應物分子結合位點的抗體將對某種Fe效應物分子或展示Fe效應物分子的效應細胞具有更強的親合力，因此可比糖工程抗體或以其它方式改良的Fe區(qū)具有甚至更強的效果。然而，對于本發(fā)明的某些實施方案，不應直接改變待修飾的給定抗體的效應物特征，而是保持不受依照本發(fā)明的結構環(huán)中的修飾的影響。
[0119]抗體片段與完整抗體相比具有某些優(yōu)勢。片段通常具有較好的生物分布特性，而且可更加容易的生產(chǎn)。然而，大多數(shù)抗體片段設計缺乏效應物功能且具有較短的體內半衰期(Holliger P, et al.Nat Biotechnol.(2005)23:1126-36.)。
[0120]CHl或者C K或C λ結構域都不介導效應物功能，這就是Fab不顯示ADCC、ADCP或CDC的原因。WO 02/44215記載了由抗體的抗原結合位點和結合Fe效應物分子的肽組成的結合分子。以這樣一種方式，可構建展示效應物功能的抗體片段。將肽摻入結合分子，位于既不破壞抗原結合也不破壞肽結合Fe效應物分子的能力的位置。
[0121]然而，依照本發(fā)明，對Fe效應物分子的結合可以用已經(jīng)從免疫球蛋白結構域的固定支架中隨機環(huán)序列文庫中選擇Fe效應物分子結合的經(jīng)修飾的免疫球蛋白結構域來執(zhí)行。因此，有可能選擇不會在Ig結構域支架以外結合Fe效應物分子的特定環(huán)序列。得自本發(fā)明的多肽因此優(yōu)選可以由超過100個氨基酸組成。
[0122]為了選擇依照本發(fā)明的此類結構域的潛在效應物功能，可對突變CH1、Ck或CA結構域的文庫選擇與Fe受體和/或補體因子諸如Clq的結合。
[0123]為了延長由這樣的結構域(例如CH1、CH2、CH3、CH4、Ck或CA )組成或包含它們的分子的體內半衰期，可以對突變體例如依照本發(fā)明的CH1、CH2、CH3、CH4、Ck或CA結構域的文庫選擇與FcRn的結合。
[0124]供選擇的FcRn受體可以在天然表達相應受體的細胞的表面上提供，或者通過表達并純化相應受體的胞外部分來提供。為了本發(fā)明的目的，對FcRn的第一篩選可以選擇這樣的突變結構域，它們可以在體外進一步測試和甚至通過與表達FcRn受體的細胞的結合在FACS實驗中進一步表征。它可通過與各種重組FcRn、同種型和同種異型的結合的親和力分級來進一步表征，例如通過表面等離振子共振技術。
[0125]依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，免疫球蛋白是人或鼠起源的。
[0126]既然經(jīng)修飾的免疫球蛋白可用于各種目的，特別是藥用組合物，那么免疫球蛋白優(yōu)選是人或鼠起源的。當然，經(jīng)修飾的免疫球蛋白也可以是人源化的或嵌合的免疫球蛋白。
[0127]依照本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，人免疫球蛋白選自下組:IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 和 IgM。
[0128]鼠免疫球蛋白優(yōu)選選自下組:IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3和IgM。
[0129]經(jīng)修飾的免疫球蛋白可衍生自上文鑒定的免疫球蛋白類別之一。
[0130]免疫球蛋白優(yōu)選包含免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈或其部分。
[0131]經(jīng)修飾的免疫球蛋白可包含重鏈和/或輕鏈，至少一個可變區(qū)和/或恒定區(qū)。
[0132]依照本發(fā)明的免疫球蛋白優(yōu)選包含免疫球蛋白的至少一個恒定區(qū)和/或至少一個可變區(qū)或其包括微型結構域的部分。
[0133]恒定區(qū)指免疫球蛋白分子恒定部分的免疫球蛋白折疊結構單元，也稱為恒定區(qū)結構域(例如 CH1、CH2、CH3、CH4、Ck、Cl)。[0134]可變區(qū)指免疫球蛋白可變部分的免疫球蛋白折疊結構單元，也稱為可變區(qū)結構域(例如 Vh、Vk、Vl、Vd)。
[0135]依照本發(fā)明的一種優(yōu)選免疫球蛋白由選自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C, Igl-C的恒定區(qū)或其包括微型結構域的部分組成，具有至少一個環(huán)區(qū)域，其中所述至少一個環(huán)區(qū)域包含至少一處氨基酸修飾，形成至少一個經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域，其中所述至少一個經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域特異性結合至少一種抗原表位。
[0136]依照本發(fā)明的另一種優(yōu)選免疫球蛋白由重鏈或輕鏈的可變區(qū)或其包括微型結構域的部分組成，具有至少一個環(huán)區(qū)域，其中所述至少一個環(huán)區(qū)域包含至少一處氨基酸修飾，形成至少一個經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域，其中所述至少一個經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域特異性結合至少一種抗原表位。
[0137]依照一個優(yōu)選的實施方案，恒定區(qū)選自CHl、CH2、CH3、CH4、Igk-C, Igl-C及其組
口 ο
[0138]依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白可包含一個或多個恒定區(qū)(例如至少兩個、三個、四個、五個、六個、十個結構域)。如果經(jīng)修飾的免疫球蛋白中存在超過一個結構域，那么這些結構域可以是相同類型或不同類型的(例如CH1-CH1-CH2、CH3-CH3)。當然，單一結構域的次序也可以是任何種類的(例如CH1-CH3-CH2、CH4-CH1-CH3-CH2)。
[0139]免疫球蛋白氨基酸序列的所有編號依照MGT編號方案(MGT，the internationalImMunoGeneTics information systemiimgt.cines.fr;http://imgt.cines.fr;Lefrancet al.，1999，Nucleic Acids Res.27:209-212;Ruiz et al.，2000Nucleic AcidsRes.28:219-221;Lefranc et al.，2001，Nucleic Acids Res.29:207-209;Lefranc etal.，2003，Nucleic Acids Res .31:307-310;Lefranc et al.，2005，Dev Comp Immunol29:185-203)o
[0140]依照本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，CHU CH2、CH3和CH4的經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域包含第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸和第106-117位氨基酸。
[0141]人起源的Igk-C和Igl-C的環(huán)區(qū)域優(yōu)選包含第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸和第123-126位氨基酸。
[0142]鼠起源的Igk-C和Igl-C的環(huán)區(qū)域優(yōu)選包含第8-20位氨基酸、第26_36位氨基酸、第43-79位氨基酸、第83-85位氨基酸、第90-101位氨基酸、第108-116位氨基酸和第122-125位氨基酸。
[0143]人起源的免疫球蛋白的可變區(qū)的結構環(huán)區(qū)域優(yōu)選包含第8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸。
[0144]依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，鼠起源的免疫球蛋白的可變區(qū)的結構環(huán)區(qū)域包含第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸。
[0145]上文鑒定的各免疫球蛋白的經(jīng)修飾的氨基酸區(qū)域包含待修飾的環(huán)區(qū)域。
[0146]依照本發(fā)明的免疫球蛋白優(yōu)選是駱駝起源的。
[0147]駱駝抗體只包含一條抗體，與由輕鏈和重鏈組成的正常抗體具有相同的抗原親和力。因此，駱駝抗體比例如人抗體小得多，容許它們穿透稠密組織達到抗原，而更大蛋白質則不能。此外，比較簡單、親和力和特異性高、及到達活性位點和與活性位點相互作用的潛力，駱駝的重鏈抗體在有臨床價值的化合物的設計、生產(chǎn)和應用中呈現(xiàn)了優(yōu)于常見抗體的優(yōu)點。
[0148]駱駝起源的免疫球蛋白優(yōu)選包含至少一個選自CH1、CH2和CH3的恒定區(qū)。
[0149]依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，駱駝免疫球蛋白的CHl、CH2和CH3的環(huán)區(qū)域包含第8-20位氨基酸、第24-39位氨基酸、第42-78位氨基酸、第82-85位氨基酸、第91-103位氨基酸和第108-117位氨基酸。 [0150]依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，經(jīng)修飾的免疫球蛋白對分子的特異性結合通過選自下組的結合測定法測定:免疫學測定法優(yōu)選優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、表面等離振子共振測定法、飽和轉移差異核磁共振光譜法、轉移NOE (trNOE)核磁共振光譜法、競爭測定法、組織結合測定法、活細胞結合測定法和細胞提取物測定法。
[0151]結合測定法可使用本領域知道的多種技術來進行，包括但不限于基于FRET (熒光共振能量轉移)和BRET (生物發(fā)光共振能量轉移)的測定法、AlphaScreen?(放大的發(fā)光親近同質測定法)、閃爍親近測定法、ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定法)、SPR(表面等離振子共振，也稱為BIAC0RE m ?)、等溫滴定量熱法、差示掃描量熱法、凝膠電泳和層析，包括凝膠過濾。這些和其它方法可利用有些融合配偶體或標記物。
[0152]經(jīng)修飾的免疫球蛋白優(yōu)選偶聯(lián)選自下組的標記物:有機分子、酶標記物、放射性標記物、有色標記物、熒光標記物、顯色標記物、發(fā)光標記物、半抗原、洋地黃毒苷、生物素、金屬配合物、金屬、膠體金及其混合物。
[0153]經(jīng)修飾的免疫球蛋白可偶聯(lián)容許在例如結合測定法(例如ELISA)和結合研究中簡單檢測所述偶聯(lián)物的其它分子。
[0154]本發(fā)明的另一個方面涉及由選自CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C, Igl-C的恒定區(qū)或其包括微型結構域的部分或其組合組成的免疫球蛋白，具有至少一個環(huán)區(qū)域，其中所述至少一個環(huán)區(qū)域包含至少一處氨基酸修飾，形成至少一個經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域，其中所述至少一個經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域特異性結合至少一種抗原表位。
[0155]優(yōu)選在分子上組合至少一種經(jīng)修飾的抗體結構域(=經(jīng)非可變序列或結構環(huán)結合特定配偶體)與至少一種其它結合分子，后者可以是抗體、抗體片段、可溶性受體、配體或另一種經(jīng)修飾的抗體結構域。
[0156]所述分子選自蛋白質性質的分子、核酸和碳水化合物。
[0157]經(jīng)修飾的免疫球蛋白的環(huán)區(qū)域可特異性結合任何種類的結合分子，特別是蛋白質性質的分子、蛋白質、肽、多肽、核酸、聚糖、碳水化合物、脂質、有機小分子、無機分子。當然，經(jīng)修飾的免疫球蛋白可包含至少兩個環(huán)區(qū)域，由此每個環(huán)區(qū)域可特異性結合其它分子或表位。
[0158]依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，結合經(jīng)修飾的結構環(huán)區(qū)域的分子選自下組:腫瘤相關抗原，特別是EpCAM，腫瘤相關糖蛋白-72 (TAG-72)，腫瘤相關抗原CA125，前列腺特異膜抗原(PSMA)，高分子量黑素瘤相關抗原(HMW-MAA)，表達Lewis Y相關碳水化合物的腫瘤相關抗原，癌胚抗原(CEA)，CEACAM5，HMFG PEM，粘蛋白MUC1，MUC18和細胞角蛋白腫瘤相關抗原，細菌抗原，病毒抗原，變應原，熒光素，溶菌酶，toll樣受體9，紅細胞生成素，CD2，CD3, CD3E, CD4, CDlI, CDlla, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30,CD33 (p67 蛋白)，CD38，CD40，CD40L, CD52，CD54，CD56，CD80，CD147，⑶3，IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6，IL-6R，IL-8，IL-12，IL-15，IL-18，IL-23，干擾素 α，干擾素 β，干擾素 Y ；TNF-a，TNF-β 2，TNFa , TNFa β，TNF-Rl, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L，4-1BBL，TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1，0X40L，TRAIL 受體-1，Al 腺苷受體，淋巴毒素 β 受體，TACI，BAFF-R，EPO ;LFA-3，ICAM-1，ICAM-3，整聯(lián)蛋白 β?，整聯(lián)蛋白 β2，整聯(lián)蛋白α4/β7，整聯(lián)蛋白α2，整聯(lián)蛋白α3，整聯(lián)蛋白α4，整聯(lián)蛋白α5，整聯(lián)蛋白α6，整聯(lián)蛋白αν，ανβ3整聯(lián)蛋白，F(xiàn)GFR-3，角質形成細胞生長因子，VLA-1，VLA-4，L-選擇蛋白，抗 Id，E-選擇蛋白，HLA，HLA-DR，CTLA-4，T 細胞受體，B7-1，B7-2，VNR 整聯(lián)蛋白，TGF β 1，TGFβ 2，eotaxinl, BLyS(B 淋巴細胞刺激物)，補體 C5，IgE，因子 VII，CD64, CBL, NCA 90，EGFR(ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4)，組織因子，VEGF, VEGFR,內皮縮血管肽受體，VLA-4，碳水化合物諸如血型抗原和相關碳水化合物，Galili糖基化，促胃液素，促胃液素受體，腫瘤相關碳水化合物，半抗原NP帽或NIP帽，T細胞受體α / β，E-選擇蛋白，地高辛，胎盤堿性磷酸酶(PLAP)和睪丸PLAP樣堿性磷酸酶，運鐵蛋白受體，類肝素酶Ofeparanase) I，人心肌球蛋白，糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)，人巨細胞病毒(HCMV) gH包膜糖蛋白，HIV gpl20，HCMV，呼吸道合胞病毒RSV F，RSVF Fgp，VNR整聯(lián)蛋白，Hep B gpl20, CMV，gpllbllla, HIV IIIB gpl20 V3 環(huán)，呼吸道合胞病毒(RSV) Fgp，單純皰疹病毒(HSV)gD糖蛋白，HSV gB糖蛋白，HCMV gB包膜糖蛋白，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)毒素及其片段。
[0159]依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白可優(yōu)選結合上文所公開的分子之一。這些分子還包括變應原。
[0160]依照本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，修飾了 CH3第15-17位、第29-34位、第85.4-85.3位、第92-94位、第97-98位和/或第108-110位的氨基酸殘基。
[0161]依照本發(fā)明的免疫球蛋白的修飾優(yōu)選是缺失、替換或插入。
[0162]依照本發(fā)明，至少I`個，優(yōu)選至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個和15個氨基酸遭到缺失，用其它氨基酸(也用經(jīng)修飾的氨基酸)替換，或插入免疫球蛋白的環(huán)區(qū)域。然而，插入免疫球蛋白環(huán)區(qū)域的氨基酸的最大數(shù)目不能超過30個，優(yōu)選不超過25個，更優(yōu)選不超過20個氨基酸。氨基酸替換和插入優(yōu)選通過本領域知道的、本專利申請中公開的方法隨機發(fā)生。
[0163]依照一個具體實施方案,依照本發(fā)明的免疫球蛋白的特征在于當EpCam結合所述免疫球蛋白時CH3區(qū)包含SEQ ID N0.16或SEQ ID N0.18，當熒光素結合所述免疫球蛋白時CH3區(qū)包含SEQ ID N0.20，當溶菌酶結合所述免疫球蛋白時CH3區(qū)包含SEQ IDN0.22，24，26，28，30或32，當TLR9結合所述免疫球蛋白時CH3區(qū)包含SEQ ID N0.34，36，38或40，而當溶菌酶和/或紅細胞生成素結合所述免疫球蛋白時CH3區(qū)包含SEQ ID N0.42。
[0164]依照本發(fā)明的一個具體實施方案，免疫球蛋白的特征在于在溶菌酶和gp41結合所述免疫球蛋白時它包含SEQ ID N0.44或SEQ ID N0.46。
[0165]經(jīng)修飾的免疫球蛋白優(yōu)選偶聯(lián)選自下組的標記物或受體分子:有機分子、酶標記物、放射性標記物、有色標記物、熒光標記物、顯色標記物、發(fā)光標記物、半抗原、洋地黃毒苷、生物素、金屬配合物、金屬、膠體金及其混合物。
[0166]偶聯(lián)有上文指定的標記物的經(jīng)修飾的免疫球蛋白可用于例如診斷方法。[0167]本發(fā)明的另一個方面涉及依照本發(fā)明的或可通過依照本發(fā)明的方法獲得的免疫球蛋白用于制備供自動免疫接種(active immunization)的疫苗的用途。據(jù)此，免疫球蛋白或是作為抗原性藥物物質用于配制疫苗或者用于釣取或捕獲抗原性結構供疫苗配制劑之用。
[0168]本發(fā)明的另一個方面涉及依照本發(fā)明的或可通過依照本發(fā)明的方法獲得的免疫球蛋白用于制備免疫球蛋白的蛋白質文庫的用途。
[0169]本發(fā)明的還有一個方面涉及用于特異性結合和/或檢測分子的方法，包括下列步驟:
[0170](a)使依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白或可通過依照本發(fā)明的方法獲得的經(jīng)修飾的免疫球蛋白接觸懷疑含有所述分子的測試樣品，并
[0171](b)檢測特異性免疫球蛋白/分子復合物的潛在形成。
[0172]本發(fā)明的另一個方面涉及用于特異性分離某種分子的方法，包括下列步驟:
[0173](a)使依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白或可通過依照本發(fā)明的方法獲得的經(jīng)修飾的免疫球蛋白接觸含有所述分子的樣品，
[0174](b)分離形成的特異性免疫球蛋白/分子復合物，并
[0175](C)任選從所述復合物分離該分子。
[0176]依照本發(fā)明的免疫球蛋白可用于從樣品中特異性分離分子。如果使用多特異性免疫球蛋白，那么可以從樣品中分離超過一種分子。在此類方法中使用經(jīng)修飾的免疫球蛋白是尤其有利的，因為它容許例如生成具有同質表面且限定量的能夠結合待分離分子的結合配偶體(即經(jīng)修飾的免疫球蛋白)固定其上的基質。與之相反，如果使用單特異性結合配偶體，那么無法生成同質基質，因為單一結合配偶體并非以相同效率結合基質。
[0177]本發(fā)明的另一個方面涉及用于將化合物靶向靶物的方法，包括下列步驟:
[0178](a)將能夠特異性結合所述化合物的依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白或可通過依照本發(fā)明的方法獲得的經(jīng)修飾的免疫球蛋白與所述化合物接觸，
[0179](b)將特異性免疫球蛋白/化合物復合物投遞至靶物。
[0180]依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白可用于將至少一種結合⑶R和/或經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域的化合物投遞至靶物。此類免疫球蛋白可用于在疾病的治療過程中將治療性物質靶向優(yōu)選作用部位。
[0181 ] 本發(fā)明的另一個方面涉及包含依照本發(fā)明的或者可通過依照本發(fā)明的方法獲得的免疫球蛋白的蛋白質文庫。
[0182]用于構建所述文庫的優(yōu)選方法可在上文和實施例中找到。依照本發(fā)明的文庫可用于鑒定結合獨特分子的免疫球蛋白。
[0183]具體而言，本發(fā)明涉及包含依照本發(fā)明的或者可通過依照本發(fā)明的方法獲得的免疫球蛋白的蛋白質文庫用于設計免疫球蛋白衍生物的用途?？筛淖儸F(xiàn)有的免疫球蛋白，通過使用各結構域的至少10種，優(yōu)選100種，更優(yōu)選1000種，更優(yōu)選10000種，更優(yōu)選100000種，最優(yōu)選超過1000000種具有至少一個經(jīng)修飾的環(huán)的變異結構域的蛋白質文庫，將抗原結合位點引入任何結構域或微型結構域。然后對文庫篩選對特定抗原的結合。在對期望特性進行分子表征后，通過遺傳工程技術將選擇的結構域或微型結構域克隆到最初的免疫球蛋白中，使得它替換野生型區(qū)域?；蛘?，可以只交換編碼環(huán)或編碼突變氨基酸的DNA以獲得具有對特定抗原的額外結合位點的免疫球蛋白。
[0184]突變的、抗原特異性的結構環(huán)的位點的選擇取決于最初免疫球蛋白的結構和額外結合位點的目的。如果例如最初的分子是需要插入額外抗原結合位點且不干擾效應物功能的完整免疫球蛋白，那么待修飾的環(huán)將從遠離CH2和CH3的結構域中選擇，CH2和CH3是Fe效應物分子的天然結合配偶體。如果最初的免疫球蛋白是Fab，那么有可能修飾輕鏈或重鏈的恒定區(qū)或可變區(qū)中的環(huán)。為了生成文庫，可制備突變的最初分子的文庫，它們在一個或多個結構域的一個或多個結構環(huán)中具有突變。對完整的、突變的最初分子的選擇可具有一些優(yōu)勢，在于對經(jīng)修飾的結構環(huán)選擇抗原結合將瞄準空間有利的修飾，如果還測試突變型免疫球蛋白應當顯示的其它特性的話。
[0185]突變的結構域或微型結構域或結構域融合分子的蛋白質文庫的庫容量要求(即變異蛋白質數(shù)目)取決于目標。一般而言，用于從頭生成抗原結合位點的文庫需要比用于進一步修飾早就存在的由經(jīng)修飾的結構環(huán)構成的工程改造的抗原結合位點的文庫(例如用于提高親和力或改變對抗原的精細特異性)更大。
[0186]本發(fā)明還涉及包含多種免疫球蛋白的免疫球蛋白文庫或核酸文庫，例如恒定區(qū)或可變區(qū)、微型結構域和/或微型結構域中所包含的至少一個結構環(huán)區(qū)域、或者編碼它們的核酸分子。文庫包含具有不同修飾的成員，其中多數(shù)由至少一個結構環(huán)區(qū)域中的修飾限定。核酸文庫優(yōu)選包含至少10個不同成員(導致一處氨基酸交換)，更優(yōu)選包含至少100個,更優(yōu)選1000個或10000個不同成員(例如通過隨機化策略或組合技術設計)。甚至更多多樣化個體成員數(shù)，諸如至少1000000個或至少10000000個也是優(yōu)選的。
[0187]本發(fā)明的另一個方面是選自至少兩個依照本發(fā)明的文庫的兩種不同結構域或微型結構域的組合，以生成多特異性免疫球蛋白。這些選擇的特定免疫球蛋白可相互組合，與其它分子組合，類似于積木(building block)，以設計結構域或微型結構域的最佳排列以得到期望特性。
[0188]此外，可以將依照本發(fā)明的一種或多種經(jīng)修飾的免疫球蛋白弓丨入蛋白質的多個或所有可能的不同位點而不破壞蛋白質的結構。通過這樣一種“結構域改組”技術，產(chǎn)生了可再次選擇期望特性的新文庫。
[0189]優(yōu)選的文庫包含依照本發(fā)明的，選自免疫球蛋白的結構域、微型結構域或其衍生物的免疫球蛋白。
[0190]本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是抗原的結合分子(抗原結合分子)，所述抗原的結合分子包含至少一個免疫球蛋白結構域和結構環(huán)區(qū)域，所述結構環(huán)區(qū)域為結合抗原而依照本發(fā)明修飾的，其中所述結合分子不包含抗體的可變區(qū)。它可包含可用于抗體活性的其它部分(例如諸如天然的或經(jīng)修飾的效應物區(qū)域(序列))；然而，它在抗體的“天然”結合區(qū)即可變區(qū)的天然存在位置缺乏可變區(qū)。依照本發(fā)明的這些抗原結合分子具有上文關于現(xiàn)有分子描述的優(yōu)勢，但沒有抗體的特異性結合活性；然而，具有在結構環(huán)區(qū)域中新引入的特異性結合活性。
[0191]優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的這些抗原結合分子包含CH1、CH2、CH3、CH4、Igk-C, Igl-C及其組合；所述組合包含至少兩個，優(yōu)選至少四個，尤其是至少六個恒定區(qū)且至少一個結構環(huán)區(qū)域依照本發(fā)明修飾。優(yōu)選的是，這些結構環(huán)區(qū)域或是經(jīng)依照本發(fā)明的結構環(huán)區(qū)域連接，或是經(jīng)天然存在于兩個此類恒定區(qū)之間的結構環(huán)連接。依照本發(fā)明的這些抗原結合分子的一個實施方案由在結構環(huán)中具有至少一處依照本發(fā)明的修飾的，抗體的Fe區(qū)組成。同樣，對于依照本發(fā)明的抗原結合分子，優(yōu)選結構環(huán)中新的抗原結合位點是通過隨機化技術引入的，即通過隨機化技術交換環(huán)的一個或多個氨基酸殘基，或者通過將隨機生成的插入物引入此類結構環(huán)?；蛘?，優(yōu)選使用組合方法。
[0192]依照另一個方面，本發(fā)明涉及在一個或多個結構環(huán)中摻入了對未修飾免疫球蛋白而言外源的抗原結合位點的經(jīng)修飾的免疫球蛋白。術語“外源的”意味著抗原結合位點不是由免疫球蛋白的特定區(qū)域天然形成的，而且外源的結合配偶體而非免疫球蛋白的天然結合配偶體得到抗原結合位點的結合。這意味著結合配偶體，諸如Fe受體或免疫系統(tǒng)的效應物，不認為受到對未修飾免疫球蛋白而言外源的抗原結合位點的結合。
[0193]優(yōu)選的是，抗原選自:病原體抗原、腫瘤相關抗原、酶、底物、自身抗原、有機分子或變應原。更優(yōu)選的抗原選自:病毒抗原、細菌抗原、或來自真核生物或噬菌體的抗原。優(yōu)選的病毒抗原包括HAV、HBV、HCV、HIV 1、HIV I1、細小病毒、流感病毒、HSV、肝炎病毒、黃病毒、西尼羅河病毒、埃博拉病毒、痘病毒、天花病毒、麻疹病毒、皰疹病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、多瘤病毒、細小病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、脊髓灰質炎病毒、艾柯病毒、日本腦炎病毒、登革病毒、蜱媒腦炎病毒、黃熱病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、拉克羅斯病毒、拉沙病毒、狂犬病病毒、輪狀病毒抗原；優(yōu)選的細菌抗原包括假單胞菌、分枝桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌、腦膜炎球菌、疏螺旋體、利斯特氏菌、奈瑟氏球菌、梭菌、埃希氏菌、軍團菌、芽孢桿菌、乳桿菌、鏈球菌、腸球菌、棒桿菌、諾卡氏菌、紅球菌、莫拉氏菌、布魯氏菌、彎曲桿菌、肉桿菌、弗朗西絲氏菌、螺桿菌、嗜血菌、克雷伯氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌、弧菌、衣原體、鉤端螺旋體、立克次氏體、分枝桿菌、密螺旋體、巴爾通氏體抗原。病原性真核生物的優(yōu)選真核生物抗原包括來自賈第鞭毛蟲、弓形體、環(huán)孢菌、隱孢子蟲、毛線蟲、酵母、假絲酵母、曲霉、隱球酵母、芽生菌、組織胞漿菌、球孢菌的抗原。
[0194]依照本發(fā)明的優(yōu)選免疫球蛋白包含至少兩個抗原結合位點，第一位點結合第一表位而第二位點結合第二表位。
[0195]依照一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的免疫球蛋白包含至少兩個環(huán)區(qū)域，第一環(huán)區(qū)域結合第一表位而第二環(huán)區(qū)域結合第二`表位。或是至少第一或至少第二環(huán)區(qū)域或者二者可包含結構環(huán)。依照本發(fā)明的免疫球蛋白包括其本領域知道有功能的、包含依照本發(fā)明的本質元件一依照本發(fā)明修飾的結構環(huán)區(qū)域的片段。
[0196]優(yōu)選的是，依照本發(fā)明的免疫球蛋白由至少兩個免疫球蛋白結構域或其包括微型結構域的部分構成，且每個結構域包含至少一個抗原結合位點。
[0197]還優(yōu)選這樣的依照本發(fā)明的免疫球蛋白，它包含免疫球蛋白的至少一個恒定區(qū)的結構域和/或可變區(qū)的至少一個結構域，或其包括微型結構域的部分。如此，例如C末端區(qū)域有修飾的可變區(qū)，或與經(jīng)修飾的CHl區(qū)例如經(jīng)修飾的CHl微型結構域連接的可變區(qū)是優(yōu)選實施方案之一。
[0198]依照本發(fā)明的優(yōu)選免疫球蛋白包含與未修飾結構域具有至少50%同源性的結構域。
[0199]術語“同源性”表示多肽在一級、二級或三級結構的對應位置具有相同或保守的殘基。該術語還延伸至編碼同源多肽的兩種或多種核苷酸序列。
[0200]“同源免疫球蛋白結構域”意味著依照本發(fā)明的免疫球蛋白結構域相對于本文中所公開的全長天然序列免疫球蛋白結構域序列或全長免疫球蛋白結構域序列的任何其它片段具有至少約50%的氨基酸序列同一性。優(yōu)選的是，同源免疫球蛋白結構域將與本文中所公開的天然免疫球蛋白結構域序列或全長免疫球蛋白結構域序列的任何其它明確限定片段具有至少約50%的氨基酸序列同一性，優(yōu)選至少約55%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約60%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約65%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約70%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約75%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約80%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約85%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約90%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約95%的氨基酸序列同一性。 [0201]關于本文中所鑒定的免疫球蛋白結構域序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定義為對比序列并在必要時引入缺ロ以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與特定免疫球蛋白結構域序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以本領域技術范圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可決定用于測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。
[0202]%氨基酸序列同一性值可使用WU-BLAST-2計算機程序(Altschul et al., Methodsin Enzymology 266:460-480(1996))如下所述獲得。大多數(shù)WU-BLAST-2搜索參數(shù)設成缺省值。不設成缺省值的參數(shù)，即可調整參數(shù)設成如下值:交疊跨度=1，交疊分數(shù)=0.125，詞閾值(T) = 11，和評分矩陣=BL0SUM62。在采用WU-BLAST-2時，％氨基酸序列同一性值是通過將(a)通過WU-BLAST-2確定的具有衍生自天然免疫球蛋白結構域的序列的目的免疫球蛋白結構域氨基酸序列和目的比較氨基酸序列(即目的免疫球蛋白結構域針對其進行比較的序列，它可以是未修飾的免疫球蛋白結構域)之間的匹配相同氨基酸殘基數(shù)除以(b)目的免疫球蛋白結構域的未隨機化部分的氨基酸殘基總數(shù)確定的。例如，在敘述“包含與氨基酸序列B具有至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列A的多肽”中，氨基酸序列A是目的比較氨基酸序列，氨基酸序列B是目的免疫球蛋白結構域的氨基酸序列。
[0203]在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的免疫球蛋白是雙特異性抗體或雙特異性單鏈抗體。進ー步優(yōu)選的是免疫球蛋白包含雙特異性結構域或其包括微型結構域的部分。
[0204]依照本發(fā)明的免疫球蛋白可用于本領域知道的關于免疫球蛋白的任何目的，但還使得依賴于通過本發(fā)明引入的特異性組合的應用成為可能。因此，依照本發(fā)明的免疫球蛋白優(yōu)選用于治療和預防用途(例如作為自動或被動免疫療法)；用于制備和分析用途；及用于診斷用途。
[0205]本發(fā)明的另ー個方面涉及結合配偶體的試劑盒，包括:
[0206](a)在ー個或多個結構環(huán)中摻入對免疫球蛋白而言外源的抗原結合位點的經(jīng)修飾的免疫球蛋白，和
[0207](b)包含所述抗原表位的結合分子。
[0208]依照本發(fā)明的這種試劑盒的這樣ー種結合分子可用于鑒定依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白的結合特異性。通過使用依照本發(fā)明的這種試劑盒的，可測定依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白的效カ(potency)。
[0209]效カ在本文中定義為經(jīng)修飾的分子對其抗原的結合特性。結合可以在特異性和/或親和カ和/或親合力方面定量和/或定性測定，用于質量控制目的。
[0210]此外，依照本發(fā)明的試劑盒的結合分子可用于從由至少10種、優(yōu)選至少100種、更優(yōu)選至少1000種、更優(yōu)選至少10000種、尤其至少100000種在結構環(huán)中具有不同修飾的免疫球蛋白組成的文庫中選擇依照本發(fā)明的經(jīng)修飾的免疫球蛋白。
[0211]依照本發(fā)明，本發(fā)明的主要特色之ー在于免疫球蛋白結構域的工程改造發(fā)生在正常情況下不牽涉抗原結合的區(qū)域中，換言之，在抗體的CDR以外的區(qū)域中。觀察到免疫球蛋白結構域的特定折疊結構容許在結構與CDR類似但序列中位置不同的區(qū)域中引入隨機突變。通過本發(fā)明鑒定的區(qū)域是像CDR —樣連接免疫球蛋白折疊結構的P折疊鏈的環(huán)區(qū)域。
[0212]更具體的說，本文中描述了通過在連接人IgGl CH3結構域的P折疊鏈A-B和E-F的環(huán)中引入隨機突變，選擇了特異性結合Toll樣受體9肽(TLR-9)或雞卵溶菌酶的突變型CH3結構域，Toll樣受體9肽(TLR-9)和雞卵溶菌酶分別是在正常情況下不受人IgGl的CH3結構域識別和結合的肽和蛋白質。由我們引入的突變包括其中在野生型序列中選擇的氨基酸殘基用隨機選擇的殘基替換的突變，它們還包括在上文所述環(huán)中插入額外氨基酸殘基。
[0213]通過類推，來自任何類別的免疫球蛋白和來自任何物種的免疫球蛋白的免疫球蛋白結構域都適用于這種類型的工程改造。此外，不僅可操作本發(fā)明所瞄準的特定環(huán)，而且可以相同方式操作免疫球蛋白中連接P折疊鏈的任何環(huán)。
[0214]來自任何生物體和來自任何類別免疫球蛋白的工程改造的免疫球蛋白結構域可依照本發(fā)明使用，或是就這樣(作為單ー結構域)或者作為更大分子的一部分。例如，它們可以是完整免疫球蛋白的一部分，該完整免疫球蛋白因此將具有其由6個CDR形成的“正?！笨乖Y合區(qū)和新的工程改造的抗原結合區(qū)。像這樣，可生成多特異性，例如雙特異性免疫球蛋白。工程改造的免疫球蛋白結構域還可以是任何融合蛋白的一部分。這些工程改造的免疫球蛋白結構域的用途在免疫球蛋白 的一般用途領域中。
[0215]本文中將下列免疫球蛋白的結構域理解為免疫球蛋白結構域:
[0216]對IgG, IgD 和 IgA:VL、CL、VH、CH1、CH2、CH3 ；
[0217]對IgM 和 IgE:VL、CL、VH、CH1、CH2、CH3、CH4。
[0218]1.單ー免疫球蛋白結構域，一側隨機化，即連接P折疊鏈B-C、D-E或F-G (“尖端”，除了被許多專利覆蓋的可變區(qū))或者0折疊鏈A-B、C-D (在可變區(qū)的情況中是C-C'和C" -D)或E-F (“底部”)的環(huán)中?？呻S機化單ー環(huán)或任何環(huán)組合。可改變、缺失殘基，或者可插入額外殘基。
[0219]2.單ー免疫球蛋白結構域，在尖端和底部兩側都隨機化。
[0220]3.包含單ー隨機化結構域之一的任何蛋白質，諸如:
[0221]a) “單鏈 CH3” 二聚體(scCH3)、scCH2、scCHl/CL，一側或兩側隨機化
[0222]b)單鏈Fv，“底部”隨機化，即⑶R的對側
[0223]c)Fab片段，“底部”隨機化，即CHl和CL結構域的C末端
[0224]d)Fc片段(即由CH2-CH3組成的蛋白質)，一側或兩側隨機化
[0225]e)完整免疫球蛋白，F(xiàn)e底物隨機化
[0226]f)其它合適的結構域
[0227]単一結構域的主要優(yōu)勢與用于倡儀駱駝VH分子(“nanobodies”(納米抗體)，參閱WWW, ablynx.com)的所有論點非常相似。隨機化免疫球蛋白結構域是非常小的蛋白質(分子量約12_15kDa，取決于插入的氨基酸殘基數(shù))，因此與常規(guī)抗體或抗體片段諸如scFv和Fab相比將具有下列優(yōu)勢:識別不常見的或隱藏的表位，結合到蛋白質靶物的空腔或活性位點中，易于制造，及許多其它的。在兩側都隨機化的免疫球蛋白結構域的情況中，可生成二價或雙特異性分子。作為融合蛋白一部分的単一結構域的主要優(yōu)勢在于可在任何其它蛋白質上工程改造額外結合特性。
[0228]設想了任何表達系統(tǒng)都可用于制備蛋白質。本文中所描述的單一結構域的類似物可在來自駱駝的抗體中找到，它只具有VH但沒有VL。在這些蛋白質，只有3個⑶R (而非“正?！笨贵w中的6個)負責抗原結合。
[0229]將下列專利參考文獻收入本文作為參考，就像完整列出它們ー樣:
[0230]US 6，294，654 Modified immunoglobulin molecule incorporating an antigenin a non-⑶R loop region (在非⑶R環(huán)區(qū)中摻入抗原的改良免疫球蛋白分子)
[0231]US 5，844，094 Target binding polypeptide (革巴結合多妝)
[0232]US 5，395，750 Methods for producing proteins which bind to predeterminedantigens (用于生成結合預定抗原的蛋白質的方法)
[0233]US 2004/0071690 High avidity polyvalent and polyspecific reagents (高親合力、多價和多特異性試劑)
[0234]US 2004/0018508 Surrogate antibodies and methods of preparation and usethereof (代用抗體及其制備和使用方法)
[0235]US 2003/0157`091 Mult1-functional proteins (多功能蛋白質)
[0236]US 2003/0148372 Method to screen phage display libraries with differentligands (用不同配體篩選噬菌體展示文庫的方法)
[0237]US 2002/0103345 Bispecific immunoglobulin_like antigen bindingproteins and method of production (雙特異性免疫球蛋白樣抗原結合蛋白質及生產(chǎn)方法)
[0238]US 2004/0097711 Immunoglobulin superfamily proteins (免疫球蛋白超家族蛋白質)
[0239]US 2004/0082508 Secreted proteins (分泌型蛋白質)
[0240]US 2004/0063924 Secreted proteins (分泌型蛋白質)
[0241]US 2004/0043424 Immunoglobulin superfamily proteins (免疫球蛋白超家族蛋白質)
[0242]US 5，892，019 Production of a single-gene-encoded immunoglobulin (單基因編碼的免疫球蛋白的生成)
[0243]US 5，844，094Target binding polypeptide (革巴結合多妝)
[0244]下面的附圖和實施例進ー步例示而非限制本發(fā)明。
[0245]圖1a顯示了完整IgGl的結構。箭頭標示各結構域。
[0246]圖1b圖示了人免疫球蛋白主要同種型單體的結構組織。二硫鍵以線表示，N連接碳水化合物基團以圓表不。
[0247]圖2顯示了免疫球蛋白恒定區(qū)(左圖)和可變區(qū)(右圖)的免疫球蛋白折疊結構。箭頭標示0折疊鏈。
[0248]圖3顯示了依照本發(fā)明的工程改造的CH3結構域的分子模型，隨機化部分以溶劑可到達表面標示。所述表面以圈圍繞。
[0249]圖4顯示了用于生成裝配突變型CH3結構域所用片段的PCR的示意圖。箭頭標示PCR引物，它們各自采取5’ -3’取向，而垂直線標示為了裝配突變型基因而引入的限制性位點的大致位置。引物上包含下列限制性位點供PCR片段的連接之用:CH3LNC0:NcoI ；CH3LSAC 和 CH3CSAC:SacI ;CH3CHIN 和 CH3RHIN =HindIII ；CH3RN0T =Not10
[0250]圖5顯示了如何使用本申請的免疫球蛋白結構域的ー些例子。以星形符號表示隨機化區(qū)域。ー個分子中的隨機化區(qū)域的特異性可以是相同的或者是不同的。
[0251]圖6顯示了雙特異性工程改造的CH3結構域的設計示意圖。框中給出了引物的名稱，箭頭標示引物的延伸方向。帶傾斜線的框標示此構建物中隨機化的區(qū)域的相對位置，帶垂直線的框標示為了生成克隆C24而引入的區(qū)域的相對位置，而且給出了用于克隆程序的限制性位點。
[0252]圖7顯示了雙特異性工程改造的CH3結構域的設計示意圖。顯示了雙特異性工程改造的CH3結構域的基本設計的核苷酸序列及其翻譯結果。紅色序列標示為了生成雙特異性構建物而隨機化的區(qū)域，而綠色框標示其中序列為了生成克隆C24而隨機化的區(qū)域。
[0253]圖8顯示了本文中所公開的序列的序列表。
[0254]具體實施例的描述
[0255]實施例1:CH3文庫的構建和噬菌體表面展示
[0256]使用Brookhaven數(shù)據(jù)庫中條目10Q0.pdb公開的IgGl Fe片段的晶體結構來輔助設計突變型CH3結構域。
[0257]作為CH3文庫構建的基礎使用的序列見SEQ ID N0.1。在此序列中，第一個氨基酸對應于Brookhaven數(shù)據(jù)庫條目10Q0.pdb的A鏈的脯氨酸343。10Q0.pdb中所含最后ー個殘基是SEQ ID N0.1的絲氨酸102。在詳細分析lOQ0.pdb的結構并直觀檢查形成連接3鏈的環(huán)的殘基后，決定將殘基17、18和19 (它們是連接P鏈A-B的環(huán)的一部分)以及殘基71、72、73、76和77 (它們是連接SEQ ID N0.1的P鏈E-F的環(huán)的一部分)隨機化。工程改造CH3結構域的分子模型見圖3，以溶劑可到達表面標示隨機化部分。通過一系列PCR反應，接著連接所得PCR產(chǎn)物，生成工程改造基因。為了便于連接，修飾編碼SEQ ID N0.1的核苷酸序列的有些密碼子以生成限制性位點但不改變氨基酸序列(沉默突變)。為了插入克隆載體 pHENl (Nucleic Acids Res.1991 Aug 11; 19 (15):4133-7.Mult1-subunit proteinson surface of filamentous phage!methodologies for displaying antibody (Fab)heavy and light chains.Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, HudsonP, Winter G.),與pelB分泌信號處于同一讀碼框，在序列的5’末端附著編碼Met-Ala的額外核苷酸殘基以生成NcoI限制性位點。對于隨機化殘基，選擇編碼所有20種天然存在氨基酸但避免3種終止密碼子中2種的密碼子NNS(IUPAC代碼，其中S指C或G)。工程改造序列的核苷酸序列見SEQ ID N0.2，氨基酸序列見SEQ ID N0.3。SEQ ID N0.3中的字母X表示隨機化氨基酸殘基。用于裝配突變型CH3結構域的PCR引物的序列見SEQ ID N0.4_9。圖4顯示了為了裝配突變基因而生成的PCR片段及所用引物的示意圖。
[0258]使用人單克隆抗體3D6 的重鏈的 cDNA (Felgenhauer M, Kohl J, RiikerF.Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V—regions of H-and L—chains ofa human monoclonal antibody specific to HIV_l_gp4L Nucleic Acids Res.1990 Aug25; 18 (16):4927)作為PCR反應的模板。將3種PCR產(chǎn)物分別用SacI和/或HindIII消化并連接到一起。將連接產(chǎn)物進ー步用NcoI和NotI消化并連接到已經(jīng)用NcoI和NotI消化過的表面展示噬菌粒載體PffiNl中。選擇許多克隆通過限制性分析和DNA測序進行檢驗，發(fā)現(xiàn)它們包含計劃的插入物，包括正確插入的隨機化序列。制備噬菌體的后續(xù)步驟遵循標準方案。簡而言之，將連接混合液通過電穿孔轉化到大腸桿菌TGl細胞中。隨后用輔助噬菌體M13-K07從大腸桿菌TGl細胞回收(rescue)噬菌體顆粒。然后以2步用PEG/NaCl從培養(yǎng)物上清液沉淀噬菌體顆粒，溶于水，并用于通過淘選進行的選擇，或者保存于_80°C。
[0259]實施例2:CH3+3文庫的構建
[0260]此文庫以與CH3文庫相同的方式構建和克隆。構建物的氨基酸序列見SEQ IDN0.10，對應的核苷酸序列見SEQ ID N0.11，而構建所用引物見SEQ ID N0.4-7,SEQ ID N0.9和 SEQ ID N0.12。
[0261]實施例3:CH3+5文庫的構建
[0262]此文庫以與CH3文庫相同的方式構建和克隆。構建物的氨基酸序列見SEQ IDN0.13，對應的核苷酸序列見SEQ ID N0.14，而構建所用引物見SEQ ID N0.4-7,SEQ ID N0.9和 SEQ ID N0.15。
[0263]實施例4:CH3噬菌體文庫對TLR-9肽的淘選
[0264]依照標準方案進行3輪淘選。簡而言之，應用如下方法。用代表Toll樣受體9 (TLR-9)的部分序列的合成肽包被Maxisorp 96孔板(Nunc)。向姆個孔中加入200 y I下列溶液:0.1M碳酸鈉緩沖液，pH 9.6，含下列濃度的溶解的肽:
[0265]第I 輪淘選:lmg/ml TLR`-9 肽
[0266]第2 輪淘選:500ii g/ml TLR-9 肽
[0267]第3 輪淘選:100ii g/ml TLR-9 肽
[0268]于37°C溫育I小時，接著每個孔用200 U 12%奶粉(M-PBS)于室溫封閉I小時。
[0269]然后通過添加100 U I噬菌體懸浮液和100 U 14%奶粉(M-PBS)，接著于室溫振搖溫育45分鐘、靜置溫育90分鐘，容許表面展示噬菌體文庫與所結合的肽反應。
[0270]如下洗去未結合的噬菌體顆粒。在第I輪淘選后:10x300iil T-PBS, 5x300 U IPBS ;在第 2 輪淘選后:15x300iil T-PBS, 10x300 u I PBS ;在第 3 輪淘選后:20x300 ylT-PBS, 20x300 u I PBS。
[0271]通過向每個孔中添加200 U 10.1M甘氨酸pH 2.2并于室溫振搖溫育30分鐘，進行所結合噬菌體顆粒的洗脫。隨后，通過添加60iil2M Tris-堿中和噬菌體懸浮液，接著通過混合IOml指數(shù)式生長的培養(yǎng)物與0.5ml洗脫的噬菌體并于37°C溫育30分鐘，感染到大腸桿菌TGl細胞中。最后，將受感染的細菌涂布在含1%葡萄糖和IOOii g/ml氨芐青霉素的TYE培養(yǎng)基上，并于30°C溫育過夜。
[0272]表1:CH3_噬菌體文庫對TLR-9肽的淘選結果(噬菌體滴度)
[0273]淘選輪次淘選時TLR-9的濃度輸入(噬菌體/ml)輸出(噬菌體/ml)
[0274]第I 輪lmg/ml6xl0182xl010
[0275]第2 輪0.5mg/ml4xl0182xl010[0276]第3 輪0.lmg/ml4xl0226xl010
[0277]實施例5:克隆針對TLR-9選擇的CH3突變體的選定克隆供可溶性表達
[0278]用微量制備試劑盒(mid1-prep)分離來自通過3輪淘選選擇的曬菌體的曬菌粒DNA。通過PCR分批擴增編碼突變的CH3區(qū)的DNA，并以Nco1-NotI克隆到載體pNOTBAD/Myc-His中，該載體是插入了 NotI限制性位點以便于克隆的大腸桿菌表達載體pBAD/Myc-His (Invitrogen)。通過電穿孔將連接構建物轉化到大腸桿菌LMG194細胞(Invitrogen)中，并于30°C在含1%葡萄糖和氨芐青霉素的TYE培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。將選擇的克隆接種到200 u I含氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中，于30°C培養(yǎng)過夜，并通過添加L-阿拉伯糖至終濃度0.1%而誘導。于16°C表達過夜后，通過離心收獲細胞，并用IOOiU硼酸鈉緩沖液pH 8.0于4°C處理過夜以制備周質提取物。取50 ill周質提取物用于ELISA (見下文)。
[0279]實施例6:針對TLR-9選擇的CH3突變體的ELISA
[0280]通過ELISA對選擇的克隆測定對TLR-9肽的特異性結合。
[0281]包被:微量滴定板(NUNC,Maxisorp)，100 yl/孔，20 y g TLR-9 肽/ml0.1M 碳酸鈉緩沖液pH 9.6，37°C，1小時
[0282]清洗:3x200ii I PBS
[0283]封閉:1%BSA-PBS，室溫，I小時
[0284]清洗:3x200ii I PBS
[0285]周質提取物結合:50 ill周質提取物，50 u 12%BSA-PBS,室溫，過夜
[0286]清洗:3x200ii I PBS
[0287]ー抗:抗 His4 (Qiagen)，1:1000 在 1%BSA-PBS 中稀釋，室溫，90 分鐘，100 U I/ 孔
[0288]清洗:3x200ii I PBS
[0289]二抗:山羊抗小鼠*HRP (SIGMA)，1:1000在1%BSA-PBS中稀釋，室溫，90分鐘，IOOu I/孔
[0290]清洗:3x200ii I PBS
[0291 ]檢測:3mg/ml OPD 溶于 Na-檸檬酸 / 磷酸緩沖液 pH 4.5，0.4 y 130%H202
[0292]停止:100ml3MH2SO4
[0293]吸光度讀數(shù):492/620nm
[0294]將在此第一次、初歩ELISA中給出高信號的克隆如上所述以相同條件在20ml體積中培養(yǎng)。如上所述在1/20培養(yǎng)物體積中分離它們的周質提取物并通過ELISA (如上所述)測試供確認。
[0295]表2:確認ELISA的結果
[0296]
【權利要求】
1.用于工程改造免疫球蛋白的方法，包含在所述免疫球蛋白的結構環(huán)區(qū)域中的至少一處修飾并測定所述免疫球蛋白對抗原表位的結合，其中未修飾的免疫球蛋白不顯著結合所述表位，所述方法包括下列步驟:一提供編碼包含至少一個結構環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白的核酸，一修飾至少一個所述結構環(huán)區(qū)域的至少一個核苷酸殘基，一將所述經(jīng)修飾的核酸轉移入表達系統(tǒng)，一表達所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白，一使表達的經(jīng)修飾的免疫球蛋白與表位接觸，并一測定所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白是否結合所述表位。
2.依照權利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白特異性結合于至少兩種不同表位。
3.依照權利要求1或2任一項的方法，包含在所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)域中至少一處修飾，并測定所述至少一個環(huán)區(qū)域對至少一種選自下組的分子的特異性結合:變應原、腫瘤相關抗原、自身抗原、酶、細菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和原生動物抗原，其中包含未修飾結構環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白不特異性結合所述至少一種分子。
4.用于制造免疫球蛋白或其藥用制劑的方法，包含在所述免疫球蛋白的結構環(huán)區(qū)域中的至少一處修飾，并測定所述免疫球蛋白對抗原表位的結合，其中未修飾的免疫球蛋白不顯著結合所述表位，所述方法包括下列步驟:一提供編碼包含至少一個環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白的核酸，一修飾至少一個所述環(huán)區(qū)域的至少一個核苷酸殘基，`一將所述經(jīng)修飾的核酸轉移入表達系統(tǒng)，一表達所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白，一使表達的經(jīng)修飾的免疫球蛋白與表位接觸，一測定所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白是否結合所述表位，并一提供結合所述表位的經(jīng)修飾的免疫球蛋白并任選將其制成藥用制劑。
5.用于制造特異性結合至少一種第一分子的多特異性免疫球蛋白或其藥用制劑的方法，在所述免疫球蛋白的至少一個結構環(huán)區(qū)域中包含至少一處修飾，并測定所述至少一個環(huán)區(qū)域對至少一種選自下組的第二分子的特異性結合:變應原、腫瘤相關抗原、自身抗原、酶、細菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和原生動物抗原，其中包含未修飾結構環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白不特異性結合所述至少一種第二分子，該方法包括下列步驟:一提供編碼特異性結合至少一種第一分子、包含至少一個結構環(huán)區(qū)域的免疫球蛋白的核酸，一修飾由所述核酸編碼的至少一個所述環(huán)區(qū)域的至少一個核苷酸殘基，一將所述經(jīng)修飾的核酸轉移入表達系統(tǒng)，一表達所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白，一使表達的經(jīng)修飾的免疫球蛋白接觸所述至少一種第二分子，一測定所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白是否特異性結合第二分子，并一提供對所述至少一種第二分子特異的經(jīng)修飾的免疫球蛋白并任選將其制成藥用制劑。
6.依照權利要求1-5任一項的方法，其中所述免疫球蛋白是人或鼠來源的。
7.依照權利要求6的方法，其中所述人免疫球蛋白選自下組:IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 和 IgM0
8.依照權利要求6的方法，其中鼠免疫球蛋白選自下組:IgA、IgD、IgE、IgGUIgG2A、IgG2B、IgG3 和 IgM。
9.依照權利要求7或8的方法，其中所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈或其一部分。
10.依照權利要求7-9任一項的方法，其中所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白的至少一個恒定區(qū)和/或至少一個可變區(qū)，或其包括微型結構域的部分。
11.依照權利要求10的方法，其中所述恒定區(qū)選自CHl、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C及其組合。
12.依照權利要求11的方法，其中CH1、CH2、CH3和CH4的經(jīng)修飾的的環(huán)區(qū)域包含第7-21位氨基酸、第25-39位氨基酸、第41-81位氨基酸、第83-85位氨基酸、第89-103位氨基酸和第106-117位氨基酸。
13.依照權利要求11的方法，其中人來源的Igk-C和Igl-C的環(huán)區(qū)域包含第8-18位氨基酸、第27-35位氨基酸、第42-78位氨基酸、第83-85位氨基酸、第92-100位氨基酸、第108-117位氨基酸和第123-126位氨基酸。
14.依照權利要求11的方法，其中鼠起源的Igk-C和Igl-C的環(huán)區(qū)域包含第8-20位氨基酸、第26-36位氨基酸、第43-79位氨基酸、第83-85位氨基酸、第90-101位氨基酸、第108-116位氨基酸和第122-125位氨基酸。
15.依照權利要求10的方法，其中人起源的免疫球蛋白的可變區(qū)的結構環(huán)區(qū)域包含第`8-20位氨基酸、第44-50位氨基酸、第67-76位氨基酸和第89-101位氨基酸。
16.依照權利要求10的方法，其中鼠起源的免疫球蛋白的可變區(qū)的結構環(huán)區(qū)域包含第6-20位氨基酸、第44-52位氨基酸、第67-76位氨基酸和第92-101位氨基酸。
17.依照權利要求1-5任一項的方法，其中所述免疫球蛋白是駱駝起源的。
18.依照權利要求17的方法，其中所述免疫球蛋白包含至少一個選自CHl、CH2和CH3的恒定區(qū)。
19.依照權利要求18的方法，其中CH1、CH2和CH3的環(huán)區(qū)域包含第8_20位氨基酸、第24-39位氨基酸、第42-78位氨基酸、第82-85位氨基酸、第91-103位氨基酸和第108-117位氨基酸。
20.依照權利要求1-19任一項的方法,其中對至少一個核苷酸的修飾導致由所述核酸編碼的免疫球蛋白的替換、缺失和/或插入。
21.依照權利要求1-20任一項的方法，其中通過定點隨機突變而修飾至少一個環(huán)區(qū)域的氨基酸。
22.依照權利要求21的方法，其中隨機修飾的核酸分子包含至少一個具有序列5’ -NNS-3’、5’ -NNN-3’ 或 5’ -NNK-3’ 的核苷酸重復單元。
23.依照權利要求1-22任一項的方法,其中表達系統(tǒng)包含載體。
24.依照權利要求1-23任一項的方法，其中經(jīng)修飾的免疫球蛋白在宿主中表達，優(yōu)選在細菌、酵母、植物細胞、動物細胞中或者在植物或動物中表達。
25.依照權利要求1-24任一項的方法，其中經(jīng)修飾的免疫球蛋白對分子的特異性結合通過選自下組的結合測定法測定:免疫學測定法優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、表面等離振子共振測定法、飽和轉移差異核磁共振光譜法、轉移NOE(trNOE)核磁共振光譜法、競爭測定法、組織結合測定法、活細胞結合測定法和細胞提取物測定法。
26.依照權利要求1-25任一項的方法，其中經(jīng)修飾的免疫球蛋白與選自下組的標記物偶聯(lián):有機分子、酶標記物、放射性標記物、有色標記物、熒光標記物、顯色標記物、發(fā)光標記物、半抗原、洋地黃毒苷、生物素、金屬復合物、金屬、膠體金及其混合物。
27.由選自CHl、CH2、CH3、CH4、Igk-C、Igl-C的恒定區(qū)或其包括微型結構域的部分組成的免疫球蛋白，具有至少一個環(huán)區(qū)域，其中所述至少一個環(huán)區(qū)域包含至少一處氨基酸修飾，形成至少一個經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域，其中所述至少一個經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域特異性結合至少一種抗原表位。
28.由重鏈或輕鏈的可變區(qū)或其包括微型結構域的部分組成的免疫球蛋白，具有至少一個環(huán)區(qū)域，其中所述至少一個環(huán)區(qū)域包含至少一處氨基酸修飾，形成至少一個經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域，其中所述至少一個經(jīng)修飾的環(huán)區(qū)域特異性結合至少一種抗原表位。
29.依照權利要求27或28的免疫球蛋白，其中所述抗原選自下組:蛋白質分子、核酸和碳水化合物。
30.依照權利要求27-29任一項的免疫球蛋白，其中所述抗原選自下組:腫瘤相關抗原，特別是EpCAM，腫瘤相關糖蛋白-72 (TAG-72)，腫瘤相關抗原CA125，前列腺特異膜抗原(PSMA)，高分子量黑素瘤相關抗原(HMW-MAA)，表達Lewis Y相關碳水化合物的腫瘤相關抗原，癌胚抗原(CEA)，CEACAM5，HMFG PEM，粘蛋白MUC1，MUC18和細胞角蛋白腫瘤相關抗原，細菌抗原，病毒抗原，變應原，熒光素，溶菌酶，toll樣受體9，紅細胞生成素，CD2，CD3，CD3E, CD4, CDlI, CDlla, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD33(p67 蛋白)，CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6，IL-6R，IL-8，IL-12，IL-15，IL-18，IL-23，干擾素 α，干擾素 β，干擾素 Y ；TNF- a，TNF-β 2，T`NFa , TNFa β，TNF-Rl，TNF-RII，F(xiàn)asL, CD27L, CD30L，4-1BBL，TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1，0X40L，TRAIL 受體-1，Al 腺苷受體，淋巴毒素 β 受體，TACI，BAFF-R，EPO ;LFA-3，ICAM-1，ICAM-3，整聯(lián)蛋白 β?，整聯(lián)蛋白 β2，整聯(lián)蛋白α4/β7，整聯(lián)蛋白α2，整聯(lián)蛋白α3，整聯(lián)蛋白α4，整聯(lián)蛋白α5，整聯(lián)蛋白α6，整聯(lián)蛋白αν，ανβ3整聯(lián)蛋白，F(xiàn)GFR-3，角質形成細胞生長因子，VLA-1，VLA-4，L-選擇蛋白，抗 Id，E-選擇蛋白，HLA，HLA-DR，CTLA-4，T 細胞受體，B7-1，B7-2，VNR 整聯(lián)蛋白，TGF β 1，TGFβ 2，eotaxinl, BLyS(B 淋巴細胞刺激物)，補體 C5，IgE，因子 VII，CD64, CBL, NCA 90，EGFR(ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4)，組織因子，VEGF, VEGFR,內皮縮血管肽受體，VLA-4，碳水化合物諸如血型抗原和相關碳水化合物，Galili糖基化，促胃液素，促胃液素受體，腫瘤相關碳水化合物，半抗原NP帽或NIP帽，T細胞受體α / β，E-選擇蛋白，地高辛，胎盤堿性磷酸酶(PLAP)和睪丸PLAP樣堿性磷酸酶，運鐵蛋白受體，類肝素酶I，人心肌球蛋白，糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)，人巨細胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋白，HIV gpl20, HCMV,呼吸道合胞病毒 RSV F，RSVF Fgp, VNR 整聯(lián)蛋白，H印 B gpl20, CMV，gpIIbIIIa，HIV IIIB gpl20 V3環(huán)，呼吸道合胞病毒(RSV) Fgp，單純皰疹病毒(HSV) gD糖蛋白，HSV gB糖蛋白，HCMV gB包膜糖蛋白，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)毒素及其片段。
31.依照權利要求27-30任一項的免疫球蛋白，其中CH3的第15-17位、第29-34位、第85.4-85.3位、第92-94位、第97-98位和/或第108-110位氨基酸殘基進行了修飾。
32.依照權利要求27-31任一項的免疫球蛋白，其中所述修飾是缺失、替換、插入或其組合。
33.依照權利要求27-32任一項的免疫球蛋白，其中當EpCam結合所述免疫球蛋白時，CH3區(qū)包含SEQ ID N0.16或SEQ ID N0.18，當熒光素結合所述免疫球蛋白時，CH3區(qū)包含SEQ ID N0.20，當溶菌酶結合所述免疫球蛋白時，CH3區(qū)包含SEQ ID N0.22，24，26，28，30或32，當TLR9結合所述免疫球蛋白時，CH3區(qū)包含SEQ ID N0.34，36，38或40，而當溶菌酶和/或紅細胞生成素結合所述免疫球蛋白時，CH3區(qū)包含SEQ ID N0.42。
34.依照權利要求27-33任一項的免疫球蛋白，其中當溶菌酶和gp41結合所述免疫球蛋白時，它包含 SEQ ID N0.44 或 SEQ ID N0.46。
35.依照權利要求27-34任一項的免疫球蛋白，其中經(jīng)修飾的免疫球蛋白與選自下組的標記物或受體分子偶聯(lián):有機分子、酶標記物、放射性標記物、有色標記物、熒光標記物、顯色標記物、發(fā)光標記物、半抗原、洋地黃毒苷、生物素、金屬配合物、金屬、膠體金及其混合物。
36.依照權利要求27-35任一項的或可通過依照權利要求1-26任一項的方法獲得的免疫球蛋白用于制備供自動免疫接種的疫苗的用途。
37.依照權利要求27-35任一項的或可通過依照權利要求1-26任一項的方法獲得的免疫球蛋白用于制備免疫球蛋白的蛋白質文庫的用途。
38.蛋白質文庫，其包含可通過依照權利要求27-35任一項的方法獲得的或可通過依照權利要求1-26任一項的方法獲得的免疫球蛋白。
39.用于特異性結合和/或檢測分子的方法，包括下列步驟:(a)使依照權利要求27-35任一項的經(jīng)修飾的免疫球蛋白或可通過依照權利要求1-26任一項的方法獲得的經(jīng)修飾的免疫球蛋白接觸懷疑含有所述分子的測試樣品，并(b)檢測特異性免疫球蛋白/分子復合物的可能的形成。
40.用于特異性分離分子的方法，包括下列步驟:(a)使依照權利要求27-35任一項的經(jīng)修飾的免疫球蛋白或可通過依照權利要求1-26任一項的方法獲得的經(jīng)修飾的免疫球蛋白接觸含有所述分子的樣品，(b)分離形成的特異性免疫球蛋白/分子復合物，并(c)任選從所述復合物分離該分子。
41.用于將化合物靶向靶物的方法，包括下列步驟:(a)將特異性結合所述化合物的依照權利要求27-35任一項的經(jīng)修飾的免疫球蛋白或可通過依照權利要求1-26任一項的方法獲得的經(jīng)修飾的免疫球蛋白與所述化合物接觸，(b)將特異性免疫球蛋白/化合物復合物投遞至靶物。
42.具有抗原結合位點的經(jīng)修飾的免疫球蛋白，所述抗原結合位點對未修飾免疫球蛋白而言是外源的、并摻入一個或多個結構環(huán)中。
43.依照權利要求42的免疫球蛋白，其中所述抗原選自下組:變應原、腫瘤相關抗原、自身抗原、酶、細菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和原生動物抗原。
44.依照權利要求42或43的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含至少兩個抗原結合位點，第一位點結合第一表位而第二位點結合第二表位。
45.依照權利要求42-44任一項的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含至少兩個環(huán)區(qū)域，第一環(huán)區(qū)域結合第一表位而第二環(huán)區(qū)域結合第二表位。
46.依照權利要求45的免疫球蛋白，其中所述環(huán)區(qū)域包含結構環(huán)。
47.由至少兩個免疫球蛋白結構域或其包括微型結構域的部分構成的、依照權利要求42-46任一項的免疫球蛋白，且每個結構域包含至少一個抗原結合位點。
48.依照權利要求42-47任一項的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白的至少一個恒定區(qū)結構域和/或至少一個可變區(qū)結構域或其包括微型結構域的部分。
49.依照權利要求42-48任一項的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含與未修飾結構域具有至少50%同源性的結構域。
50.依照權利要求42-49任一項的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白是雙特異性抗體或雙特異性單鏈抗體。
51.依照權利要求42-50任一項的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含雙特異性結構域或其包括微型結構域的部分。
52.依照權利要求42-51任一項的免疫球蛋白，用于治療和預防用途。
53.依照權利要求42-51任一項的免疫球蛋白，用于制備和分析用途。
54.依照權利要求42-51任一項的免疫球蛋白，用于診斷用途。
55.由在結構環(huán)中具有不同修飾的、依照權利要求27-35和42-54任一項的至少100種免疫球蛋白組成的文庫。
56.依照權利要求55的文庫，其中所述免疫球蛋白是選自下組的免疫球蛋白:免疫球蛋白的結構域、微型結構域或其衍生物。
57.結合配偶體的試劑盒，包括:(a)在一個或多個結構環(huán)中摻入有對免疫球蛋白而言外源的抗原結合位點的經(jīng)修飾的免疫球蛋白，和(b)包含所述抗原的表位的結合分子。
58.依照權利要求57的試劑盒的結合分子用于鑒定其所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白的結合特異性的用途。
59.依照權利要求57的試劑盒的結合分子用于測定所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白的效力的用途。
60.依照權利要求57的試劑盒的結合分子用于從由在結構環(huán)中具有不同修飾的至少100種免疫球蛋白組成的文庫中選擇所述經(jīng)修飾的免疫球蛋白的用途。
【文檔編號】A61P37/08GK103555733SQ201310486561
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2006年1月5日 優(yōu)先權日:2005年1月5日
【發(fā)明者】弗洛里安.魯克, 戈達納.沃茲尼亞克-諾普, 戈特弗里德.希姆勒 申請人:F-星生物技術研究與開發(fā)有限公司