超長(zhǎng)互補(bǔ)決定區(qū)及其用途
【專利摘要】本文公開(kāi)了免疫球蛋白構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段；以及連接到或插入所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的治療性多肽或其衍生物或變體。本文還提供了免疫球蛋白構(gòu)建體，其包含含有互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3H)或其片段中的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分的哺乳動(dòng)物免疫球蛋白重鏈；以及連接到或插入所述CDR3H的隆突結(jié)構(gòu)域的治療性多肽。本文還提供了免疫球蛋白構(gòu)建體，其包含含有互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3H)或其片段中的莖結(jié)構(gòu)域的至少一部分的哺乳動(dòng)物免疫球蛋白重鏈；以及連接到和插入所述CDR3H的莖結(jié)構(gòu)域的治療性多肽。本文還描述了用于治療和預(yù)防受試者的疾病或狀況的方法和包含本文所述免疫球蛋白構(gòu)建體的組合物。
【專利說(shuō)明】超長(zhǎng)互補(bǔ)決定區(qū)及其用途 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年1月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/584,680和2012年7月 13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/671，629的權(quán)益，這兩篇申請(qǐng)均通過(guò)引用全部并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本文描述了包含超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的免疫球蛋白構(gòu)建體，制備此類構(gòu)建體 的方法，包含此類構(gòu)建體的藥物組合物和藥物，以及利用此類構(gòu)建體和組合物來(lái)預(yù)防、抑制 和/或治療受試者的疾病或狀況的方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 抗體是脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)響應(yīng)于外來(lái)物質(zhì)（抗原）而形成的天然蛋白質(zhì)，主要用 于防御感染。一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，在人工條件下，在動(dòng)物中誘導(dǎo)并得到抗體以便用于疾病狀況的 治療或診斷或用于生物研究。每個(gè)產(chǎn)生個(gè)體抗體的細(xì)胞生成單一類型的具有化學(xué)上確定的 組合物的抗體，然而直接從動(dòng)物血清中獲得的以應(yīng)對(duì)抗原接種的抗體實(shí)際上包含由產(chǎn)生個(gè) 體抗體的細(xì)胞群組生成的不同分子群組（例如，多克隆抗體）。
[0004] 與其他脊椎動(dòng)物抗體相比，一些?？贵w具有不尋常的長(zhǎng)VH⑶R3序列。例如，約 10%IgM包含多達(dá)61個(gè)氨基酸長(zhǎng)的"超長(zhǎng)"⑶R3序列。這些不尋常的⑶R3通常具有多個(gè) 半胱氨酸。通過(guò)稱為V(D)J重組的過(guò)程形成功能性VH基因，其中D-區(qū)域編碼⑶R3的很大 一部分。編碼超長(zhǎng)序列的獨(dú)特D-區(qū)域已經(jīng)在牛中進(jìn)行了確認(rèn)。超長(zhǎng)CDR3部分在?；?組中編碼，并與人相比為其抗體所有組成成分提供了獨(dú)有特征。Kaushik等人（美國(guó)專利 6, 740, 747和No. 7, 196, 185)公開(kāi)了闡明作為探針是有用的牛特有的多種牛種系D-基因序 列和闡明作為疫苗載體是有用的牛VDJ盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)⑶R3的抗體，包括含有超長(zhǎng)⑶R3的文庫(kù)，及其用途。
[0006] 本發(fā)明還提供了抗體或其結(jié)合片段的文庫(kù)，其中該抗體或其結(jié)合片段包含超長(zhǎng) CDR3。
[0007] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3是35個(gè) 或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、40個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、45個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、50個(gè)或更多 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、55個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度或60個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
[0008] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3是35個(gè) 或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
[0009] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含3個(gè) 或更多個(gè)半胱氨酸殘基、4個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、5個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、6個(gè)或更 多個(gè)半胱氨酸殘基、7個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、8個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、9個(gè)或更多個(gè) 半胱氨酸殘基、10個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、11個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基或12個(gè)或更多個(gè) 半胱氨酸殘基。
[0010] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含3個(gè) 或更多個(gè)半胱氨酸殘基。
[0011] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗體或其結(jié)合片段 包含半胱氨酸基序。
[0012] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自 包含SEQIDN0S:45-156的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案 中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S:45-99的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施 方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDNOS:45-135的組。在每個(gè)或任何上 文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S: 100-135 的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包 含SEQSEQIDN0S: 136-156 的組。
[0013] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含非 人DH或其衍生物。
[0014] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含JH 序列或其衍生物。
[0015] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含非 人VH序列或其衍生物、非人DH序列或其衍生物和/或JH序列或其衍生物。
[0016] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含位 于VH序列和DH序列之間的含有2個(gè)至6個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的附加氨基酸序列。
[0017] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含非 牛序列。
[0018] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列是非抗體 或人類序列。
[0019] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列取代超長(zhǎng) ⑶R3的至少一部分。
[0020] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列是激素、 淋巴因子、白介素、趨化因子、細(xì)胞因子、毒素或其組合。
[0021] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列是細(xì)胞因 子。
[0022] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是粒細(xì)胞 集落刺激因子（G-SCF)。
[0023] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含是 接頭的附加序列。
[0024] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，接頭與非抗體序列 的C-端、N-端或兩個(gè)C-端和N-端連接。
[0025] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，接頭是（GGGGS) n(SEQIDN0:339)，其中n是0至5的整數(shù)。另外或此外，接頭是（GSG)n(SEQIDN0:342)、 GGGSGGGGS(SEQIDN0:337)或GGGGSGGGS(SEQIDN0:338)。
[0026] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 X1X2X3X4X5Xn基序，其中X1是蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)或纈氨酸（V)， 其中&是絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V)或天 冬酰胺（N)，其中&是纈氨酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4是組氨 酸（H)、蘇氨酸（T)、精氨酸（R)、酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，其中&是谷氨酰 胺（Q)，且其中η是27-54。
[0027] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，X1X2X3X4X5基序是 TTVHQ(SEQIDΝ0:159)或TSVHQ(SEQIDΝ0:160)。
[0028] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3進(jìn)一步 包含（XaXb)z基序，其中Xa是任何氨基酸殘基，Xb是選自包含酪氨酸（Υ)、丙氨酸（F)、色氨 酸（W)和組氨酸（H)的組的芳香族氨基酸，且其中ζ是1-4。
[0029] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，（XaXb)z基序是 YXYXYX。
[0030] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 X1X2X3X4X5Xn(XaXb)z基序，其中X1是蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)或纈氨酸 (V) ，其中X2是絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V) 或天冬酰胺（N)，其中X3是纈氨酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4是 組氨酸（H)、蘇氨酸（T)、精氨酸（R)、酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，且其中X5是 谷氨酰胺（Q)，其中Xa是任何氨基酸殘基，Xb是選自包含酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)、色氨酸 (W) 和組氨酸⑶，其中η是27-54且其中ζ是1-4。
[0031] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，X1X2X3X4X5基序是 TTVHQ(SEQIDN0:159)或TSVHQ(SEQIDN0:160)，且其中（XaXb)z基序是YXYXYX。
[0032] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 TSVHQETKKYQ(SEQIDNO. 157)〇
[0033] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 VHQETKKYQ(SEQIDNO:158)〇
[0034] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CTTVHQXn(SEQIDNO. 223)。
[0035] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CTSVHQXn(SEQIDNO. 223)，其中η是 1-8。
[0036] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 TTVHQ(SEQIDNO. 159)〇
[0037] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 TSVHQ(SEQIDNO. 160)〇
[0038] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 VHQ。
[0039] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 KKQ。
[0040] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 VYQ。
[0041] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CX1X2X3X4Q(SEQIDN0:228)，其中X1是T、S、A或G，其中X2是T、S、A、P或I，其中X3是V或 K，且其中X4是H、K或Y。
[0042] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CXfVHQGEQID勵(lì):230)，其中父1是1\5、六或6，且其中父2是1\5、六、？或1。
[0043] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CXiX2VX3QGEQID勵(lì):232)，其中乂1是1\5^或6，其中乂2是1\5、六、？或1，且其中乂 3是!1、 Y或K。
[0044] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CXfKKQGEQID勵(lì):234)，其中父1是1\5、4或6，且其中父2是1\5、六、？或1。
[0045] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 YTYNYEW(SEQIDNO:235)。
[0046] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 YX1YX2GEQIDNO: 296)，其中X2是E或D。
[0047] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 YX1YX2Y(SEQIDNO:297) 〇
[0048] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 YEX，其中X是H、W、N、F、I或Y。
[0049] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 YDX，其中X是H、W、N、F、I或Y。
[0050] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 XYE，其中X是T、S、N或I。
[0051] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 XYD，其中X是T、S、N或I。
[0052] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 Y(E/D)X1XnWKSEQIDNOS:304-305)，其中X1是H、W、N、F、I或Y，且其中η是 1-4。
[0053] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗體或其結(jié)合片段 是嵌合的、人工程化的或人源化的。
[0054] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3是反芻 動(dòng)物CDR3。
[0055] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，反芻動(dòng)物是母牛。
[0056] 本公開(kāi)還提供了多核苷酸編碼的抗體或其結(jié)合片段的文庫(kù)，其中編碼的抗體或其 結(jié)合片段包含超長(zhǎng)⑶R3。
[0057] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3是35個(gè) 或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、40個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、45個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、50個(gè)或更多 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、55個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度或60個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
[0058] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3是35個(gè) 或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
[0059] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含3個(gè) 或更多個(gè)半胱氨酸殘基、4個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、5個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、6個(gè)或更 多個(gè)半胱氨酸殘基、7個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、8個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、9個(gè)或更多個(gè) 半胱氨酸殘基、10個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、11個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基或12個(gè)或更多個(gè) 半胱氨酸殘基。
[0060] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含3個(gè) 或更多個(gè)半胱氨酸殘基。
[0061] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗體或其結(jié)合片段 包含半胱氨酸基序。
[0062] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自 包含SEQIDN0S:45-156的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案 中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S:45-99的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施 方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDNOS:45-135的組。在每個(gè)或任何上 文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S: 100-135 的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包 含SEQIDN0S: 136-156 的組。
[0063] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含非 人DH或其衍生物。
[0064] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含JH 序列或其衍生物。
[0065] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含非 人VH序列或其衍生物、非人DH序列或其衍生物和/或JH序列或其衍生物。
[0066] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含位 于VH序列和DH序列之間的含有2個(gè)至6個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的附加氨基酸序列。
[0067] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含非 牛序列。
[0068] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列是非抗體 或人類序列。
[0069] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列取代超長(zhǎng) ⑶R3的至少一部分。
[0070] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非抗體序列是激 素、淋巴因子、白介素、趨化因子、細(xì)胞因子、毒素或其組合。
[0071] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列是細(xì)胞因 子。
[0072] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是粒細(xì)胞 集落刺激因子（G-CSF)。
[0073] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含是 接頭的附加序列。
[0074] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，接頭與非抗體序列 的C-端、N-端或兩個(gè)C-端和N-端連接。
[0075] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，接頭是（GGGGS) n(SEQIDN0:339)，其中η是0 至 5 的整數(shù)。另外，接頭是（GSG)n(SEQIDN0:342)、 GGGSGGGGS(SEQIDN0:337)或GGGGSGGGS(SEQIDN0:338)。
[0076] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 X1-X2-X3-X4-X5基序，其中X1是蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)或纈氨酸 (V)，其中X2是絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V) 或天冬酰胺（N)，其中&是纈氨酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4是 組氨酸（H)、蘇氨酸（T)、精氨酸（R)、酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，且其中&是 谷氨酰胺（Q)。
[0077] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，X1X2X3X4X5基序是 TTVHQ(SEQIDN0:159)或TSVHQ(SEQIDN0:160)。
[0078] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3進(jìn)一步 包含（XaXb)z基序，其中Xa是選自包含酪氨酸（Y)、丙氨酸（F)、色氨酸（W)和組氨酸⑶的 組的芳香族氨基酸，其中Xb是任何氨基酸殘基，且其中z是1-4。
[0079] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，（XaXb)z基序是 YXYXYX。
[0080] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含X1X 2X3X4X5Xn(X6X7)z基序，其中X1是蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸⑶或纈氨酸 (V)，其中X2是絲氨酸（S)、蘇氨酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V)或 天冬酰胺（N)，其中X3是纈氨酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4是組 氨酸（H)、蘇氨酸（T)、精氨酸（R)、酪氨酸（Y)、丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，且其中X5是谷氨 酰胺（Q)，其中Xa是任何氨基酸殘基，Xb是選自包含酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)、色氨酸（W) 和組氨酸（H)的組的芳香族氨基酸，其中η是27-54,且其中z是1-4。
[0081] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，X1X2X3X4X5基序是 TTVHQ(SEQIDN0:159)或TSVHQ(SEQIDN0:160)，且其中（Xa-Xb)z基序是YXYXYX。
[0082] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 TSVHQETKKYQ(SEQIDNO. 157)〇
[0083] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 VHQETKKYQ(SEQIDNO:158)〇
[0084] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CTTVHQXn(SEQIDNO. 223)〇
[0085] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CTSVHQXn(SEQIDNO. 224)，其中η是 1-8。
[0086] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 TTVHQ(SEQIDNO. 159)〇
[0087] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 TSVHQ(SEQIDNO. 160)〇
[0088] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 VHQ。
[0089] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 KKQ。
[0090] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 VYQ。
[0091] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CX1X2X3X4Q,其中X1是T、S、A或G，其中X2是T、S、A、P或I，其中X3是V或K，且其中X4是 H、K*Y。
[0092] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CX1X2VHQ,其中X1是T、S、A或G，且其中X2是T、S、A、P或I。
[0093] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CX1X2VX3Q,其中X1是T、S、A或G，其中X2是T、S、A、P或I，且其中X3是H、Y或K。
[0094] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 CX1X2KKQ,其中X1是T、S、A或G，且其中X2是T、S、A、P或I。
[0095] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 YTYNYEW(SEQIDNO:235)。
[0096] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 YX1YX2,其中X2是E或D。
[0097] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 YX1YX2Yo
[0098] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 YEX，其中X是H、W、N、F、I或Y。
[0099] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 YDX，其中X是H、W、N、F、I或Y。
[0100] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 XYE，其中X是T、S、N或I。
[0101] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 XYD，其中X是T、S、N或I。
[0102] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含 Y(EzD)X1XnW，其中Xl是H、W、N、F、I或Y，且其中η是 1-4。
[0103] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗體或其結(jié)合片段 是嵌合的、人工程化的或人源化的。
[0104] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含反 芻動(dòng)物CDR3。
[0105] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，反芻動(dòng)物是母牛。
[0106] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗體或其結(jié)合片段 以空間尋址的格式（spatiallyaddressedformat)存在。
[0107] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，多核苷酸編碼的抗 體或其結(jié)合片段以空間尋址的形式存在。
[0108] 本發(fā)明還提供了包含本文公開(kāi)的多核苷酸的任何文庫(kù)的載體文庫(kù)。
[0109] 本發(fā)明還提供了包含本文公開(kāi)的載體的任何文庫(kù)的宿主細(xì)胞文庫(kù)。
[0110] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是細(xì)菌、病毒 或噬菌體。
[0111] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗體或其結(jié)合片段 在細(xì)胞表面上展示。
[0112] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞分泌抗體或其 結(jié)合片段。
[0113] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗體或其結(jié)合片段 以空間尋址的形式出現(xiàn)。
[0114] 本發(fā)明還提供了包含超長(zhǎng)CDR3的抗體或其結(jié)合片段，其中超長(zhǎng)CDR3包含非牛序 列。
[0115] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3是35個(gè) 或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、40個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、45個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、50個(gè)或更多 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、55個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度或60個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
[0116] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3是35個(gè) 或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
[0117] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含3個(gè) 或更多個(gè)半胱氨酸殘基、4個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、5個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、6個(gè)或更 多個(gè)半胱氨酸殘基、7個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、8個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、9個(gè)或更多個(gè) 半胱氨酸殘基、10個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、11個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基或12個(gè)或更多個(gè) 半胱氨酸殘基。
[0118] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含3個(gè) 或更多個(gè)半胱氨酸殘基。
[0119] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗體或其結(jié)合片段 包含半胱氨酸基序。
[0120] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自 包含SEQIDN0S:45-156的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案 中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S:45-99的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施 方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDNOS:45-135的組。在每個(gè)或任何上 文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S: 100-135 的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包 含SEQIDN0S: 136-156 的組。
[0121] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列是非抗體 序列或人類序列。
[0122] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含非 人DH或其衍生物。
[0123] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含JH 序列或其衍生物。
[0124] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3包含：非 人VH序列或其衍生物、非人DH序列或其衍生物和/或JH序列或其衍生物。
[0125] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3包含位 于VH序列和DH序列之間的含有2個(gè)至6個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的附加氨基酸序列。
[0126] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列取代超長(zhǎng) ⑶R3的至少一部分。
[0127] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列是激素、 淋巴因子、白介素、趨化因子、細(xì)胞因子、毒素或其組合。
[0128] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，非牛序列是細(xì)胞因 子
[0129] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是粒細(xì)胞 集落刺激因子（G-CSF)。
[0130] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗體或其結(jié)合片段 是嵌合的、人工程化的或人源化的。
[0131] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3是反芻 動(dòng)物CDR3。
[0132] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，反芻動(dòng)物是母牛。
[0133] 本發(fā)明還提供了本文公開(kāi)的多核苷酸編碼的任何抗體或其結(jié)合片段。
[0134] 本發(fā)明還提供了包含本文公開(kāi)的任何多核苷酸編碼的抗體或其結(jié)合片段。
[0135] 本發(fā)明還提供了包含本文公開(kāi)的任何載體的宿主細(xì)胞。
[0136] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是細(xì)菌、病毒 或噬菌體。
[0137] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，抗體或其結(jié)合片段 在細(xì)胞表面上展示。
[0138] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞分泌抗體或其 結(jié)合片段。
[0139] 本發(fā)明還提供了制備包含超長(zhǎng)CDR3或其片段的抗體或其結(jié)合片段的方法，包括： 在其中表達(dá)多核苷酸序列且產(chǎn)生包含超長(zhǎng)CDR3或其片段的抗體或其結(jié)合片段的條件下， 培養(yǎng)包含編碼本文公開(kāi)的任何抗體的多核苷酸的宿主細(xì)胞。
[0140] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括 從宿主細(xì)胞培養(yǎng)回收包含超長(zhǎng)CDR3或其片段的抗體或其結(jié)合片段。
[0141] 本發(fā)明還提供了包含本文公開(kāi)的任何抗體或其結(jié)合片段的藥物組合物。
[0142] 本發(fā)明還提供了治療有需要的哺乳動(dòng)物的方法，其包括向哺乳動(dòng)物施用一定量的 本文公開(kāi)的任何抗體。
[0143] 在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人類。
[0144] 在一些實(shí)施方案中是組合抗體或其片段，其中組合抗體或其片段的至少一部分是 基于或來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分。
[0145] 在一些實(shí)施方案中是包含超長(zhǎng)⑶R3序列的至少一部分和非牛序列的至少一部分 的抗體或其片段。
[0146] 在一些實(shí)施方案中是抗體或其片段，其包含：(a)第一抗體序列，其中第一抗體序 列的至少一部分是來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分；(b)非抗體序列；以及（c)任選地，第二 抗體序列，其中第二抗體序列來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分。
[0147] 本文公開(kāi)的抗體可以是嵌合的、人工程化的或人源化的抗體。本文公開(kāi)的抗體可 以是牛工程化的、牛源化的或全牛的抗體。本文公開(kāi)的抗體可包含：Fab、scFv、dsFv、雙抗 體、（dsFv)2、微抗體、柔性微抗體或雙特異性片段。本文公開(kāi)的抗體可以是分離的抗體。
[0148] 本文公開(kāi)的抗體可進(jìn)一步包含非抗體序列。非抗體序列可源自哺乳動(dòng)物。該哺乳 動(dòng)物可以是牛、人或非牛哺乳動(dòng)物。本文公開(kāi)的抗體可包含源自非牛動(dòng)物的非抗體序列。非 牛動(dòng)物可以是蝎子。非牛動(dòng)物可以是蜥蜴。蜥蜴可以是希拉毒蜥。非抗體序列可以是來(lái)源 于生長(zhǎng)因子。生長(zhǎng)因子可以是GCSF、GMCSF或FGF21。GCSF可以是牛GCSF。另外，GCSF可以 是人GCSF。GMCSF和/或FGF21可以是來(lái)自人類。非抗體序列可以來(lái)源于細(xì)胞因子。細(xì)胞 因子可以是β-干擾素。非抗體序列可以來(lái)源于激素。激素可以是毒蜥外泌肽-4、GLP-1、 生長(zhǎng)激素抑制素或紅細(xì)胞生成素。GLP-I和/或紅細(xì)胞生成素可以是來(lái)自人類。非抗體序列 可以是來(lái)源于毒素。毒素可以是Mokal、VM-24、齊考諾肽、氯代毒素或原毒素2 (Pr0TxII)。 非抗體序列可以是IL8、齊考諾肽、生長(zhǎng)激素抑制素、氯代毒素、SDFl(α)或IL21。非抗體序 列可包含基于或來(lái)源于SEQIDN0S:317-332的氨基酸序列。非抗體序列可取代超長(zhǎng)⑶R3 的至少一部分。非抗體序列可插入至超長(zhǎng)⑶R3的序列。非抗體序列可與抗體的至少一部 分（例如，超長(zhǎng)CDR3、可變區(qū)、重鏈、輕鏈）偶聯(lián)。非抗體序列可與超長(zhǎng)CDR3、接頭、切割位 點(diǎn)、非牛序列、非超長(zhǎng)CDR3抗體序列或其組合連接。非抗體序列可與超長(zhǎng)CDR3、接頭、切割 位點(diǎn)、非牛序列、非超長(zhǎng)CDR3抗體序列或其組合毗鄰。
[0149] 本文公開(kāi)的抗體可包含基于或來(lái)源于母牛超長(zhǎng)CDR3的超長(zhǎng)CDR3。本文公開(kāi)的抗 體的至少一部分可源自哺乳動(dòng)物。本文公開(kāi)的抗體的第一抗體序列的至少一部分和/或第 二抗體序列的至少一部分可源自哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物可以是牛、人或非牛哺乳動(dòng)物。
[0150] 本文公開(kāi)的抗體可包含3個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。本文公開(kāi)的抗體可包含基于或 來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的序列。本文公開(kāi)的抗體可包含基于或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的1 個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。本文公開(kāi)的抗體可包含基于或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的1 個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
[0151] 本文公開(kāi)的抗體的至少一部分可基于或來(lái)源于本文公開(kāi)的超長(zhǎng)⑶R3的至少一部 分?；诨騺?lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的部分抗體可以是20個(gè)或更少個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。 基于或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的部分抗體可以是3個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
[0152] 本文公開(kāi)的抗體可包含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的1個(gè)或多個(gè)保守基序。來(lái) 源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的1個(gè)或多個(gè)保守基序可包含本文公開(kāi)的任何莖結(jié)構(gòu)域保守基 序。
[0153] 本文公開(kāi)的部分超長(zhǎng)⑶R3可包含超長(zhǎng)⑶R3的莖結(jié)構(gòu)域的至少一部分、超長(zhǎng)⑶R3 的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分或其組合。
[0154] 本文公開(kāi)的抗體可包含選自SEQIDN0S: 157-307和SEQIDN0S: 333-336中任一 個(gè)的序列。本文公開(kāi)的抗體可包含與選自SEQIDN0S: 157-224和235-295中任一個(gè)的序 列具有50%或更1?同源的序列。
[0155] 部分本文公開(kāi)的任何抗體可基于或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3序列的至少一部分。部分本 文公開(kāi)的抗體可基于或來(lái)源于兩個(gè)或更多個(gè)不同超長(zhǎng)CDR3序列的至少一部分。
[0156] 在本文公開(kāi)的任何實(shí)施方案中，部分超長(zhǎng)CDR3基于或來(lái)源于BLV1H12超長(zhǎng)CDR3 序列。部分超長(zhǎng)〇01?3可基于或來(lái)源于與^^1!112超長(zhǎng)001?3序列具有50(%或更高同源的序 列。部分超長(zhǎng)CDR3可基于或來(lái)源于BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl或F18超長(zhǎng) CDR3序列。部分超長(zhǎng)CDR3可基于或來(lái)源于與BLV5B8、BLVCV1、BLV?3、BLV8C11、BF1H1或 F18超長(zhǎng)⑶R3序列具有50%或更高同源的序列。
[0157] 本文公開(kāi)的抗體可包含含有3個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的第一和/或第二抗體序 列。來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的部分第一抗體序列和/或來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一 部分的部分第二抗體序列可以是20個(gè)或更少氨基酸長(zhǎng)度。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分 的部分第一抗體序列和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列可以是3個(gè)或 更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
[0158] 在本文公開(kāi)的任何實(shí)施方案中，第一和/或第二抗體序列包含基于或來(lái)源于超長(zhǎng) CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。第一和/或第二抗體序列可包含基于或來(lái)源于 超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè) 或多個(gè)氨基酸殘基可以是絲氨酸和/或半胱氨酸殘基。第一和/或第二抗體序列可包含來(lái) 源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或 多個(gè)保守基序可包含選自任一SEQIDN0S:157-307和SEQIDN0S:333-336的序列。
[0159] 在本文公開(kāi)的任何實(shí)施方案中，來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序列 的部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列的部分包含選自任一SEQID N0S:157-307和SEQIDN0S:333-336的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列的部分可包含與選自任 一SEQIDN0S: 157-224和235-295的序列具有50%或更高同源的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3 的至少一部分的部分第一抗體序列可包含選自任一SEQIDN0S: 157-234的序列。來(lái)源于 超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的部分第一抗體序列可包含與選自任一SEQIDNOS:157-224序列 具有50%或更商同源的序列。
[0160] 在本文公開(kāi)的任何實(shí)施方案中，來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的部分第二抗體 序列包含選自任一SEQIDNOS:235-307和SEQIDNOS:333-336的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3 的至少一部分的部分第二抗體序列可包含可與選自任一SEQIDN0S:235-295的序列具有 50%或更高同源的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的部分第一抗體序列和/或來(lái)源 于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列可來(lái)源于相同的超長(zhǎng)CDR3序列。
[0161] 在本文公開(kāi)的任何實(shí)施方案中，來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的部分第一抗體 序列和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列是由兩個(gè)或更多個(gè)不同超長(zhǎng) CDR3序列衍生。第一和/或第二抗體序列的部分超長(zhǎng)CDR3可基于或來(lái)源于BLV1H12超長(zhǎng) CDR3序列。第一和/或第二抗體序列的部分超長(zhǎng)CDR3可基于或來(lái)源于與BLV1H12超長(zhǎng) CDR3序列具有50%或更高同源的序列。第一和/或第二抗體序列的部分超長(zhǎng)CDR3可基于 或來(lái)源于BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl或F18 超長(zhǎng)CDR3 序列。第一和 / 或第 二抗體序列的部分超長(zhǎng)CDR3可基于或來(lái)源于與BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl 或F18超長(zhǎng)⑶R3序列具有50 %或更高同源的序列。
[0162] 在本文公開(kāi)的任何實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3基于或來(lái)源于具有35個(gè)或更多個(gè)氨基 酸長(zhǎng)度的超長(zhǎng)CDR3。超長(zhǎng)CDR3可基于或來(lái)源于包含3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基的超長(zhǎng)CDR3。
[0163] 在本文公開(kāi)的任何實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3基于或來(lái)源于可包含一個(gè)或多個(gè)半胱 氨酸基序的超長(zhǎng)⑶R3。一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸基序可選自包含SEQIDN0S:45-156的組。在 每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQID NOS: 45-99的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基 序選自包含SEQIDN0S:45-135的組。在每個(gè)或任何上文或下文提到的實(shí)施方案的一些實(shí) 施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S: 100-135的組。在每個(gè)或任何上文或下文提 到的實(shí)施方案的一些實(shí)施方案中，半胱氨酸基序選自包含SEQIDN0S: 136-156的組。
[0164] 本文公開(kāi)的抗體可基于或來(lái)源于具有35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的超長(zhǎng)CDR3。本 文公開(kāi)的抗體可基于或來(lái)源于包含3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基的超長(zhǎng)CDR3。本文公開(kāi)的抗 體可基于或來(lái)源于包含1個(gè)或多個(gè)半胱氨酸基序的超長(zhǎng)CDR3。
[0165] 本文公開(kāi)的抗體可包含具有35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的超長(zhǎng)CDR3。本文公開(kāi)的 抗體可包含含有3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基的超長(zhǎng)CDR3。本文公開(kāi)的抗體可包含含有一個(gè) 或多個(gè)半胱氨酸基序的超長(zhǎng)CDR3。
[0166] 在本文公開(kāi)的任何實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3可以是重鏈⑶R3。超長(zhǎng)⑶R3可包含來(lái) 源于或基于非人DH序列的氨基酸序列。超長(zhǎng)CDR3可包含來(lái)源于或基于JH序列的氨基酸 序列。超長(zhǎng)CDR3可包含來(lái)源于或基于非人VH序列的氨基酸序列、來(lái)源于或基于非人DH序 列的氨基酸序列和/或來(lái)源于或基于JH序列的氨基酸序列。超長(zhǎng)CDR3可包含位于在VH 衍生的氨基酸序列和DH衍生的氨基酸序列間的含有至少約2個(gè)氨基酸殘基的附加氨基酸 序列。
[0167] 本文公開(kāi)的任何抗體可包含基于或來(lái)源于選自SEQIDN0S: 24-44的序列的序列、 編碼基于或來(lái)源于SEQIDNOS:2-22的DNA的DNA序列的抗體或其結(jié)合片段。本文公開(kāi)的 任何抗體可包含基于或來(lái)源于選自SEQIDN0:23的序列的序列，該抗體或其結(jié)合片段由基 于或來(lái)源于SEQIDNO: 1的DNA的DNA序列編碼。
[0168] 本文公開(kāi)的任何超長(zhǎng)⑶R3可包含基于或來(lái)源于選自SEQIDN0S: 24-44的序列的 序列。本文公開(kāi)的任何抗體可包含基于或來(lái)源于選自SEQIDN0:23的序列的序列。本文 公開(kāi)的任何超長(zhǎng)CDR3可由來(lái)源于或基于SEQIDN0S: 2-22的DNA序列進(jìn)行編碼。本文公 開(kāi)的任何抗體可包含：由來(lái)源于或基于SEQIDNO: 1的DNA序列編碼的部分。
[0169] 本文公開(kāi)的任何抗體可包含一個(gè)或多個(gè)接頭。本文公開(kāi)的任何抗體可包含第一接 頭序列。本文公開(kāi)的任何抗體可包含第二接頭序列。第一和第二接頭序列可包含相同序列。 第一和第二接頭序列可包含不同的序列。第一和第二接頭序列可以是相同的長(zhǎng)度。第一和 /或第二接頭序列可以是不同的長(zhǎng)度。第一和/或第二接頭序列可以是3個(gè)或更多個(gè)氨基 酸長(zhǎng)度。
[0170] 第一和/或第二接頭序列可將非抗體序列連接到基于或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的部分 的部分。第一和/或第二連接序列可將非抗體序列連接到第一抗體徐列。第一和/或第二 接頭序列可將非抗體序列連接到第二抗體序列。第一和/或第二接頭序列可與非抗體序 列、超長(zhǎng)CDR3序列的部分、切割位點(diǎn)序列、非牛序列、抗體序列或其組合毗鄰。
[0171] 第一和/或第二接頭序列可包含一個(gè)或多個(gè)甘氨酸殘基。第一和/或第二接頭序 列可包含兩個(gè)或多個(gè)連續(xù)的甘氨酸殘基。第一和/或第二接頭序列可包含一個(gè)或多個(gè)絲氨 酸殘基。第一和/或第二接頭序列可包含一個(gè)或多個(gè)極性氨基酸殘基。一個(gè)或多個(gè)極性氨 基酸殘基可選自絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。極性氨基酸殘基可包含不帶電荷的 側(cè)鏈。第一和/或第二接頭序列可包含（GGGGS)J^^l」，其中η= 1至5 ;GGGSGGGGS序列； GGGGSGGGS序列；(GSG)n序列，其中η> 1 ;或其組合。
[0172] 本文公開(kāi)的任何抗體可包含一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)。該一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)可包含 蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。蛋白酶可以是Xa或凝血酶因子。一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)可包含IEGR的 氨基酸序列。
[0173] 一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)可在第一抗體序列和非抗體序列之間。一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn) 可在一個(gè)或多個(gè)接頭和非抗體序列之間。一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)可在第一抗體序列和一個(gè)或 多個(gè)接頭之間。一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)可在第二抗體序列和一個(gè)或多個(gè)接頭之間。一個(gè)或多 個(gè)切割位點(diǎn)可與非抗體序列、超長(zhǎng)CDR3序列的一部分、接頭序列、抗體序列或其組合毗鄰。
[0174] 在一些實(shí)施方案中是抗體或其結(jié)合片段的文庫(kù)，其中抗體或其片段可包含超長(zhǎng) CDR3。
[0175] 在一些實(shí)施方案中是抗體或其結(jié)合片段的文庫(kù)，其中抗體或其結(jié)合片段可包含本 文公開(kāi)的任何抗體。
[0176] 在一些實(shí)施方案中是包含多個(gè)多核苷酸的核酸文庫(kù)，所述多核苷酸含有編碼抗體 或其結(jié)合片段的序列，其中抗體或其結(jié)合片段可包含超長(zhǎng)CDR3。
[0177] 在一些實(shí)施方案中是包含多個(gè)多核苷酸的核酸文庫(kù)，所述多核苷酸含有編碼抗體 或其結(jié)合片段的序列，其中抗體或其結(jié)合片段可包含本文公開(kāi)的任何抗體。
[0178] 在一些實(shí)施方案中是包含編碼可變區(qū)的核酸序列的多核苷酸，其中可變區(qū)可包含 超長(zhǎng)CDR3。
[0179] 在一些實(shí)施方案中是包含多核苷酸的載體，其中該多核苷酸包含編碼可變區(qū)的核 酸序列，其中可變區(qū)可包含超長(zhǎng)⑶R3。
[0180] 在一些實(shí)施方案中是包含多核苷酸的宿主細(xì)胞，其中該多核苷酸包含編碼可變區(qū) 的核酸序列，其中該可變區(qū)可包含超長(zhǎng)CDR3。
[0181] 在一些實(shí)施方案中是包含核酸序列的多核苷酸，該核酸序列編碼本文公開(kāi)的任何 抗體的所述抗體或其結(jié)合片段。
[0182] 在一些實(shí)施方案中是包含多核苷酸的載體，其中該多核苷酸包含核酸序列，所述 核酸序列編碼本文公開(kāi)的任何抗體的所述抗體和其結(jié)合片段。
[0183] 在一些實(shí)施方案中是包含多核苷酸的宿主細(xì)胞，其中該多核苷酸包含核酸序列， 該核酸序列編碼本文公開(kāi)的任何抗體的所述抗體或其結(jié)合片段。
[0184] 在一些實(shí)施方案中是生產(chǎn)包含超長(zhǎng)CDR3或其片段的抗體或其結(jié)合片段的方法， 包括在其中可表達(dá)多核苷酸序列和可產(chǎn)生包含超長(zhǎng)⑶R3或其片段的抗體或其結(jié)合片段的 條件下，培養(yǎng)包含多核苷酸的宿主細(xì)胞，其中多核苷酸可包含核酸序列，該核酸序列編碼本 文公開(kāi)的任何抗體的所述抗體或其結(jié)合片段。該方法可包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)回收包含超長(zhǎng) CDR3或其片段的抗體或其結(jié)合片段。
[0185] 在一些實(shí)施方案中是包含本文公開(kāi)的任何抗體的藥物組合物。藥物組合物可包含 兩個(gè)或更多個(gè)抗體，其中兩個(gè)或更多個(gè)抗體中的至少一個(gè)包含超長(zhǎng)CDR3的至少一部分。
[0186] 在一些實(shí)施方案中是藥物組合物，該藥物組合物包含：(a)包含基于或來(lái)源于超 長(zhǎng)CDR3的至少一部分的序列的抗體或其片段；以及（b)藥學(xué)上可接受的斌形劑。
[0187] 在一些實(shí)施方案中是在有需要的受試者中治療疾病或狀況的方法，該方法包括： 向哺乳動(dòng)物施用治療有效劑量的本文公開(kāi)的任何抗體。在一些情況下，本文公開(kāi)的抗體 包含超長(zhǎng)⑶R3序列和非抗體序列。在一些情況下，非抗體序列選自包含Mokal、Vm24、人 GLP-1、毒蜥外泌肽-4、β-干擾素、人ΕΡ0、人FGF21、人GM-CSF、人干擾素-β、牛GCSF、人 GCSF、beIL8、齊考諾肽、生長(zhǎng)激素抑制素、氯代毒素、SDFl(a)、IL21以及其衍生物或變體。 非抗體序列可包含基于或來(lái)源于任何SEQIDN0S:317-332的氨基酸序列。
[0188] 疾病或狀況可選自包含自身免疫性疾病、異種免疫疾病或狀況、炎性疾病、病原性 感染、血栓栓塞性障礙、呼吸道疾病或狀況、代謝性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)障礙、骨疾 病、癌癥、血液疾病、肥胖癥、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、貧血或疼痛的組。
[0189] 疾病或狀況可受益于離子通道的調(diào)制。離子通道可選自包含鉀離子通道、鈉離子 通道或酸敏感離子通道的組。離子通道可選自包含KvL3離子通道、NavL7離子通道和酸 敏感離子通道（ASIC)的組。
[0190] 疾病或狀況可受益于受體的調(diào)制。受體可選自包含 FGF21R、CSFR、GMCSFR、IL8R、IL21R和GCSFR的組。
[0191] 疾病或狀況可以是乳腺炎。
[0192] 受試者可以是哺乳動(dòng)物。該哺乳動(dòng)物可以是?；蛉?。
[0193] 在一些實(shí)施方案中是基于或來(lái)源于本文公開(kāi)的抗體的晶體。該晶體可具有PZPj1 空間群。在一些情況下，晶體具有介于約40埃至80埃、介于45埃至約75埃或介于約50 埃至約75埃的晶胞參數(shù)"a"，介于約40埃至140埃、介于約50埃至約130埃、介于約55埃 至約130埃的晶胞參數(shù)"b"以及介于100埃至約350埃、介于120埃至約340?；蚪橛诩s 125埃至約330埃的晶胞參數(shù)"c"。晶體可包含?？贵w或其部分。晶體可包含基于或來(lái)源 于牛抗體的Fab片段。晶體可以是分離的晶體。
[0194] 在一些實(shí)施方案中是包含含有SEQIDNO: 24和SEQIDNO: 23的?？贵wFab片段 的分離的晶體，其中晶體具有P2PA空間群以及a= 71. 4埃、b= 127. 6埃和c= 127.9 埃的晶胞參數(shù)。
[0195] 在一些實(shí)施方案中是包含含有SEQIDNO: 340和SEQIDNO: 341的?？贵wFab片 段的分離的晶體，其中晶體具有PZPj1空間群以及a= 54. 6埃、b= 53. 7埃和C= 330. 5 埃的晶胞參數(shù)。
[0196] 在利用包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的任何或全部上文或下文的發(fā)明或?qū)嵤┓桨钢?，?含超長(zhǎng)CDR3的任何抗體可以進(jìn)行使用，例如包括任何含有超長(zhǎng)CDR3的上述抗體。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0197] 本公開(kāi)的上述內(nèi)容以及下列詳細(xì)描述，結(jié)合附圖閱讀時(shí)將更好的被理解。用于說(shuō) 明本發(fā)明的目的，圖中所示的是目前優(yōu)選的實(shí)施方案。然而應(yīng)當(dāng)理解：本發(fā)明并不限于所示 的確切的安排、實(shí)施例和手段。
[0198] 圖IA到圖IC顯示了?？贵w中的新結(jié)構(gòu)域的鑒定。圖IA示出了⑶R3長(zhǎng)度在鼠、人 和牛所有組成成分間的比較。在牛重鏈中獨(dú)特地發(fā)現(xiàn)了 60個(gè)氨基酸以上的超長(zhǎng)亞群。圖 IB示出了來(lái)自文獻(xiàn)的鼠（mu)、人（hu)或牛序列的代表性CDRH3序列以及從我方深度測(cè)序 得到的6種牛序列（B-Sl至B-S4和B-Ll以及B-L2)。定義所有抗體可變區(qū)的⑶RH3邊界 的構(gòu)架3的保守半胱氨酸和構(gòu)架4的色氨酸用灰色著色以供參考。CDRH3的長(zhǎng)度在右側(cè)顯 示。鼠抗體包括D44. 1、抗-HEL抗體、93F3、醛縮酶以及針對(duì)人⑶3的治療性抗體0KT3。這些 抗體因在⑶R3H3中具有游離半胱氨酸而不同尋常。人抗體包括Yvo、冷沉球蛋白、CR6261、 抗A型流感血凝素以及具有最長(zhǎng)的人CDRΗ3之一的抗-HIV抗體PG9。?？贵w表現(xiàn)了文獻(xiàn) 中的超長(zhǎng)序列和進(jìn)行比較的短序列。BLV5B8和BLV1H12 (粗體顯示）用于我們的結(jié)構(gòu)測(cè)定 中。相對(duì)保守TTVHQ和CPDG基序是粗體。圖IC示出：與具有"標(biāo)準(zhǔn)"⑶RΗ3 (右）的93F3 相比較，F(xiàn)abBLVlH12(左）和BLV5B8(中）Fab的晶體結(jié)構(gòu)。一條超長(zhǎng)的、兩個(gè)β鏈的莖從 各個(gè)牛Vh免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中伸出并在異常的三個(gè)二硫鍵連接的隆突結(jié)構(gòu)域處終止。
[0199] 圖2Α到圖2C顯示了超長(zhǎng)牛抗體的結(jié)構(gòu)多樣性。圖2Α示出：兩個(gè)隆突結(jié)構(gòu)的比較 以二硫鍵的模式顯示差異。除隆突和其二硫鍵模式的二維表示外，示出了BLV1H12(左）和 BLV5H8(右）的隆突的近距離視圖。對(duì)二硫鍵進(jìn)行編號(hào)并圈出。在下方示出了球形區(qū)域的 序列，并且在具有DH2種系基因段的保守半胱氨酸下劃線。在各個(gè)序列的上方表明二硫鍵 模式。圖2B示出：BLV1H12和BLV5B8的可變區(qū)的疊加在除上部的莖和隆突外的可變區(qū)中 顯示結(jié)構(gòu)同源，并明顯趨異化。圖2C示出：BLV1H12(左）和BLV5B8(右）的表面和電荷密 度的表示在球形區(qū)域中顯示不同的形狀和電荷。
[0200] 圖3A到圖3C顯示了對(duì)超長(zhǎng)抗體的形成的遺傳基礎(chǔ)。圖3A示出超長(zhǎng)抗體中使用 的種系可變區(qū)VhBUL的鑒定。前導(dǎo)序列是淺灰色，編碼序列用上方的氨基酸翻譯來(lái)表明，內(nèi) 含子是斜體以及獨(dú)特的TTVHQ延伸是粗體，該獨(dú)特的TTVHQ延伸形成莖的上升鏈的一部分。 在重組信號(hào)序列七聚物和九聚物下劃線。圖3B示出=VhBUL區(qū)在21號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)。局部 牛細(xì)胞中期擴(kuò)展（左）和放大的第21號(hào)染色體（右上）通過(guò)具有318H2和14-74H6的BAC 克隆的雙色FISH示出VhBUL區(qū)在BTA21q24中的位置。對(duì)BTA21的國(guó)際命名在底部寫出。 圖3C示出：優(yōu)選地在超長(zhǎng)抗體中使用的描述為VhBUUDH2和VaIx的牛免疫球蛋白基因座 示意圖。V(D)J重組過(guò)程裝配基因段以形成功能性超長(zhǎng)重和輕鏈基因。（左下）將V-D-J 區(qū)定位到BLVlH12Fab結(jié)構(gòu)。VhBUL因編碼⑶RHl和⑶RH2殘基以及TTVHQ基序而獨(dú)特， 所述⑶RHl和⑶RH2殘基與莖相互作用，所述TTVHQ基序引發(fā)上升β-鏈。同樣，VaIx輕 鏈編碼與莖相互作用的⑶RLl和⑶RL2殘基。箭頭表明潛在的連接多樣性區(qū)域。相對(duì)較 長(zhǎng)的V-D插入物用紫色表明。還不清楚這些序列是否由N-添加、基因轉(zhuǎn)變或另一種機(jī)理產(chǎn) 生。（右下）詳細(xì)描述了⑶RHl、H2、L1和L2與莖的相互作用以及上升鏈的YxYxY基序的 位置。
[0201] 圖4A到圖4C描述了牛超長(zhǎng)VhCDRH3的深度序列多樣性。圖4A示出在IgM和IgG 的牛超長(zhǎng)CDRH3中的半胱氨酸數(shù)目分布。圖4B示出超長(zhǎng)CDR3的長(zhǎng)度分布。要注意的是： 在免疫應(yīng)答期間選定的任何給定長(zhǎng)度的克隆序列可偏離比例。圖4C示出超長(zhǎng)牛VhCDRH3 的代表性序列。示出了VhBUL區(qū)的末端部分以及在V-D連接、DH2和Jh (頂部）的連接多樣 性。示出BLVH12和BLV5B8的序列以進(jìn)行比較，隨后示出20個(gè)超長(zhǎng)⑶RH3序列（底部） 在由DH2保守的半胱氨酸下劃線。定義所有抗體可變區(qū)的CDRH3邊界的保守半胱氨酸和 色氨酸用灰色突出顯示以供參考。在CPDG基序下標(biāo)灰色劃線，編碼YxYxY基序的上升鏈區(qū) 標(biāo)灰色下劃線。
[0202] 圖5A到圖5C示出：半胱氨酸的突變有助于超長(zhǎng)⑶RH3多樣性。圖5A示出：超長(zhǎng) CDRH3深層序列的共有區(qū)與DH2比對(duì)。三次深度測(cè)序運(yùn)行的共有序列（來(lái)自兩頭牛）進(jìn)行 確定并與彼此以及DH2比對(duì)。除一些插入物/缺失區(qū)外，共有區(qū)比對(duì)完好。因此，無(wú)論一個(gè) Dh基因還是高度相關(guān)的基因都產(chǎn)生超長(zhǎng)CDRH3抗體的序列多樣性。圖5B示出：DH2基因區(qū) 域分析顯示可很容易地突變成半胱氨酸的殘基，包括SH熱點(diǎn)。上邊是核苷酸序列且下邊是 翻譯的氨基酸序列。由用于SH和/或基因轉(zhuǎn)變的AID識(shí)別的RGYW熱點(diǎn)框出。在（B)中位 置 3、15、19、21、25、27、31、33、39、43、45、49、51、57、60、64、73、75、79、81、84、88、90、93、97、 102、106、112、117、121、123、127、129、133、139和145處的核苷酸可在一個(gè)突變中變異成編 碼半胱氨酸的密碼子。圖5C示出親和成熟組，顯示向半胱氨酸的突變或由半胱氨酸的的突 變。鑒定幾組克隆相關(guān)的序列并針對(duì)體細(xì)胞高頻突變對(duì)其進(jìn)行分析。三個(gè)組作為實(shí)例（左 側(cè)標(biāo)有1至3)示出。來(lái)自半胱氨酸的序列差異用灰色突出顯示。右側(cè)示出各個(gè)序列在簇 中的代表次數(shù)。
[0203] 圖6A到圖6D示出：具有超長(zhǎng)⑶RH3的?？贵w結(jié)合抗原。圖6A示出用于鑒定抗 原-特異性、超長(zhǎng)CDRH3抗體的免疫實(shí)驗(yàn)方案。分離，通過(guò)RTPCR對(duì)重鏈可變區(qū)mRNA進(jìn) 行分離、擴(kuò)增并與變體輕鏈配對(duì)以產(chǎn)生在HEK239細(xì)胞中生成的IgG的小文庫(kù)。圖6示出： 132個(gè)超長(zhǎng)⑶RH3抗體針對(duì)BVDV的ELISA(左圖）和在滴定試驗(yàn)中B8、B9和H12 "點(diǎn)擊" 的結(jié)合活性（右圖）。圖6C示出：B8、H9和H12相較于BLV1H12和DH2種系區(qū)域的序列。 右側(cè)是鑒定的CDRH3的長(zhǎng)度。在由DH2保守的半胱氨酸下劃線。圖6D示出細(xì)胞中H12結(jié) 合NS2-3。標(biāo)貼flag的BVDVNS2-3蛋白質(zhì)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至HEK293A細(xì)胞并用作為陽(yáng)性對(duì)照 的抗-Flag(左）、H12抗體（中間）和B8 (右）進(jìn)行著色。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)在底 部示出。
[0204] 圖7A到圖7B描述了在新的minifold中的超長(zhǎng)CDRH3多樣化的模式。圖7A示 出：左側(cè)圖示具有4個(gè)半胱氨酸的DH2隆突的示意圖，右側(cè)圖示由SH和基因轉(zhuǎn)變生成多個(gè) 新半胱氨酸模式和新環(huán)。圖7B示出產(chǎn)生抗體多樣性的機(jī)理。在人類和小鼠（左）中，通過(guò) V⑶J組合和Vh-'配對(duì)的組合多樣性產(chǎn)生了多個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)，該結(jié)合位點(diǎn)在抗原暴露 后由體細(xì)胞高頻突變進(jìn)一步優(yōu)化。在牛（右）中，嚴(yán)格限制結(jié)合多樣性；突變成或始自半胱 氨酸的體細(xì)胞突變可重塑"球形"區(qū)域，在超長(zhǎng)⑶RH3中產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)多樣性。這些抗體 可通過(guò)SH進(jìn)一步優(yōu)化并可與獨(dú)特的靶標(biāo)（諸如孔或通道）結(jié)合。
[0205] 圖8A到圖8J描述的方案示出：將牛G-CSF與牛BLV1H12抗體的重鏈區(qū)的隆突結(jié)構(gòu) 域連接進(jìn)而設(shè)計(jì)本文公開(kāi)的免疫球蛋白構(gòu)建體。圖8A示出牛BLV1H12抗體的重鏈區(qū)和輕鏈 區(qū)的帶狀圖。盒裝區(qū)突出顯示包含莖和隆突結(jié)構(gòu)域的超長(zhǎng)CDR3的延伸區(qū)。圖8B示出：生 長(zhǎng)因子（例如，牛G-CSF)的帶狀圖，該生長(zhǎng)因子插入或替換牛BLV1H12抗體的重鏈區(qū)的隆 突結(jié)構(gòu)域的一部分。圖8C示出：毒素（例如，Mokal、VM-24)的帶狀圖，該毒素插入或替換 牛BLV1H12抗體的重鏈區(qū)的隆突結(jié)構(gòu)域的一部分。圖8D示出：受體配體（例如，GLP-1、毒 蜥外泌肽-4)的帶狀圖，該受體配體插入或替換牛BLV1H12抗體的重鏈區(qū)的隆突結(jié)構(gòu)域的 一部分。圖8E示出：激素（例如，紅細(xì)胞生成素）的帶狀圖，該激素插入或替換牛BLV1H12 抗體的重鏈區(qū)的隆突結(jié)構(gòu)域的一部分。圖8F示出：動(dòng)畫描述了牛BLV1H12抗體的重鏈區(qū)和 輕鏈區(qū)。圖8G示出：生長(zhǎng)因子（例如，牛G-CSF)的動(dòng)畫，該生長(zhǎng)因子插入或替換牛BLV1H12 抗體的重鏈區(qū)的隆突結(jié)構(gòu)域的一部分。圖8H示出：毒素（例如，Mokal、VM-24)的動(dòng)畫，該毒 素插入或替換牛BLV1H12抗體的重鏈區(qū)的隆突結(jié)構(gòu)域的一部分。圖81示出：受體配體（例 如，GLP-1、毒蜥外泌肽-4)的動(dòng)畫，該受體配體插入或替換牛BLV1H12抗體的重鏈區(qū)的隆突 結(jié)構(gòu)域的一部分。左側(cè)展板示出：受體配體的兩個(gè)末端，該受體配體插入或替換牛BLV1H12 抗體的重鏈區(qū)的隆突結(jié)構(gòu)域的一部分。右側(cè)展板示出：受體配體的N-端，該受體配體在用 蛋白酶治療后從隆突結(jié)構(gòu)域釋放。圖8J示出激素（例如，紅細(xì)胞生成素）的動(dòng)畫，該激素 插入或替換牛BLV1H12抗體的重鏈區(qū)的隆突結(jié)構(gòu)域的一部分。生長(zhǎng)因子、毒素、受體配體和 激素可通過(guò)GGGGS(Ab-肽LI)或GGGSGGGGS和GGGGSGGGS(Ab-肽L2)序列的多肽接頭進(jìn)行 連接。未通過(guò)接頭進(jìn)行連接的另一構(gòu)建體（Ab-肽LO)未在本動(dòng)畫中示出。
[0206] 圖9A到圖9E呈現(xiàn)對(duì)于Ab-bGCSF融合蛋白的說(shuō)明性鼠NFS-60細(xì)胞增殖活性。圖 9A到9B分別描述了牛G-CSF和人G-CSF的增殖活性。圖9C描述了無(wú)G-CSF時(shí)，對(duì)于牛 BLV1H12抗體的增值活性的缺乏。圖9D描述了無(wú)接頭（Ab-bGCSFL0)時(shí)，插入至或替換隆 突結(jié)構(gòu)域一部分的牛G-CSF的增殖活性。圖9E描述了通過(guò)GGGGS(Ab-bGCSFLI)序列的多 肽接頭時(shí)，插入至或替換隆突結(jié)構(gòu)域一部分的牛G-CSF的增殖活性。
[0207] 圖IOA至圖IOE呈現(xiàn)了Ab-GCSF融合蛋白的人粒細(xì)胞先祖細(xì)胞增殖活性。圖IOA 至圖IOB分別描述了牛G-CSF和人G-CSF的增殖活性。圖IOC描述了無(wú)G-CSF時(shí)，對(duì)于牛 BLV1H12抗體（Ab)缺乏增殖活性。圖IOD描述了無(wú)接頭（Ab-bGCSFL0)時(shí)，插入至或替換 隆突結(jié)構(gòu)域一部分的牛G-CSF的增殖活性。圖IOE描述了通過(guò)GGGGS(Ab-bGCSFLI)序列 的多肽接頭的所述連接，插入至或替換隆突結(jié)構(gòu)域一部分的牛G-CSF的增殖活性。
[0208] 圖IlA至圖IlB描述了小鼠的Ab-bGCSF融合蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)。
[0209] 圖12A至圖12B提供了在小鼠嗜中性粒細(xì)胞中Ab-bGCSF融合蛋白的增殖活性，該 小鼠嗜中性粒細(xì)胞是血著色的并在注射后第10天計(jì)數(shù)。
[0210] 圖13A至圖13C顯示在畢赤酵母中Ab-bGCSF融合蛋白的表達(dá)和純化。圖13A示 出：對(duì)于本文提供的免疫球蛋白構(gòu)建體的畢赤酵母表達(dá)載體的示意圖。圖13B提供了免疫 球蛋白構(gòu)建體Ab-bGCSFLO和Ab-bGCSFLl的表達(dá)誘導(dǎo)后的Western印跡。圖13C提供了 在0-70μg每IOOmL培養(yǎng)液的產(chǎn)率下，在畢赤酵母中表達(dá)的純化的Ab-bGCSFLO和Ab-bGCSF LI的SDS-PAGE凝膠。
[0211] 圖14A至圖14C示出了在游離式HEK293細(xì)胞中用于表達(dá)免疫球蛋白構(gòu)建體的載 體。圖14A提供了在游離式HEK293細(xì)胞中用于表達(dá)的Ab-bGCSFLO重鏈的載體。圖14B 提供了在游離式HEK293細(xì)胞中用于表達(dá)的Ab-bGCSFLl重鏈的載體。圖14C提供了在游 離式HEK293細(xì)胞中用于表達(dá)的Ab-bGCSF輕鏈的載體。
[0212] 圖15A示出純化的抗體融合的SDS-PAGE凝膠。圖15A示出來(lái)自HEK293細(xì)胞的純 化的Ab-bGCSFLO和Ab-bGCSFLl蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠。圖15B提供了包含連接至原 毒素2兩末端的GGGGS接頭的免疫球蛋白構(gòu)建體Ab-原毒素2的SDSPAGE。
[0213] 圖16A至圖16B提供了Ab-MokalLO(無(wú)接頭）和Ab-MokalLl(有接頭）免疫球蛋 白構(gòu)建體的SDSPAGE和活性。圖16A提供了Ab-MokalLO和Ab-MokalLl免疫球蛋白融合 蛋白的SDSPAGE。圖16B提供了關(guān)于T細(xì)胞活化的BLVlH12-Mokal融合蛋白抑制活性。
[0214] 圖17提供了在人外周血單核細(xì)胞（PBMC)中BLVlH12_Mokal融合蛋白抑制活性。
[0215]圖 18A至圖 18C提供了Ab-VM24L1(GGGGS接頭）和Ab-VM24L2(GGGSGGGGS和 GGGGSGGGS接頭）免疫球蛋白構(gòu)建體的SDSPAGE和活性。圖18A提供了Ab-VM24L1 和Ab-VM24L2免疫球蛋白融合蛋白的SDSPAGE。圖18B提供了關(guān)于T細(xì)胞活性的BLV1H12-VM24L1融合蛋白抑制活性。圖18C提供了關(guān)于T細(xì)胞活性的BLV1H12-VM24L2融 合蛋白抑制活性。
[0216] 圖19提供了Ab-GLP-I和Ab-毒蜥外泌肽-4免疫球蛋白構(gòu)建體的SDSPAGE。
[0217] 圖20提供了在HEK293細(xì)胞表達(dá)GLP-I受體中Ab-GLP-I和Ab-毒蜥外泌肽-4 的活性。
[0218] 圖21提供了TFl細(xì)胞中的Ab-hEPO融合蛋白的增殖活性。
[0219] 圖22A至圖22C描述了超長(zhǎng)⑶R3序列。（頂部）從VHBUL、DH2和JH種系的翻譯。 文獻(xiàn)報(bào)道的5個(gè)全長(zhǎng)超長(zhǎng)CDRH3包含4個(gè)到8個(gè)半胱氨酸并彼此不高度同源；然而當(dāng)這些 ⑶RH3的第一半胱氨酸在比對(duì)前"固定"時(shí)，可見(jiàn)用0#保守的一些半胱氨酸殘基。七個(gè)序 列（BLV1H12、BLVOT3、BLV8C11和BF4E9)中的4個(gè)序列如DH2 -樣在相同的位置包含4個(gè) 半胱氨酸，但也具有附加半胱氨酸。81^588與0112種系一樣具有兩個(gè)半胱氨酸。與一些半 胱氨酸保留具有的限定的同源提示DH2的突變可產(chǎn)生這些序列。第一組包含鑒定的最長(zhǎng)的 CDRH3并顯示克隆相關(guān)性。*表明重復(fù)出現(xiàn)167次的序列，暗示其是根據(jù)功能嚴(yán)格選定的。 許多8個(gè)半胱氨酸序列根據(jù)功能選定因它們重復(fù)多次，在寬括號(hào)中表明。其他各種長(zhǎng)度的 代表性序列在最后一組中表明。在定義CDRH3邊界的構(gòu)架半胱氨酸和色氨酸殘基下劃雙 下劃線。在表2A-C中列出的BLV1H12至UL-77序列（最左側(cè)列）分割成4部分進(jìn)行描述 以鑒定有某些種系序列衍生的氨基酸殘基片段。從左向右移動(dòng)，第一部分是由％種系衍生 并在整個(gè)公開(kāi)內(nèi)容中用X1X2X3X4X5基序代表。第二部分是在整個(gè)公開(kāi)內(nèi)容中設(shè)計(jì)為父"殘基 的一系列間隔區(qū)的氨基酸殘基。第三部分是由種系DH2區(qū)衍生的一系列氨基酸殘基以及第 四部分是由種系JhI區(qū)衍生的一系列氨基酸殘基。 具體實(shí)施方案
[0220] 本文公開(kāi)了抗體及其片段。通常，抗體及其片段包含超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分。超 長(zhǎng)CDR3的一部分可來(lái)源于或基于超長(zhǎng)CDR3序列。超長(zhǎng)CDR3的一部分可基于或來(lái)源于超長(zhǎng) ⑶R3序列的莖結(jié)構(gòu)域。另外或此外，超長(zhǎng)⑶R3的一部分可基于或來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3序列的 隆突結(jié)構(gòu)域?？贵w或其片段可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)治療性多肽。治療性多肽可插入至超 長(zhǎng)CDR3的一部分。治療性多肽可替代超長(zhǎng)CDR3的一部分的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨 基酸殘基。治療性多肽可替代超長(zhǎng)CDR3的一部分的核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。另 夕卜，治療性多肽可與超長(zhǎng)CDR3的一部分偶聯(lián)或連接。本文公開(kāi)的抗體及其片段進(jìn)一步包含 切割位點(diǎn)。本文公開(kāi)的抗體及其片段的一部分可基于或來(lái)源于產(chǎn)生超長(zhǎng)CDR3的不同動(dòng)物 或種類的抗體序列。例如超長(zhǎng)CDR3可基于或來(lái)源于?？贵w序列，且抗體序列的附加或其他 部分可基于或來(lái)源于非?？贵w序列。本文描述了抗體或其片段的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。 軺長(zhǎng)CDR3蛋白質(zhì)
[0221] 本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3序列或其部分的抗體或免疫球蛋白構(gòu)建體。
[0222] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)⑶R3的抗體。超長(zhǎng)⑶R3可以是35個(gè) 或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度（例如，40個(gè)或更多個(gè)、45個(gè)或更多個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)、55個(gè)或或更多 個(gè)、60個(gè)或更多個(gè)）。超長(zhǎng)⑶R3可包含⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分、⑶R3的莖結(jié)構(gòu) 域的至少一部分或其組合。⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的一部分可包含來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的隆突結(jié) 構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一部分可包含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu) 域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。此類抗體可包含在超長(zhǎng)CDR3內(nèi)的至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸 殘基（例如，4個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)）?？贵w可包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨 酸基序?？贵w可包含在超長(zhǎng)CDR3內(nèi)的非抗體序列。另外或此外，抗體包含非牛序列。非牛 序列可與超長(zhǎng)⑶R3序列連接?？贵w可進(jìn)一步包含接頭。接頭可包含（GGGGS)n氨基酸序列， 其中η= 1至5。另外，接頭包含（GSG)n、GGGSGGGGS或GGGGSGGGS氨基酸序列?？贵w可包 含在超長(zhǎng)CDR3內(nèi)的非牛序列?？贵w可進(jìn)一步包含抗體序列，其中該抗體序列不包含超長(zhǎng) CDR3序列?？贵w可進(jìn)一步包含抗體序列，其中抗體肽序列與超長(zhǎng)CDR3肽序列的氨基酸序列 同一性是約40 %或更少（例如，約35 %或更少、約30 %或更少、約25 %或更少、約20 %或 更少、約15%或更少、10%或更少、約5%或更少、約3%或更少、約1 %或更少）。抗體可包 含細(xì)胞毒性藥劑或治療性多肽。細(xì)胞毒性藥劑或治療性多肽可與超長(zhǎng)CDR3偶聯(lián)?？贵w可 與靶標(biāo)結(jié)合。靶標(biāo)可以是蛋白質(zhì)靶標(biāo)。該蛋白質(zhì)靶標(biāo)可以是橫跨膜蛋白質(zhì)靶標(biāo)?？贵w可以 包含BLV1H12和/或BLVCVl抗體的至少一部分。另外或此外，抗體包含BLV?3、BLV8C11、 BF1H1、BLV5B8和/或F18抗體的至少一部分?？贵w可包含人抗體的至少一部分?？贵w可 以是嵌合的、重組的、工程化的、合成的、人源化的、全人或人工程化的抗體。抗體可包含來(lái) 自兩個(gè)或更多個(gè)不同抗體的抗體序列。所述兩個(gè)或更多個(gè)不同抗體可以來(lái)自相同的種類。 例如，該種類可以是牛種類、人種類或鼠種類。所述兩種或更多種不同抗體可以來(lái)自相同類 型的動(dòng)物。例如，該兩種或更多種不同抗體可以來(lái)自人。另外，兩種或更多種不同抗體是來(lái) 自不同物種。例如，該兩種或更多種不同抗體是來(lái)自人物種和牛物種。在另一個(gè)實(shí)例中，該 兩種或更多種不同抗體可以是來(lái)自牛物種和非牛物種。在另一個(gè)實(shí)例中，該兩種或更多種 不同抗體是來(lái)自人物種和非人物種。
[0223] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3的抗體，其中CDR3是35個(gè)或 更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度并基于或來(lái)源于非人類序列。超長(zhǎng)CDR3序列可來(lái)源于自然產(chǎn)生超長(zhǎng) ⑶R3抗體的任何物種包括反芻動(dòng)物諸如牛（奶牛）?？贵w可包含BLV1H12和/或BLVCVl 抗體的至少一部分。另外或此外，抗體包含BLV?3、BLV8C11、BF1H1、BLV5B8和/或F18抗 體的至少一部分。另外，超長(zhǎng)⑶R3序列可由駱駝或鯊魚⑶R3序列衍生。
[0224] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3序列的抗體，其中CDR3包含非 抗體序列。非抗體序列可來(lái)源于任何蛋白質(zhì)家族包括但不限于：趨化因子、生長(zhǎng)因子、肽、細(xì) 胞因子、細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、血清蛋白質(zhì)、毒素、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、凝血因子、分泌的蛋白質(zhì) 等。非抗體序列可由治療性多肽衍生。非抗體序列可以是人或非人源。非抗體序列可包含 合成序列。非抗體序列可包含非抗體蛋白質(zhì)諸如肽或結(jié)構(gòu)域的一部分。超長(zhǎng)CDR3的非抗 體序列可包含來(lái)自其自然序列的突變，包括氨基酸改變（例如，取代）、插入或缺失?？芍苽?在非抗體序列間的接點(diǎn)處的工程附加氨基酸以促進(jìn)或增強(qiáng)抗體內(nèi)非抗體序列的適當(dāng)折疊。 ⑶R3可以是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。超長(zhǎng)⑶R3可包含⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部 分XDR3的莖結(jié)構(gòu)域的至少一部分或其組合。⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的一部分可包含來(lái)源于超 長(zhǎng)⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。⑶R3的莖結(jié)構(gòu)域的一部分可包含來(lái)源于超 長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。另外或此外，抗體包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱 氨酸殘基?？贵w可包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸基序?？贵w可包含BLV1H12和/或BLVCVl抗 體的至少一部分。另外或此外，抗體包含BLV?3、BLV8C11、BF1H1、BLV5B8和/或F18抗體 的至少一部分。
[0225] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3和非牛序列的抗體。超長(zhǎng)CDR3 可源自反芻動(dòng)物。反芻動(dòng)物可以是牛。非牛序列可以來(lái)源于或基于非牛哺乳動(dòng)物序列。例 如，非牛序列可來(lái)源于或基于人、小鼠、大鼠、綿羊、狗和/或山羊序列。超長(zhǎng)CDR3序列可包 含非牛序列。此外，非牛序列與超長(zhǎng)CDR3序列連接。非牛序列可來(lái)源于或基于抗體序列的 至少一部分?？贵w序列可編碼可變區(qū)、恒定區(qū)或其組合。CDR3可以是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸 長(zhǎng)度。超長(zhǎng)⑶R3可包含⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分XDR3的莖結(jié)構(gòu)域的至少一部分 或其組合。CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的一部分可包含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多 個(gè)保守基序。CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一部分可包含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè) 保守基序。另外或此外，抗體包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基?？贵w可包含一個(gè)或多 個(gè)半胱氨酸基序。
[0226] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3的抗體，其中CDR3是35個(gè)或 更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基，例如包括：4個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或 更多個(gè)和8個(gè)或更多個(gè)。
[0227] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3的抗體，其中CDR3是35個(gè)或 更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基并且其中超長(zhǎng)CDR3是多特異性 抗體的組分。多特異性抗體可以是雙特異性或包含更高的化合價(jià)。
[0228] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3的抗體，其中CDR3是35個(gè)或 更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基，其中超長(zhǎng)CDR3是免疫連接物。
[0229] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3的抗體，其中CDR3是35個(gè)或 更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基，其中包含超長(zhǎng)CDR3的抗體與橫 跨膜蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合。此類橫跨膜靶標(biāo)可包括但不限于：GPCR、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體和細(xì)胞表 面受體。
[0230] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3的抗體，其中包含超長(zhǎng)CDR3的 抗體與橫跨膜蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合。此類橫跨膜靶標(biāo)可包括但不限于：GPCR、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體 和細(xì)胞表面受體。⑶R3可以是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。超長(zhǎng)⑶R3可包含⑶R3的隆突 結(jié)構(gòu)域的至少一部分XDR3的莖結(jié)構(gòu)域的至少一部分或其組合。⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的至少 一部分可包含來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。⑶R3的莖結(jié)構(gòu)域的 一部分可包含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。此外或另外，抗體包含 至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基?？贵w可包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸基序。
[0231] 本文提供了免疫球蛋白構(gòu)建體，其包含含有互補(bǔ)決定區(qū)3(⑶R3H)的至少一部分 的哺乳動(dòng)物免疫球蛋白重鏈以及治療性多肽，其中該治療性多肽插入至或替換⑶R3H的至 少一部分。免疫球蛋白構(gòu)建體可包含一個(gè)或多個(gè)接頭。一個(gè)或多個(gè)接頭可將治療性多肽與 重鏈連接。在一些實(shí)施方案中，接頭包含（GGGGS)n氨基酸序列，其中n= 1至5。此外或另 夕卜，接頭包含（GSG)n(SEQIDN0:342)、GGGSGGGGS(SEQIDN0:337)或GGGGSGGGS氨基酸 序列。在一些實(shí)施方案中提供了本文所述的免疫球蛋白構(gòu)建體，其中治療性多肽選自激素、 淋巴因子、白介素、趨化因子、細(xì)胞因子或其組合。在某些實(shí)施方案中，治療性多肽是細(xì)胞因 子。在一些實(shí)施方案中，治療性多肽是集落刺激因子多肽。在某些實(shí)施方案中，集落刺激因 子是巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、粒細(xì)胞集 落刺激因子（G-CSF)或其片段或變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，集落刺激因子是哺乳動(dòng)物G-CSF或其衍生物或變體。在其他實(shí)例中，治療性多肽是Mokal、Vm24、人GLP-1、毒蜥外泌肽-4、 人EP0、人FGF21、人GMCSF或人干擾素-β。本文提供了免疫球蛋白構(gòu)建體，其包含在互補(bǔ) 決定區(qū)3 (CDR3H)中含有隆突結(jié)構(gòu)域的哺乳動(dòng)物免疫球蛋白重鏈或其片段以及與CDR3H的 所述保守結(jié)構(gòu)域連接的治療性多肽，其中所述哺乳動(dòng)物免疫球蛋白是牛免疫球蛋白。在一 些實(shí)施方案中，牛免疫球蛋白是BLV1H12抗體。在本文所述的免疫球蛋白構(gòu)建體的一些實(shí) 施方案中，隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分被治療性多肽替換。CDR3H的隆突結(jié)構(gòu)域可包含來(lái)源于 超長(zhǎng)CDR3H的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。免疫球蛋白構(gòu)建體可進(jìn)一步包含CDR3H 的莖結(jié)構(gòu)域的至少一部分。⑶R3H的莖結(jié)構(gòu)域的一部分可包含來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3H的莖結(jié)構(gòu) 域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。
[0232] 本文進(jìn)一步提供了抗體或其片段，其包含互補(bǔ)決定區(qū)3 (⑶R3H)的莖結(jié)構(gòu)域或其 片段以及治療性多肽。在一些情況下，互補(bǔ)決定區(qū)3 (CDR3H)是由牛超長(zhǎng)CDR3H衍生。治療 性多肽可以是本文公開(kāi)的任何治療性多肽。例如，治療性多肽是Mokal、Vm24、GLP-1、毒蜥 外泌肽-4、人EP0、人FGF21、人GMCSF或人干擾素-β。治療性多肽可與莖結(jié)構(gòu)域連接。在 一些情況下，抗體或其片段進(jìn)一步包含接頭。接頭可將治療性多肽與莖結(jié)構(gòu)域連接。此外 或另外，抗體或其片段進(jìn)一步包含⑶R3H的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在一些情況下，接頭 將治療性多肽與隆突結(jié)構(gòu)域連接。在一些情況下，隆突結(jié)構(gòu)域與莖結(jié)構(gòu)域連接。⑶R3的隆 突結(jié)構(gòu)域的一部分可包含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。CDR3的 莖結(jié)構(gòu)域可包含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。
[0233] 在一些情況下，本文提供了抗體或其片段?？贵w或其片段可包含至少一個(gè)免疫球 蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段以及治療性多肽或其衍生物或變體。治療性多肽或其衍生物或變體 可與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接。在一些情況下，治療性多肽是Mokal、Vm24、GLP-1、毒蜥外泌 肽-4、人EP0、人FGF21、人GMCSF、人干擾素-β或其衍生物或變體。在一些實(shí)施方案中，免 疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白Α、免疫球蛋白D、免疫球蛋白Ε、免疫球蛋白G或免疫球蛋白 Μ。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可以是免疫球蛋白重鏈區(qū)或其片段。在一些情況下，免疫球蛋白結(jié)構(gòu) 域是來(lái)自哺乳動(dòng)物抗體。此外，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是來(lái)自嵌合的抗體。在一些情況下，免疫 球蛋白結(jié)構(gòu)域是來(lái)自工程抗體或組合抗體。在其他情況下，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是來(lái)自人源 化的，人工程化的或全人抗體。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物抗體是牛抗體。在其他情況下， 哺乳動(dòng)物抗體是人抗體。在其他情況下，哺乳動(dòng)物抗體是鼠抗體。在一些情況下，免疫球蛋 白結(jié)構(gòu)域是包含互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3H)的隆突結(jié)構(gòu)域的重鏈區(qū)或其片段。治療性多肽可以 與隆突結(jié)構(gòu)域連接。此外或另外，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是包含互補(bǔ)決定區(qū)3 (⑶R3H)的莖結(jié)構(gòu) 域的重鏈區(qū)或其片段。在一些情況下，治療性多肽與莖結(jié)構(gòu)域連接。在一些情況下，抗體或 其片段進(jìn)一步包含接頭。接頭可將治療性多肽與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段連接。CDR3的 隆突結(jié)構(gòu)域可包含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。CDR3的莖結(jié)構(gòu) 域可包含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。
[0234] 本文提供了免疫球蛋白構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段以及 與所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的G-CSF多肽或其衍生物或變體。在一些實(shí)施方案中，免疫 球蛋白結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E、免疫球蛋白G或免疫球蛋白M。 在一些實(shí)施方案中，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白重鏈區(qū)或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中， 免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是來(lái)自哺乳動(dòng)物或嵌合的抗體。在其他情況下，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是來(lái) 自人源化的，人工程或全人抗體。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物抗體是?？贵w。在一些情 況下，哺乳動(dòng)物抗體是人抗體。在其他情況下，哺乳動(dòng)物抗體是鼠抗體。在一個(gè)實(shí)施方案 中，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是包含互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3H)的隆突結(jié)構(gòu)域的重鏈區(qū)或其片段。在一 個(gè)實(shí)施方案中，G-CSF多肽可以與隆突結(jié)構(gòu)域連接。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是包含互補(bǔ)決定區(qū) 3(⑶R3H)的莖結(jié)構(gòu)域的重鏈區(qū)或其片段。G-CSF多肽可以與莖結(jié)構(gòu)域連接。⑶R3的隆突結(jié) 構(gòu)域可包含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。CDR3的莖結(jié)構(gòu)域可包 含來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。
[0235]在某些實(shí)施方案中提供了免疫球蛋白構(gòu)建體，其包含至少一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域 或其片段以及與所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域連接的G-CSF多肽或其衍生物或變體，其中所述 G-CSF多肽是牛G-CSF多肽或其衍生物或變體。在一些實(shí)施方案中，本文提供了包含本文提 供的免疫球蛋白構(gòu)建體以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中提供了 在有需要的哺乳動(dòng)物中預(yù)防或治療疾病的方法，該方法包含向所述哺乳動(dòng)物施用藥物組合 物。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域可以是包含互補(bǔ)決定區(qū)3 (CDR3H)的隆突結(jié)構(gòu)域的重鏈區(qū)或其片段。 G-CSF多肽可以與隆突結(jié)構(gòu)域連接。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是包含互補(bǔ)決定區(qū)3 (⑶R3H)的莖 結(jié)構(gòu)域的重鏈區(qū)或其片段。G-CSF多肽可以與莖結(jié)構(gòu)域連接。⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域可包含來(lái) 源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。CDR3的莖結(jié)構(gòu)域可包含來(lái)源于超長(zhǎng) CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。
[0236]在一些實(shí)施方案中是抗體或其片段，其包含：(a)第一抗體序列，其中第一抗體序 列的至少一部分是由超長(zhǎng)⑶R3的至少一分部衍生；以及（b)非抗體序列。抗體或其片段 可進(jìn)一步包含第二抗體序列，其中第二抗體序列的至少一部分是由超長(zhǎng)⑶R3的至少一部 分衍生。衍生第一抗體序列和/或第二抗體序列的超長(zhǎng)CDR3是來(lái)自反芻動(dòng)物。反芻動(dòng)物 可以是牛。第一抗體序列的至少一部分和/或第二抗體序列的至少一部分可來(lái)源于哺乳動(dòng) 物。哺乳動(dòng)物可以是牛。此外，哺乳動(dòng)物是非牛哺乳動(dòng)物，諸如人。第一和/或第二抗體序 列可以是3個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。氨基酸可以是連續(xù)氨基酸。此外，氨基酸是非連續(xù)氨 基酸。第一和/或第二抗體序列可包含含有3個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的牛抗體序列。?？?體可以是BLVH12、BLV5B8、BLVCVl、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl或F18 抗體。第一和 / 或第二 抗體序列可包含含有3個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的人抗體序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一 部分的第一抗體序列的部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一分部的第二抗體序列的部分 可以是20個(gè)或更少個(gè)氨基端長(zhǎng)度。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分 和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一分部的第二抗體序列的部分可以是3個(gè)或更多個(gè)氨基端 長(zhǎng)度。第一和/或第二抗體序列可包含1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)、4個(gè)或更 多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)、7個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)、9個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多 個(gè)、15個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)、30個(gè)或更多個(gè)或40個(gè)或更多個(gè)來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突 結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。一個(gè)或多個(gè)來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基可以是絲 氨酸和/或半胱氨酸殘基。第一和/或第二抗體序列可包含1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)、3個(gè) 或更多個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)、7個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)、9個(gè)或 更多個(gè)或10個(gè)或更多個(gè)來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。第一和/或第二抗體 序列可包含1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)或5個(gè)或更多個(gè)來(lái)源于 超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的保守基序。一個(gè)或多個(gè)來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的保守基序可 包含選自任一SEQIDNOS:157-307和SEQIDNOS:333-336的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的 至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一分部的第二抗體序列 的部分可以包含選自任一SEQIDNOS:157-307和SEQIDNOS:333-336的序列。來(lái)源于超 長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一分部的第二 抗體序列的部分可以包含與選自任一SEQIDN0S: 157-224和235-295的序列具有50%或 更高同源的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分可包含選自任一 SEQIDN0S: 157-234的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分可包 含與選自任一SEQIDN0S: 157-224的序列具有50%或更高同源的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3 的至少一部分的第一抗體序列的部分可包含與選自任一SEQIDN0S:225-227的序列具有 50%或更高同源的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的第二抗體序列的一部分可包含 選自任一SEQIDNOS:235-307和SEQIDNOS:333-336的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一 部分的第二抗體序列的一部分可包含與選自任一SEQIDN0S:235-295的序列可具有50% 或更高同源的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來(lái)源于 超長(zhǎng)CDR3的至少一分部的第二抗體序列的部分可來(lái)源于相同的超長(zhǎng)CDR3序列。來(lái)源于超 長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一分部的第二 抗體序列的部分可來(lái)源于兩個(gè)或更多個(gè)不同的超長(zhǎng)CDR3序列。第一和/或第二抗體序列 的超長(zhǎng)CDR3的一部分可基于或來(lái)源于BLV1H12超長(zhǎng)CDR3序列。第一和/或第二抗體序列 的超長(zhǎng)CDR3的部分可基于或來(lái)源于BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl或F18超長(zhǎng) ⑶R3序列?？贵w可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)接頭序列。
[0237] 本發(fā)明還提供了包含重鏈多肽的抗體，其中重鏈多肽包含超長(zhǎng)CDR3序列的至少 一部分。重鏈多肽可包含基于或來(lái)源于SEQIDN0S:24-44的多肽序列中的任一個(gè)的多肽 序列。重鏈多肽可包含由基于或來(lái)源于SEQIDN0S:2-22的任何一個(gè)DNA序列編碼的多肽 序列。本文還提供了包含重鏈多肽的抗體，其中重鏈多肽包含超長(zhǎng)CDR3序列且重鏈多肽序 列基本上類似于由SEQIDNOS:24-44的任何一個(gè)提供的這些多肽序列。重鏈多肽序列可 以認(rèn)為基本上類似于由SEQIDNOS:24-44的任何一個(gè)提供的多肽序列，其中重鏈多肽序列 與由SEQIDN0S:24-44的任何一個(gè)提供的核苷酸序列具有60%、70%、80%、90%、95%、 99%或更高核酸同一性?？贵w可進(jìn)一步包含輕鏈多肽。輕鏈多肽可包含基于或來(lái)源于SEQ IDN0:23的多肽序列的多肽序列。輕鏈多肽可包含由基于或來(lái)源于SEQIDNO: 1的DNA序 列的DNA序列編碼的多肽序列。本文還提供了抗體，其進(jìn)一步包含輕鏈多肽，其中輕鏈多肽 包含超長(zhǎng)⑶R3序列且輕鏈多肽序列基本上類似于由SEQIDN0:23提供的這些多肽序列。 輕鏈多肽序列可認(rèn)為基本上類似于由SEQIDNO: 1提供的多肽序列，其中輕鏈多肽序列與 由SEQIDN0:1的任何一個(gè)提供的核苷酸序列具有60%、70%、80%、90%、95%、99%或更 高核酸同一'I"生?？贵w在動(dòng)物中可具有治療活性?？贵w在受試者的感染的疾病中具有治療活 性?？贵w可包含單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、組合抗體、工程抗體或合成抗體?？贵w 可包含哺乳動(dòng)物抗體。抗體可包含牛抗體。抗體可包含G-CSF多肽或其衍生物或變體。抗 體可包含哺乳動(dòng)物G-CSF多肽或其衍生物或變體。抗體可包含牛G-CSF或其衍生物或變體。 在一些實(shí)施方案中，治療劑的藥物組合物包含本文所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。在 某些實(shí)施方案中，抗體被用于以治療有效量的本文所述的抗體或藥物組合治療有需要的受 試者的方法中。在一些實(shí)施方案中，核酸分子或其補(bǔ)體編碼本文所述的治療性免疫球蛋白。 遺傳序列
[0238] 本發(fā)明提供了編碼包含超長(zhǎng)CDR3序列或其部分的抗體的遺傳序列（例如，基因、 核酸、多核苷酸）。本發(fā)明提供了編碼包含隆突結(jié)構(gòu)域和/或超長(zhǎng)CDR3序列的隆突結(jié)構(gòu)域 的抗體的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷酸）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編 碼本文所述的抗體或免疫球蛋白構(gòu)建體的遺傳序列。
[0239] 本發(fā)明還提供了編碼包含超長(zhǎng)⑶R3序列或其部分的遺傳序列（例如，基因、核酸、 多核苷酸）。本發(fā)明還提供了編碼隆突結(jié)構(gòu)域和/或超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的遺傳序列 (例如，基因、核酸、多核苷酸）。
[0240] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的遺傳序列。超長(zhǎng) CDR3可以是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度（例如，40個(gè)或更多個(gè)、45個(gè)或更多個(gè)、50個(gè)或更多 個(gè)、55個(gè)或更多個(gè)、60個(gè)或更多個(gè)）。超長(zhǎng)⑶R3可包含⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分、 ⑶R3的莖結(jié)構(gòu)域的至少一部分或其組合。此類抗體可在超長(zhǎng)⑶R3內(nèi)包含至少3個(gè)或更多 個(gè)半胱氨酸殘基（例如，4個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)）?？贵w可包含一個(gè)或 多個(gè)半胱氨酸基序?？贵w可在超長(zhǎng)CDR3內(nèi)包含非抗體序列。此外或另外，抗體包含非牛序 列?？贵w可進(jìn)一步包含抗體序列。抗體可包含細(xì)胞毒性劑或治療性多肽。細(xì)胞毒性劑或治 療性多肽可以與超長(zhǎng)CDR3偶聯(lián)?？贵w可與靶標(biāo)結(jié)合。靶標(biāo)可以是蛋白靶標(biāo)，諸如橫跨膜蛋 白靶標(biāo)。
[0241] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且來(lái)源于或基于非人序列。編碼超長(zhǎng)CDR3的遺傳序列 可以由自然產(chǎn)生超長(zhǎng)CDR3抗體的任何物種包括反芻動(dòng)物諸如牛（奶牛）衍生。此外，超長(zhǎng) ⑶R3序列可以來(lái)源于駱駝或鯊魚⑶R3序列。
[0242] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3包含非抗體蛋白序列。編碼非抗體蛋白序列的遺傳序列可以來(lái)源于任何蛋白質(zhì)家族包 括但不限于：趨化因子、生長(zhǎng)因子、肽、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、血清蛋白質(zhì)、毒素、細(xì)胞 外基質(zhì)蛋白質(zhì)、凝血因子、分泌的蛋白質(zhì)等。非抗體序列可以來(lái)源于治療性多肽。非抗體蛋 白質(zhì)序列可以是人或非人源。非抗體序列可包含合成序列。非抗體序列可包含非抗體蛋白 質(zhì)（諸如肽或結(jié)構(gòu)域）的一部分。超長(zhǎng)CDR3的非抗體蛋白序列可包含來(lái)自其自然序列的 突變，包括氨基酸改變（例如，取代）、插入或缺失?？芍苽湓诜强贵w序列間的接點(diǎn)處的工程 附加氨基酸以促進(jìn)或增強(qiáng)抗體內(nèi)非抗體序列的適當(dāng)折疊。CDR3可以是35個(gè)或更多個(gè)氨基 酸長(zhǎng)度。超長(zhǎng)⑶R3可包含⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分XDR3的莖結(jié)構(gòu)域的至少一部 分或其組合。此外或另外，抗體包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基?？贵w可包含一個(gè)或 多個(gè)半胱氨酸基序。
[0243] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含超長(zhǎng)CDR3和非牛序列的抗體的遺 傳序列。超長(zhǎng)CDR3可以源自反芻動(dòng)物。反芻動(dòng)物可以是牛。非牛序列可來(lái)源于或基于非牛 哺乳動(dòng)物序列。例如，非牛序列可來(lái)源于或基于人、小鼠、大鼠、綿羊、狗和或山羊序列。非 牛序列可以在超長(zhǎng)⑶R3內(nèi)。此外，非牛序列連接或附加至在超長(zhǎng)⑶R3序列。非牛序列可 來(lái)源于或基于抗體序列的至少一部分。抗體序列可編碼可變區(qū)、恒定區(qū)或其組合。CDR3可 以是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。超長(zhǎng)⑶R3可包含⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分XDR3 的莖結(jié)構(gòu)域的至少一部分或其組合。此外或另外，抗體包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘 基?？贵w可包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸基序。
[0244] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基，包括例如4個(gè)或 更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)和8個(gè)或更多個(gè)。
[0245] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度并包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基且其中超長(zhǎng)CDR3 是多特異性抗體的組分。多特異性抗體可以是雙特異性或包含較高的化合價(jià)。
[0246] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度并包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基，其中超長(zhǎng)CDR3 是免疫連接物的組分。
[0247] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的遺傳序列，其中 CDR3是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度并包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基且其中包含超長(zhǎng) CDR3的抗體與橫跨膜蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合。此類橫跨膜靶標(biāo)可包括但不限于：GPCR、離子通道、 轉(zhuǎn)運(yùn)體和細(xì)胞表面受體。
[0248] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的遺傳序列，其中 包含超長(zhǎng)CDR3的抗體與橫跨膜蛋白質(zhì)靶標(biāo)結(jié)合。此類橫跨膜靶標(biāo)可包括但不限于：GPCR、 離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體和細(xì)胞表面受體。CDR3可以是35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。超長(zhǎng)CDR3可 包含⑶R3的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分、⑶R3的莖結(jié)構(gòu)域的至少一部分或其組合。此外或 另外，抗體包含至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基?？贵w可包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸基序。
[0249] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼抗體或其片段的遺傳序列，其包含：(a) 第一抗體序列，其中第一抗體序列的至少一部分來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分；以及（b) 非抗體序列?？贵w或其片段可進(jìn)一步包含第二抗體序列，其中第二抗體序列的至少一部分 來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分。衍生第一抗體序列和/或第二抗體序列的超長(zhǎng)CDR3是來(lái) 自反芻動(dòng)物。反芻動(dòng)物可以是牛。第一抗體序列的至少一部分和/或第二抗體序列的至少 一部分可來(lái)源于哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物可以是牛。此外，哺乳動(dòng)物是非牛哺乳動(dòng)物，諸如人。 第一和/或第二抗體序列可以是3個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。氨基酸可以是連續(xù)氨基酸。此 夕卜，氨基酸是非連續(xù)氨基酸。第一和/或第二抗體序列可包含含有3個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度 的?？贵w序列。?？贵w可以是BLVH12、BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl或F18 抗 體。第一和/或第二抗體序列可包含含有3個(gè)或更多個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、6個(gè) 或更多個(gè)、7個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)、9個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、15個(gè)或更多個(gè)、20個(gè) 或更多個(gè)、30個(gè)或更多個(gè)、40個(gè)或更多個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)、60個(gè)或更多個(gè)或70個(gè)或更多個(gè) 氨基酸長(zhǎng)度的人抗體序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或 來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一分部的第二抗體序列的部分可以是20個(gè)或更少個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。 來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一 分部的第二抗體序列的部分可以是3個(gè)或更多個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多 個(gè)、7個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)、9個(gè)或更多個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)、15個(gè)或更多個(gè)或20個(gè)或更 多個(gè)酸長(zhǎng)度。第一和/或第二抗體序列可包含1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)、4 個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)、7個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)、9個(gè)或更多個(gè)、10個(gè) 或更多個(gè)、15個(gè)或更多個(gè)、20個(gè)或更多個(gè)、30個(gè)或更多個(gè)或40個(gè)或更多個(gè)來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。一個(gè)或多個(gè)來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基可 以是絲氨酸和/或半胱氨酸殘基。第一和/或第二抗體序列可包含1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或更多 個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)、7個(gè)或更多個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)、 9個(gè)或更多個(gè)或10個(gè)或更多個(gè)來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。第一和/或第 二看題序列可包含1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)、3個(gè)或更多個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)或5個(gè)或更多個(gè) 來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的保守基序。一個(gè)或多個(gè)來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的保守 基序可包含選自SEQ ID N0S:157-307和SEQ ID NOS:333-336中任一個(gè)的序列。來(lái)源于超 長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一分部的第二 抗體序列的部分可包含選自SEQ ID N0S:157-307和SEQ ID NOS:333-336的任一的序列。 來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一分 部的第二抗體序列的部分可包含與選自SEQ ID NOS: 157-224和235-295的任一的序列具 有50%或更高同源的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分可包含 選自SEQ ID NOS:157-234的任一的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的第一抗體序列 的部分可包含與選自SEQ ID N0S:157-224的任一的序列具有50%或更高同源的序列。來(lái) 源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的第一抗體序列的部分可包含與選自SEQ ID N0S:225-227的 任一的序列具有50%或更高同源的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一分部的第二抗體序列 的部分可包含選自SEQ ID N0S:235-307和SEQ ID N0S:333-336的任一的序列。來(lái)源于超 長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的第二抗體序列的部分可包含與選自SEQ ID N0S:235-295的任一的 序列具有50%或更高同源的序列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分 和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一分部的第二抗體序列的部分可來(lái)源于相同的超長(zhǎng)CDR3序 列。來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序列的部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少 一分部的第二抗體序列的部分可來(lái)源于兩個(gè)或更多個(gè)不同的超長(zhǎng)CDR3序列。第一和/或 第二抗體序列的超長(zhǎng)CDR3的一部分可基于或來(lái)源于BLV1H12超長(zhǎng)CDR3序列。第一和/或 第二抗體序列的超長(zhǎng)CDR3的部分可基于或來(lái)源于BLV5B8、BLVCV1、BLV?3、BLV8C11、BF1H1 或F18超長(zhǎng)⑶R3序列?？贵w可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)接頭序列。
[0250] 本發(fā)明還提供了分離的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷酸、寡核苷酸），諸如 由包含超長(zhǎng)⑶R3序列（包括例如，由SEQIDN0S:2-22的任一提供的⑶R3序列）的抗體的 遺傳序列。本發(fā)明還提供了基本上與由SEQIDN0S:2-22的任一提供的這些CDR3序列相類 似的超長(zhǎng)⑶R3核酸序列。⑶R3序列可認(rèn)為基本上類似于由SEQIDNOS:2-22的任一提供的 CDR3序列，其中CDR3序列與由SEQIDN0S:2-22的任一提供的CDR3序列具有80%、85%、 90%、95%、99%或更高核酸序列同一性，或者在嚴(yán)格雜交的條件下與SEQIDN0S:2-22的 任一序列雜交。
[0251] 本發(fā)明還提供了分離的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷酸、寡核苷酸），諸如 編碼包含重鏈多肽的抗體的遺傳序列，其中重鏈多肽包含超長(zhǎng)CDR3序列的至少一部分。重 鏈多肽可包含SEQIDN0S:24-44的任一的多肽序列。重鏈多肽可包含由SEQIDN0S:2-22 的任一的DNA編碼的多肽序列。本發(fā)明還提供了分離的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核 苷酸、寡核苷酸），諸如編碼包含重鏈多肽的抗體的遺傳序列，其中重鏈多肽包含超長(zhǎng)⑶R3 序列且重鏈多肽序列基本上類似于由SEQIDN0S:24-44的任一提供的這些多肽序列。重 鏈多肽序列可認(rèn)為基本上類似于由SEQIDNOS:24-44的任一提供的多肽序列，其中重鏈多 肽序列與由SEQIDNOS: 24-44的任一提供的核苷酸序列具有60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、 99%或更高核酸同一性，或者在嚴(yán)格雜交條件下與SEQIDN0S:24-44的任一序列雜交。分 離的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷酸、寡核苷酸）諸如編碼抗體的遺傳序列可進(jìn)一 步包含輕鏈多肽。輕鏈多肽可包含SEQIDN0:23的多肽序列。輕鏈多肽可包含由SEQID N0:1的DNA編碼的多肽序列。本發(fā)明還提供了分離的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷 酸、寡核苷酸）諸如編碼抗體的遺傳序列，該分離的遺傳序列進(jìn)一步包含輕鏈多肽，其中輕 鏈多肽包含超長(zhǎng)CDR3序列且輕鏈多肽序列基本上類似于由SEQIDNO: 23提供的這些多肽 序列。輕鏈多肽序列可認(rèn)為基本上類似于由SEQIDNO: 1提供的多肽序列，其中輕鏈多肽 序列與由SEQIDN0:1的任一提供的核苷酸序列具有60%、70%、80%、90%、95%、99%或 更高核酸同一性，或者在嚴(yán)格雜交條件下與SEQIDNOS:1雜交。 文庫(kù)和陣列
[0252]本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)⑶R3序列的抗體的組群、文庫(kù)和陣列。在一些實(shí)施方案 中，組群、文庫(kù)和陣列的成員可顯示序列多樣性。
[0253]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3序列的抗體的文庫(kù)或陣列，其中 文庫(kù)或陣列的至少兩個(gè)成員在超長(zhǎng)CDR3序列的至少一個(gè)半胱氨酸的位置上不同。結(jié)構(gòu)多 樣性可通過(guò)在超長(zhǎng)CDR3序列中不同數(shù)量的半胱氨酸（例如，至少3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘 基諸如4個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)和8個(gè)或更多個(gè)）和/或通過(guò)不同二硫鍵形成和此后的 不同環(huán)結(jié)構(gòu)得到加強(qiáng)。
[0254]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明了包含超長(zhǎng)CDR3序列的抗體的文庫(kù)或陣列，其中文 庫(kù)或陣列的至少兩個(gè)成員在位于超長(zhǎng)⑶R3的半胱氨酸間的至少一個(gè)氨基酸上不同。就這 點(diǎn)而言，文庫(kù)或陣列的成員可包括在CDR3的相同位置上的半胱氨酸，導(dǎo)致類似的整體結(jié)構(gòu) 折疊，但具有通過(guò)不同氨基酸側(cè)鏈引起的細(xì)微差異。此類文庫(kù)或陣列可有助于親和力成熟。
[0255]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3序列的抗體的文庫(kù)或陣列，其 中超長(zhǎng)CDR3序列的至少兩個(gè)在長(zhǎng)度上不同（例如，35個(gè)或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)度諸如40個(gè)或 更多個(gè)、45個(gè)或更多個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)、55個(gè)或更多個(gè)和60個(gè)或更多個(gè)）。氨基酸和半胱 氨酸含量可以或不可以在文庫(kù)或陣列間進(jìn)行改變。超長(zhǎng)CDR3序列的不同長(zhǎng)度可提供獨(dú)特 的結(jié)合位點(diǎn)，包括例如，由于空間差異、由于改變的長(zhǎng)度。
[0256]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的文庫(kù)或陣列，其中文 庫(kù)的至少另個(gè)成員在構(gòu)建包含超長(zhǎng)CDR3的抗體中使用的人構(gòu)架上不同。
[0257]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3序列的抗體的文庫(kù)或陣列，其 中文庫(kù)或陣列的至少兩個(gè)成員在具有包含超長(zhǎng)CDR3的一部分的非抗體蛋白質(zhì)序列上不 同。此類文庫(kù)或陣列可包括多種非抗體蛋白質(zhì)序列，包括趨化因子、生長(zhǎng)因子、肽、細(xì)胞因 子、細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、血清蛋白質(zhì)、毒素、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、凝血因子、分泌的蛋白質(zhì)、病毒 或細(xì)菌蛋白質(zhì)等。非抗體蛋白質(zhì)序列可以是人或非人源的并可包含非抗體蛋白質(zhì)的一部分 諸如肽或結(jié)構(gòu)域。超長(zhǎng)CDR3的非抗體蛋白質(zhì)序列可包含來(lái)自其自然序列的突變，包括氨基 酸改變（例如，取代）、插入或缺失。可制備在非抗體序列間的接點(diǎn)處的工程附加氨基酸以 促進(jìn)或增強(qiáng)抗體內(nèi)非抗體序列的適當(dāng)折疊。
[0258]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3序列的抗體的文庫(kù)或陣列，其 中文庫(kù)或陣列的至少兩個(gè)成員在具有非牛序列上不同。非牛序列可來(lái)源于或基于非牛哺乳 動(dòng)物序列。例如，非牛序列可來(lái)源于或基于人、小鼠、大鼠、綿羊、狗和/或山羊序列。非牛 序列可以在超長(zhǎng)⑶R3內(nèi)。此外，非牛序列連接或附加至超長(zhǎng)⑶R3序列。非牛序列可來(lái)源 于或基于抗體序列的至少一部分?？贵w序列可編碼可變區(qū)、恒定區(qū)或其組合。
[0259] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3序列的抗體的文庫(kù)或陣列，其 中文庫(kù)或陣列的至少兩個(gè)成員在具有與超長(zhǎng)CDR3偶聯(lián)的細(xì)胞毒性劑或治療性多肽上不 同。細(xì)胞毒性劑或治療性多肽可包括但不限于：化療劑、藥物、生長(zhǎng)抑制劑、毒素（例如， 細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物源的酶促活性毒素或其片段）或放射性同位素（例如，放射性連接 物）。細(xì)胞毒性劑或治療性多肽可由非抗體序列進(jìn)行編碼。
[0260] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含超長(zhǎng)CDR3序列的抗體的文庫(kù)或陣列，其 中文庫(kù)或陣列的至少兩個(gè)成員在于靶標(biāo)結(jié)合上不同。靶標(biāo)可以是蛋白質(zhì)靶標(biāo)。該蛋白質(zhì)靶 標(biāo)可以是橫跨膜蛋白質(zhì)靶標(biāo)。此類橫跨膜靶標(biāo)可包括但不限于：GPCR、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體和 細(xì)胞表面受體。
[0261] 本發(fā)明的文庫(kù)或陣列可以是本領(lǐng)域中已知的多種形式。文庫(kù)或陣列可以是可尋址 的文庫(kù)或可尋址的陣列。文庫(kù)或陣列可以是展示的形式，例如抗體序列可以在噬菌體、核糖 體、mRNA、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞上展示。 細(xì)胞
[0262] 本發(fā)明提供了包含編碼抗體的遺傳序列的細(xì)胞，該抗體含有超長(zhǎng)CDR3序列或其 部分。本發(fā)明提供了包含編碼抗體的遺傳序列的細(xì)胞，該抗體含有超長(zhǎng)序列CDR3的隆突結(jié) 構(gòu)域的至少一部分或莖結(jié)構(gòu)域的至少一部。
[0263] 本發(fā)明提供了包含編碼超長(zhǎng)CDR3或其部分的遺傳序列（例如，基因、核酸、多核苷 酸）的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了包含編碼隆突結(jié)構(gòu)域或超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的遺傳序列 (例如，基因、核酸、多核苷酸）的細(xì)胞。
[0264] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了表達(dá)含有超長(zhǎng)CDR3的抗體的細(xì)胞。細(xì)胞可以是 原核的或真核的，且包含超長(zhǎng)CDR3的抗體可在細(xì)胞表面上表達(dá)或分泌到培養(yǎng)基中。當(dāng)抗體 在細(xì)胞表面展示時(shí)，該抗體優(yōu)選包含用于插入到質(zhì)粒膜上的基序，諸如在C-端上的跨膜結(jié) 構(gòu)域或脂質(zhì)附著位點(diǎn)。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，包含超長(zhǎng)CDR3的抗體可分泌到周質(zhì)中。細(xì)胞是真核 細(xì)胞時(shí)，其可被編碼包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的遺傳序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。此外，通過(guò)本領(lǐng)域中技術(shù) 人員已知的方法由編碼包含超長(zhǎng)CDR3的抗體的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)遺傳序列來(lái)創(chuàng)建穩(wěn)定細(xì)胞系或 穩(wěn)定池。細(xì)胞可通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（FACS)或通過(guò)選擇編碼藥物抗性的基因進(jìn)行選定。 有助于產(chǎn)生包含超長(zhǎng)CDR3序列的抗體的細(xì)胞包括原核細(xì)胞（如大腸桿菌）、真核細(xì)胞（如 釀酒酵母和畢赤酵母）、昆蟲細(xì)胞（例如，Sf9、Hi5)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO)細(xì)胞、猴細(xì)胞（如 C0S-1)或人細(xì)胞（如HEK-293、HeLa、SP-1)。 文庫(kù)方法
[0265] 本發(fā)明提供了用于對(duì)包含含有超長(zhǎng)CDR3序列的抗體的文庫(kù)進(jìn)行創(chuàng)建的方法。用 于創(chuàng)建空間尋址文庫(kù)的方法在WO2010/054007中進(jìn)行了描述。創(chuàng)建酵母、噬菌體、大腸桿 菌或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的文庫(kù)的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
[0266] 本發(fā)明還提供了對(duì)包含超長(zhǎng)CDR3序列的抗體的文庫(kù)進(jìn)行篩選的方法。 定義
[0267] 在描述實(shí)例性實(shí)施方案的上下文（特別是以下權(quán)利要求的上下文中）中使用的術(shù) 語(yǔ)"一個(gè)"、"一種"、"該"和類似指示物應(yīng)被解釋為既包括復(fù)數(shù)又包括單數(shù)，除非本文另有說(shuō) 明或上下文明顯矛盾。本文中數(shù)值范圍的列舉僅意在作為單獨(dú)提及落在范圍內(nèi)的每個(gè)單獨(dú) 的值的速寫方法。除非另有說(shuō)明，每個(gè)單獨(dú)的值猶如其在本文中單獨(dú)列舉一樣并入本說(shuō)明 書。本文所述的全部方法在任何合適的順序下都可完成，除非本文另有說(shuō)明或上下文明顯 矛盾。本文提供的任何實(shí)例或示例性語(yǔ)言（例如，"諸如"）僅意在更好地說(shuō)明示例性實(shí)施 方案并不對(duì)示例性實(shí)施方案構(gòu)成限制的示例性實(shí)施例中，除非另有要求。在說(shuō)明書中沒(méi)有 語(yǔ)言應(yīng)被解釋為意指任何未要求保護(hù)的對(duì)示例性實(shí)施方案的實(shí)施至關(guān)重要的因素。
[0268] 本文可互換使用的"超長(zhǎng)⑶R3"或"超長(zhǎng)⑶R3序列"包含并非來(lái)源于人抗體序列 的CDR3或CDR3序列。超長(zhǎng)CDR3可以是35個(gè)氨基酸長(zhǎng)度或更長(zhǎng)，例如，40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度或 更長(zhǎng)、45個(gè)氨基酸長(zhǎng)度或更長(zhǎng)、50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度或更長(zhǎng)、55個(gè)氨基酸長(zhǎng)度或更長(zhǎng)或60個(gè)氨 基酸長(zhǎng)度或更長(zhǎng)。超長(zhǎng)CDR3的長(zhǎng)度可包含非抗體序列。超長(zhǎng)CDR3可包含隆突結(jié)構(gòu)域的至 少一部分或隆突結(jié)構(gòu)域。超長(zhǎng)CDR3可包含非抗體序列，包括例如細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng) 因子或激素序列。優(yōu)選地，超長(zhǎng)⑶R3是重鏈⑶R3(⑶R-H3或⑶RH3)。優(yōu)選地，超長(zhǎng)⑶R3 是基于或來(lái)源于反芻動(dòng)物（例如牛）序列的序列。超長(zhǎng)CDR3可包含至少3個(gè)或更多個(gè)半 胱氨酸殘基，例如，4個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、6個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、8個(gè)或更多個(gè) 半胱氨酸殘基。超長(zhǎng)CDR3可包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸基序。超長(zhǎng)CDR3可包含氨基酸序 列；該氨基酸序列來(lái)源于或基于SEQIDN0S:23-44,或編碼來(lái)源于或基于SEQIDN0S:2-22 的DNA序列。包含超長(zhǎng)CDR3的可變區(qū)可包含氨基酸序列；該氨基酸序列來(lái)源于或基于SEQ IDN0S:23-44,或編碼來(lái)源于或基于SEQIDN0S:2-22的DNA序列。此類序列可來(lái)源于或 基于牛種系VH基因序列。超長(zhǎng)CDR3可包含基于非人D或來(lái)源于H基因序列的序列（參 見(jiàn)，例如，Koti等人，（2010)M〇1.Immunol. 47:2119-2128)。超長(zhǎng)CDR3可包含基于來(lái)源于 JH序列或的序列（參見(jiàn)，例如：Hosseini等人，（2004)Int.Immunol. 16:843-852)。在一 個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3可包含基于來(lái)源于非人VH序列或的序列和/或基于來(lái)源于非人 DH序列或的序列和/或基于或來(lái)源于JH序列的序列，以及任選地包含2至6個(gè)或更多個(gè) 氨基酸的附加序列，例如，在VH衍生的序列和DH衍生的序列間。在其他實(shí)施方案中，超長(zhǎng) ⑶R3可包含與來(lái)源于或基于SEQIDN0S:23-44的序列具有約50%或更高同源的序列。例 如，超長(zhǎng)CDR3可包含與來(lái)源于或基于SEQIDN0S:23-44的序列具有約60%、70%、80%、 85%、90%、95%、97%或更高同源的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)^1?3可包含序列， 該序列與來(lái)源于或基于SEQIDN0S:23-44的序列的5個(gè)或更多個(gè)氨基酸進(jìn)行比對(duì)。例如， 超長(zhǎng)⑶R3可包含序列，該序列與將來(lái)源于或基于SEQIDNOS:23-44的序列的5個(gè)、10個(gè)、 15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)、55個(gè)、60個(gè)或更多個(gè)氨基酸進(jìn)行比對(duì)。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3可包含序列，該序列含有來(lái)源于或基于SEQIDN0S:23-44 的序列的5個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。例如，超長(zhǎng)CDR3可包含序列，該序列含有來(lái)源于或基 于SEQIDN0S:23-44的序列的5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50 個(gè)、55個(gè)、60個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3可包含與來(lái)源于或 基于SEQIDN0S:2-22的DNA序列具有約50%或更高同源的序列。例如，超長(zhǎng)⑶R3可包含 與來(lái)源于或基于SEQIDN0S:2-22 的DNA序列具有約 60%、70%、80%、85%、90%、95%、 97%或更高同源的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3可包序列，該序列與來(lái)源于或基 于SEQIDN0S:2-22的DNA序列的5個(gè)或更多個(gè)核酸進(jìn)行比對(duì)。例如，超長(zhǎng)⑶R3可包序列， 該序列與來(lái)源于或基于SEQIDNOS: 2-22的DNA序列的5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30 個(gè)、35 個(gè)、40 個(gè)、45 個(gè)、50 個(gè)、55 個(gè)、60 個(gè)、80 個(gè)、100 個(gè)、120 個(gè)、140 個(gè)、150 個(gè)、175 個(gè)、200 個(gè)、225個(gè)、250個(gè)、275個(gè)、300個(gè)、350個(gè)、400個(gè)、450個(gè)、500個(gè)、550個(gè)、600個(gè)或更多個(gè)核 酸進(jìn)行比對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3可包含序列，該序列含有來(lái)源于或基于SEQ IDNOS: 2-22的DNA序列的5個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核酸。例如，超長(zhǎng)⑶R3可包含序列，該序列含 有來(lái)源于或基于SEQIDNOS:2-22的DNA序列的5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35 個(gè)、40 個(gè)、45 個(gè)、50 個(gè)、55 個(gè)、60 個(gè)、80 個(gè)、100 個(gè)、120 個(gè)、140 個(gè)、150 個(gè)、175 個(gè)、200 個(gè)、225 個(gè)、250個(gè)、275個(gè)、300個(gè)、350個(gè)、400個(gè)、450個(gè)、500個(gè)、550個(gè)、600個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基 酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3可包含與來(lái)源于或基于隆突結(jié)構(gòu)域序列的序列具有約 50%或更高同源的序列。例如，超長(zhǎng)CDR3可包含與來(lái)源于或基于隆突結(jié)構(gòu)域序列的序列具 有約60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或更高同源的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超 長(zhǎng)CDR3可包含序列，該序列與基于或來(lái)源于隆突結(jié)構(gòu)域序列的序列的5個(gè)或更多個(gè)氨基酸 進(jìn)行比對(duì)。例如，超長(zhǎng)CDR3可包含序列，該序列與基于或來(lái)源于隆突結(jié)構(gòu)域序列的序列的 5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)、55個(gè)、60個(gè)或更多個(gè)氨基酸 進(jìn)行比對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3可包含序列，該序列含有基于或來(lái)源于隆突結(jié) 構(gòu)域序列的序列的5個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。例如，超長(zhǎng)CDR3可包含序列，該序列含有基 于或來(lái)源于隆突結(jié)構(gòu)域序列的序列的5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45 個(gè)、50個(gè)、55個(gè)、60個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)⑶R3可包含與來(lái)源 于或基于隆突結(jié)構(gòu)域序列的序列具有約50%或更高同源的序列。例如，超長(zhǎng)CDR3可包含 與來(lái)源于或基于隆突結(jié)構(gòu)域序列的序列具有約60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或 更高同源的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3可包含序列，該序列與基于或來(lái)源于隆 突結(jié)構(gòu)域序列的序列的5個(gè)或更多個(gè)氨基酸進(jìn)行比對(duì)。例如，超長(zhǎng)CDR3可包含序列，該序 列與基于或來(lái)源于隆突結(jié)構(gòu)域序列的序列的5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40 個(gè)、45個(gè)、50個(gè)、55個(gè)、60個(gè)或更多個(gè)氨基酸進(jìn)行比對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，超長(zhǎng)CDR3可 包含序列，該序列含有基于或來(lái)源于莖結(jié)構(gòu)域序列的序列的5個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。例 如，超長(zhǎng)⑶R3可包含序列，該序列含有基于或來(lái)源于莖結(jié)構(gòu)域序列的序列的5個(gè)、10個(gè)、15 個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)、55個(gè)、60個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。本文公 開(kāi)的抗體可包含來(lái)源于或基于本文公開(kāi)的任何超長(zhǎng)CDR3序列的超長(zhǎng)CDR3的至少一部分。 可修飾或改變超長(zhǎng)CDR3或其部分的序列以含有一個(gè)或多個(gè)基于非牛抗體的核苷酸和/或 氨基酸。超長(zhǎng)CDR3或其部分的序列的修飾和/或改變可提高表達(dá)的抗體的一個(gè)或多個(gè)特 性。例如，修飾和/或改變可提高抗體的表達(dá)、折疊、半衰期、活性和/或溶解度。
[0269] "分離的"生物分子，諸如本文公開(kāi)的各種多肽、多核苷酸和抗體，是指已經(jīng)從其自 然環(huán)境的至少一種組分中鑒定和分離和/或回收的生物分子。
[0270] "拮抗劑"是指部分或完全阻斷、抑制或中和多肽的活性（例如，生物活性）的任何 分子。另外，"拮抗劑"還涵蓋完全或部分抑制編碼多肽的mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯的分子。合適 的拮抗劑分子包括：例如拮抗劑抗體或抗體片段、天然多肽的片段或氨基酸序列變體、肽、 反義寡核苷酸、小的有機(jī)分子以及編碼多肽拮抗劑或拮抗劑抗體的核酸。涉及到"一種"拮 抗劑涵蓋一種拮抗劑或兩種或更多種不同拮抗劑的組合。
[0271] "激動(dòng)劑"是指部分或完全模擬多肽的生物活性的任何分子。另外，"激動(dòng)劑"還涵 蓋促進(jìn)編碼多肽的mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯的分子。合適的激動(dòng)劑分子包括：例如激動(dòng)劑抗體或 抗體片段、天然多肽、天然多肽的片段或氨基酸序列變體、肽、反義寡核苷酸、小的有機(jī)分子 以及編碼多肽激動(dòng)劑或抗體的核酸。涉及到"一種"激動(dòng)劑涵蓋一種激動(dòng)劑或兩種或多種 不同激動(dòng)劑的組合。
[0272] "分離的"抗體是指已經(jīng)從其自然環(huán)境的組分中鑒定和分離和/或回收的抗體。其 自然環(huán)境的污染組分是可干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，并可包括酶、激素以及其他 蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體將被純化（1)至大于抗體重量的95% (例 如，通過(guò)Lowry法的測(cè)定），并優(yōu)選至多于99% (按重量計(jì)）；（2)至足以獲得N末端或內(nèi)部 氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度（通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀）；或（3)在還原或非還原條 件下經(jīng)SDS-PAGE達(dá)到同質(zhì)性（例如，使用Coomassie?藍(lán)或優(yōu)選銀著色）。由于將不存在 抗體自然環(huán)境的至少一個(gè)組分，因此分離的抗體包括在組合細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。同樣的，分 離的抗體包括在重組細(xì)胞周圍的介質(zhì)中的抗體?？山?jīng)至少一個(gè)純化步驟制備分離的抗體。
[0273] "分離的"核酸分子是指核酸分子，該核酸分子從在抗體核酸的自然來(lái)源中通常與 其相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)污染核酸分子中鑒定和分離。分離的核酸分子不同于其在自然界中發(fā) 現(xiàn)的形式或構(gòu)建。分離的核酸分子因此從在自然細(xì)胞中存在的核酸分子中區(qū)分開(kāi)來(lái)。然 而，分尚的核酸分子包括在表達(dá)抗體的細(xì)胞中含有的核酸分子，其中例如，核酸分子是在染 色體位置中不同于天然細(xì)胞的核酸分子。
[0274] 如在Kabat中編號(hào)的可變域殘基或如在Kabat中編號(hào)的氨基酸位置及其變體是 指在Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第 5 版，Public HealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md. (1991)中用于編譯抗體 的重鏈可變域或輕鏈可變域的編號(hào)系統(tǒng)。使用該編號(hào)系統(tǒng)，對(duì)應(yīng)于缺乏或插入至可變域的 FR或CDR，實(shí)際的線性氨基酸序列包含更少或附加的氨基酸。例如，重鏈可變域可含有在H2 的第52個(gè)殘基之后的氨基酸插入物（例如，根據(jù)Kabat的52a殘基）以及在重鏈FR第82 個(gè)殘基之后的插入殘基（例如，根據(jù)Kabat的82a、82b和82c殘基）。經(jīng)抗體序列的同源性 區(qū)域與"標(biāo)準(zhǔn)的"Kabat編號(hào)的序列的比對(duì)，針對(duì)給定抗體來(lái)確定殘基的Kabat編號(hào)。
[0275] "基本上類似"或"基本上相同"是指兩個(gè)數(shù)值之間（通常，與本文公開(kāi)的抗體相關(guān) 的一個(gè)和與參考/對(duì)比抗體相關(guān)的另一個(gè)）具有足夠高相似性以至于一個(gè)本領(lǐng)域中的技術(shù) 人員可認(rèn)為兩個(gè)值間的差異在由所述值測(cè)量的生物學(xué)特性背景內(nèi)是幾乎沒(méi)有或沒(méi)有生物 學(xué)或統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。在所述兩個(gè)值間的差異作為參考/對(duì)比抗體的數(shù)值的函數(shù)，是優(yōu)選少 于約50 %，優(yōu)選少于約40 %，優(yōu)選少于約30 %，優(yōu)選少于約20 %，優(yōu)選少于約10 %。
[0276] "結(jié)合親和力"通常是指在分子（例如抗體）的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和其結(jié)合配偶體（例 如抗原）之間的總非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度。除非另有說(shuō)明，"結(jié)合親和力"是指反應(yīng)在結(jié)合 對(duì)（例如，抗體和抗原）成員間的1:1相互作用的固有結(jié)合親和力。分子X(jué)對(duì)其配偶體Y的 親和力通常由解離常數(shù)來(lái)表示。親和力可通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法包括本文所述的方法來(lái)進(jìn) 行測(cè)量。低親和力抗體通常與抗原結(jié)合緩慢并且傾向于容易解離，反之高親和力抗體通常 與抗原結(jié)合迅速并且傾向于保持更長(zhǎng)時(shí)間的結(jié)合。在領(lǐng)域中已知多種測(cè)量親和力的方法， 任何測(cè)量方法都可用于本發(fā)明的目的。
[0277] "on-rate"或"關(guān)聯(lián)的比率"或"關(guān)聯(lián)率"或"Km"可由表面等離子體共振技術(shù)諸如 Biacore(例如，BiacoreA100,Biacore?-2000,Biacore?-3000,Biacore，Inc.，Piscatawa y，N.J.)羧甲基葡聚糖生物傳感器芯片并按照供應(yīng)商的說(shuō)明書來(lái)確定。
[0278] "載體"是指核酸分子，該核酸分子能夠轉(zhuǎn)運(yùn)另一個(gè)與其結(jié)合的核酸分子。一種類 型的載體是"質(zhì)粒"，該質(zhì)粒是指可與附加DNA片段結(jié)合的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的 載體是噬菌體載體。另一種類型的載體是病毒載體，其中附加DNA片段可與病毒基因組連 接。某些載體能夠在引入載體的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制（例如，具有復(fù)制的細(xì)菌源的細(xì)菌載 體和附加型哺乳動(dòng)物載體）。其他載體（例如非附加型哺乳動(dòng)物載體）經(jīng)引入至宿主細(xì)胞 而被整合到宿主細(xì)胞基因組，從而與宿主基因組一起被復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與載 體連接的基因的表達(dá)。此類載體在本文稱為"重組表達(dá)載體"（或簡(jiǎn)稱"重組載體")。通常， 在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。由于質(zhì)粒是載體的一種常用形式， 因此"質(zhì)粒"和"載體"有時(shí)可以互換使用。
[0279] "基因"是指包含對(duì)多肽、前驅(qū)體或RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA)的產(chǎn)生是必需的 編碼序列的核酸（例如，DNA)序列。只要能夠保留全長(zhǎng)或片段的期望活性或功能特性（例 如，酶促活性，配體結(jié)合，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，免疫原性等），多肽可由全長(zhǎng)編碼序列或編碼序列的任 何部分進(jìn)行編碼。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)以及位于與兩個(gè)5'和3'末端上的編碼 區(qū)毗鄰且在任一末端上與編碼區(qū)具有約1個(gè)或多個(gè)Kb距離的序列，以至于基因?qū)?yīng)于全長(zhǎng) mRNA的長(zhǎng)度。位于編碼區(qū)的5'并存在于mRNA中的序列被稱為5'非翻譯序列。位于編碼 區(qū)的3'或下游并存在于mRNA中的序列被稱為3'非翻譯序列。術(shù)語(yǔ)"基因"涵蓋cDNA和 基因的基因組形式?；虻幕蚪M形式或克隆含有由非編碼序列中斷的編碼區(qū)，該非編碼 序列被稱為"內(nèi)含子"或"間插區(qū)域"或"間插序列"。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄到核RNA(hnRNA)的基 因片段；內(nèi)含子可含有調(diào)節(jié)元件諸如：增強(qiáng)子。內(nèi)含子從核或初級(jí)轉(zhuǎn)錄體中移除或剪接掉； 內(nèi)含子因此在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄中缺失。翻譯過(guò)程中mRNA的功能是指定新生多肽的氨 基酸的序列或次序。除含有內(nèi)含子外，基因的基因組形式還可包括位于在RNA轉(zhuǎn)錄體中存 在的序列的兩個(gè)5'和3'末端上的序列。這些序列被稱為"側(cè)翼"序列或區(qū)域（這些側(cè)翼 序列位于在mRNA轉(zhuǎn)錄體中存在的非翻譯序列的5'或3'）。5'側(cè)翼區(qū)域可含有控制和影響 基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列，諸如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。3'側(cè)翼區(qū)域可含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止，轉(zhuǎn)錄后切割 和多聚腺苷酸化的序列。
[0280] 如本文中可互換使用的"多核苷酸"或"核酸"是指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合物并包 含DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基和/或其 類似物，或通過(guò)DNA或RNA聚合酶或通過(guò)合成反應(yīng)可摻入到聚合物的任何基底。多核苷酸 包括修飾的核苷酸，諸如甲基化的核苷酸和其類似物。如果存在的話，核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可 以在聚合物的組裝之后或之前賦予。核苷酸序列可被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可在合 成后進(jìn)一步修飾，諸如通過(guò)與標(biāo)記偶聯(lián)。其他類型的修飾包括，例如"帽";一個(gè)或多個(gè)天然 存在的核苷酸用類似物取代；核苷酸間修飾例如使用不帶電荷的鍵合（例如甲基磷酸酯、 磷酸三脂、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等）和使用帶電荷的鍵合（例如硫代磷酸鹽、二硫代磷 酸鹽等）的修飾；含懸掛物部分例如蛋白質(zhì)（例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚-L-賴氨 酸等）的修飾；使用插層劑（例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等）的修飾；含螯合劑（例如金屬、放射性 金屬、硼、氧化金屬等）的修飾；含烷化劑的修飾、使用修飾的鍵合（例如α異頭核酸）；以 及多核苷酸的未修飾的形式。另外，通常存在于糖中的任何羥基基團(tuán)可以例如被磷酸酯基 團(tuán)、磷酸鹽基團(tuán)替換，被標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)或被活化以制備與附加核苷酸的附加鍵合，或者 可以與固態(tài)或半固態(tài)支撐物偶聯(lián)。5'和3'末端的OH可以磷酸化或被胺或從1個(gè)至20個(gè) 碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)部分取代。其他氫氧根也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可包 括本領(lǐng)域已知的核糖或脫氧核糖的類似形式，例如包括：2' -0-甲基_、2' -0-烯丙基、2' -氟 代-或2' -疊氮基-核糖，碳環(huán)糖類似物，α-異頭糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來(lái) 蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，無(wú)環(huán)類似物以及基本的核糖類似物諸如甲基核苷。一個(gè) 或多個(gè)磷酸二酯鍵合可被備選的連接基團(tuán)替換。這些備選的連接基團(tuán)包括但不限于：實(shí)施 方案，其中磷酸酯被P(〇)S(〃硫代〃）、P(S)S(〃二硫代〃）、〃 (0)NR2 (〃酰胺化〃）、P(0)R、P(0) OR'、C0或CH2 (〃縮醛形式〃）替換，其中各個(gè)R或R'獨(dú)立地是H或任選的含有醚（-0-)、鍵 合、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基（araldyl)的取代或未取代的烷基（1-20個(gè)C)。并 非所有的多核苷酸的鍵合需要是相同的。前述描述適用于本文中涉及到的所有多核苷酸， 包括RNA和DNA。
[0281] "寡核苷酸"是指短的，通常是單鏈，通常是一般但不一定具有小于約200個(gè)核苷酸 長(zhǎng)度的合成多核苷酸。術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"和"多核苷酸"并不相互排斥。上文對(duì)多核苷酸的 描述同樣和完全適用于寡核苷酸。
[0282] "嚴(yán)格雜交條件"是指在該條件下，探針通常在核酸的復(fù)雜混合物中將與其 靶亞序列雜交但不與其他序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是依賴序列的并在不同的情況 下是不同的。較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的大量的指導(dǎo)可見(jiàn)于 Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-Hybridizationwith NucleicProbes,''Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyof nucleicacidassays" (1993)。通常，嚴(yán)格條件選定為比在給定離子強(qiáng)度pH值下的特異性 序列的熱熔點(diǎn)（Tm)低約5°C-KTC。Tm是溫度（在確定的離子強(qiáng)度、pH和核濃度下），在 該溫度下，50%與靶標(biāo)互補(bǔ)的探針與靶序列平衡雜交（因?yàn)榘行蛄羞^(guò)量存在時(shí)，在Tm時(shí)，在 平衡下，50%探針被使用）。嚴(yán)格條件還可通過(guò)加入去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)選擇性 或特異性雜交，正信號(hào)是至少兩次背景雜交，優(yōu)選10次背景雜交。實(shí)例性嚴(yán)格雜交條件可 以是如下：50%甲酰胺，5xSSC和1%SDS，在42°C下培養(yǎng)或5xSSC、l%SDS，在65°C下培養(yǎng)， 并在65 °C下用0. 2xSSC和0. 1 %SDS進(jìn)行洗滌。
[0283] "重組體"當(dāng)參照細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)、抗體或載體使用時(shí)，表明該細(xì)胞、核酸、蛋白 質(zhì)或載體已經(jīng)通過(guò)異源核酸或蛋白質(zhì)的引入、天然核酸或蛋白質(zhì)的改變進(jìn)行了修飾，或表 明該細(xì)胞由被如此修飾的細(xì)胞衍生。例如，重組細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞的天然（非組合）形式中 未發(fā)現(xiàn)的基因或表達(dá)過(guò)表達(dá)或以其他方式異常表達(dá)的天然基因，例如作為非天然發(fā)生片段 或剪接變體。本文通過(guò)術(shù)語(yǔ)"組合核酸"意指：一般而言，通過(guò)一般不會(huì)在自然中發(fā)現(xiàn)的核 酸例如使用聚合酶和內(nèi)切酶在體外最初形成的核酸。以這種方式，完成不同序列的可操作 的鍵合。因此，線性形式的分離核酸或通過(guò)連接一般不會(huì)連接的DNA分子在體外形成表達(dá) 載體，出于本公開(kāi)的目的而都被認(rèn)為是重組體。應(yīng)當(dāng)理解：一旦形成重組核酸并引入至宿主 細(xì)胞或有機(jī)體，重組核酸將復(fù)制非重組核酸，例如使用所述宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)器而非 體外操作；然而，此類核酸一旦重組產(chǎn)生，盡管隨后復(fù)制非重組，出于本公開(kāi)的目的而都被 認(rèn)為是重組體。同樣，"重組蛋白質(zhì)"是使用重組技術(shù)例如通過(guò)本文所述的重組核酸的表達(dá) 制備的蛋白質(zhì)。
[0284] 關(guān)于肽或多肽序列的"百分比（％ )氨基酸序列同一性"是指在如果需要的以達(dá) 到最大百分比序列同一性的比對(duì)序列和引入缺口并且任何保守取代不認(rèn)為是序列同一性 的一部分后，在與特異性肽或多肽序列的氨基酸殘基相同的候選序列中的氨基酸殘基百分 t匕。為測(cè)定百分比氨基酸序列同一性的比對(duì)可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的各種方式例如使用 公眾可獲得的計(jì)算機(jī)軟件諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MegAlign(DNASTAR)軟件來(lái)完成。 本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定用于測(cè)量比對(duì)的適當(dāng)?shù)膮?shù)，包括在對(duì)照序列的全長(zhǎng)上達(dá)到最大 對(duì)比所需的任何算法。
[0285] 可互換使用的"多肽"、"肽"、"蛋白質(zhì)"和"蛋白質(zhì)片段"是指氨基酸殘基的聚合物。 該術(shù)語(yǔ)適用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人 工化學(xué)模擬物，該術(shù)語(yǔ)還適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0286] "氨基酸"是指天然存在的和合成的氨基酸以及功能與天然發(fā)生的氨基酸相類似 的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然發(fā)生的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸以及后來(lái) 被修飾的這些氨基酸，例如羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和〇-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是 指具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的天然存在的氨基酸的化合物，例如，結(jié)合到氫、羧基、氨基和R 基的α碳，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。此類類似物可具有修飾 的R基（例如正亮氨酸）或修飾的肽骨架，但保持天然發(fā)生的氨基酸的相同的基本化學(xué)結(jié) 構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有的結(jié)構(gòu)與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同但功能與天然存在的氨基 酸相類似的化學(xué)化合物。
[0287] "保守修飾的變體"適用于氨基酸和氨基酸序列。"氨基酸變體"是指氨基酸序列。 對(duì)于特定的核酸序列，保守修飾的變體是指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸 或其中所述核酸不編碼氨基酸序列，還指基本相同或相關(guān)聯(lián)的（例如天然連續(xù)的）序列。由 于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能相同的核酸編碼大多數(shù)蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA，GCC，GCG 和GCU全部編碼氨基酸丙氨酸。因此，在由密碼子指定丙氨酸的每個(gè)位置，該密碼子可改變 成另一個(gè)所述相應(yīng)密碼子而不用改變編碼的多肽。這樣的核酸變異是"沉默變異"，該"沉 默變異"是一種保守修飾的變異。編碼多肽的本文所述的每個(gè)核酸序列還描述了核酸的沉 默變異。一個(gè)技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到：在某些情況下，核酸中的各個(gè)密碼子（除通常是蛋氨酸的 唯一密碼子的AUG和通常是色氨酸的唯一密碼子的TGG之外）可進(jìn)行修飾以產(chǎn)生功能相同 的分子。同樣，編碼多肽的核酸的沉默變異隱含在相對(duì)于表達(dá)產(chǎn)物但不相對(duì)于實(shí)際探針序 列的所述序列。至于氨基酸序列，一個(gè)技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到：核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的 取代、缺失或添加是"保守修飾的變體"包括其中改變導(dǎo)致用化學(xué)上相似的氨基酸取代氨基 酸，該核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列改變、添加或刪除編碼序列的一個(gè)氨基酸或小百分比的 氨基酸。提供功能相似的氨基端的保守取代表在本領(lǐng)域中是眾所周知的。此類保守修飾的 變體是除本文所述的多態(tài)變體、種間同系物和等位基因之外但并不將其排出。通常保守取 代包括：1)丙氨酸（A)、甘氨酸（G) ;2)天冬氨酸（D)、谷氨酸（E) ;3)天冬酰胺（N)、谷氨酰 胺（Q) ;4)精氨酸（R)、賴氨酸⑷；5)異亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、蛋氨酸（M)、繳氨酸（V); 6)苯基丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W) ;7)絲氨酸（S)、蘇氨酸⑴以及8)半胱氨酸 (C)、蛋氨酸（M)(參見(jiàn)，例如，Creighton,Proteins(1984))。
[0288] "抗體" (Abs)和"免疫球蛋白"（Igs)是具有類似結(jié)構(gòu)特性的糖蛋白質(zhì)。然而抗體 對(duì)特定的抗原可顯示結(jié)合特異性，免疫球蛋白可包括抗體和通常缺乏抗原特異性的其他抗 體樣分子。后一種多肽，例如，由淋巴系統(tǒng)以低水平生成和由骨髓瘤以升高的水平生成。
[0289] "抗體"、"免疫球蛋白"和"免疫球蛋白構(gòu)建體"在廣義上可互換使用且包括單克 隆抗體（例如，全長(zhǎng)或完整的單克隆抗體）、多克隆抗體、多價(jià)抗體、多特異性抗體（雙特異 性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性）并還可包括某些抗體片段（如本文中更詳細(xì) 地描述）。術(shù)語(yǔ)"抗體"可指全長(zhǎng)抗體或其一部分?？贵w可指包含至少一個(gè)抗體序列的肽。 抗體序列可包含5個(gè)或更多個(gè)氨基酸的抗體序列。例如抗體序列可包含6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個(gè)氨基酸的抗體序列。5個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以是抗 體序列的連續(xù)氨基酸?；蛘?，5個(gè)或多個(gè)氨基酸是抗體序列的非連續(xù)氨基酸。例如，5個(gè)或 更多個(gè)氨基酸可包含在抗體序列內(nèi)的保守基序。例如，5個(gè)或更多個(gè)氨基酸可包含在超長(zhǎng) CDR3序列內(nèi)的保守基序?？贵w可以是人的、人源化的，全人的和/或親和力成熟的?？贵w可 以是嵌合抗體?？贵w可以是重組的、工程化的或合成的抗體?？贵w可以是牛、牛工程化的、 全牛和/或親和力成熟的。牛工程化的抗體可包含由?？贵w序列衍生的一個(gè)或多個(gè)核苷酸 或肽。全?？贵w可包含用基于牛抗體序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸或肽替換非?？贵w序列的一 個(gè)或多個(gè)核苷酸或肽?？贵w可指無(wú)論自然的或部分或完全合成的（諸如重組產(chǎn)生的）免疫 球蛋白和免疫球蛋白部分，所述免疫球蛋白或免疫球蛋白部分包括足以形成抗原結(jié)合位點(diǎn) 的免疫球蛋白分子可變區(qū)的至少一部分。因此，抗體或其部分包含與免疫球蛋白抗原結(jié)合 位點(diǎn)同源或基本同源的具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白質(zhì)。例如，抗體可指包含兩條重鏈（其 可表示為H和H'）和兩條輕鏈（其可表示為L(zhǎng)和L'）的抗體，其中各個(gè)重鏈可以是足以形 成抗原結(jié)合位點(diǎn)的全長(zhǎng)免疫球蛋白重鏈或其部分（例如，重鏈包括但不限于：VH鏈、VH-CHl 鏈和VH-CH1-CH2-CH3鏈）并且各個(gè)輕鏈可以是足以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的全長(zhǎng)輕鏈或其部 分（例如，輕鏈包括但不限于：VL鏈和VL-CL鏈）。各個(gè)重鏈（H和H'）與一條輕鏈（分別 是L和L'）成對(duì)。通常，抗體最低限度地包括可變重鏈（VH)和/或可變輕鏈（VL)的全部 或至少一部分?？贵w還可包括恒定區(qū)的全部或至少一部分。例如，全長(zhǎng)抗體是具有兩條全 長(zhǎng)重鏈（例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和兩條全長(zhǎng)輕鏈（VL-CL)以及鉸 鏈區(qū)的抗體，諸如由抗體分泌B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體和合成產(chǎn)生的具有相同結(jié)構(gòu)域的抗體。此 外，"抗體"是指包含能夠非共價(jià)、可逆并以特定方式與相應(yīng)的抗原結(jié)合的免疫球蛋白片段 的免疫球蛋白家族或多肽的一部分。實(shí)例性抗體結(jié)構(gòu)單元包括四聚物。各個(gè)四聚物包含兩 個(gè)相同的多肽鏈對(duì)，具有一條"輕鏈"（約25kD)和一條"重鏈"（約50-70kD)的各個(gè)對(duì)通 過(guò)二硫鍵連接。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因以及大 量免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分類為κ或λ。重鏈被分類為依次分別定義免疫球蛋 白種類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的γ、μ、α、δ或ε。各個(gè)鏈的N-端定義約100至110 或更多個(gè)主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的氨基酸的可變區(qū)。術(shù)語(yǔ)"可變輕鏈（VL) "和"可變重鏈（VH) " 分別是指輕鏈和重鏈的這些區(qū)域。在一些情況下，本文提供的抗體包含來(lái)自禽類抗體、爬蟲 類抗體、兩棲類抗體、昆蟲抗體或其嵌合組合物的至少一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。抗體可包含 來(lái)自嵌合結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。嵌合抗體可由倆個(gè)或多個(gè)不同種類衍生 (例如，鼠和人，牛和人）?？贵w可包含來(lái)自工程化的、重組或合成抗體的至少一個(gè)免疫球蛋 白結(jié)構(gòu)域。在一些情況下，使用實(shí)驗(yàn)室制備或從細(xì)胞提取的抗體基因創(chuàng)建工程化的、重組或 合成抗體?？贵w基因源自一種或多種哺乳動(dòng)物。例如，抗體基因源自人類?？贵w基因源自 牛。此外或另外，本文公開(kāi)的抗體包含來(lái)自人源化的、人工程化的或全人抗體的至少一個(gè)免 疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。抗體可包含來(lái)自兩種或更多種不同抗體的抗體序列。兩種或更多種不同 抗體可以來(lái)自相同種類。例如，該種類可以是牛種類、人種類或鼠種類。兩種或更多種不同 抗體可以來(lái)自相同類型的動(dòng)物。例如，兩種或更多種不同抗體可以來(lái)自牛。兩種或更多種 不同抗體可以來(lái)自人。此外，兩種或更多種不同抗體是來(lái)自不同種類。例如，兩種或更多種 不同抗體是來(lái)自人種類和牛種類。在另一個(gè)實(shí)例中，兩種或更多種不同抗體是來(lái)自牛種類 和非牛種類。在另一個(gè)實(shí)例中，兩種或更多種不同抗體是來(lái)自人種類和非人種類。兩種或 更多種不同抗體可以來(lái)自不同動(dòng)物。例如，兩種不同動(dòng)物是人和母牛。不同動(dòng)物可以來(lái)自 相同種類。例如，不同動(dòng)物是人和母牛。不同動(dòng)物可以是來(lái)自相同種類，例如不同動(dòng)物可以 是母牛和水牛。
[0290]"可變"是指可變域的某些部分（亦被稱為可變區(qū)）在抗體的序列間差異廣泛并 用于各個(gè)特定抗體與其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性不是均勻分布于整個(gè)抗體 的可變域?？勺冃灾饕性谌齻€(gè)區(qū)域，該三個(gè)區(qū)域被稱為：兩個(gè)都在輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)或高變區(qū)（HVR)以及重鏈可變域。CDR包括這些指定為如本文所示的在可變區(qū)序列 內(nèi)的Kabat、Chothia和頂GT?？勺冇虻母叨缺Ｊ夭糠直环Q為構(gòu)架（FR)。天然重鏈和輕 鏈的可變區(qū)各自包含大多采取β-片層構(gòu)型并由三個(gè)形成環(huán)的CDR連接的四個(gè)FR區(qū)，該環(huán) 連接β-片層結(jié)構(gòu)并在一些情況形成β-片層結(jié)構(gòu)的一部分。在各個(gè)鏈中的⑶R通過(guò)FR 區(qū)域緊密保持在一起，并與來(lái)自其他鏈的CDR-起促成抗體的抗原-結(jié)合位點(diǎn)的形成（參 見(jiàn):Kabat等人，SeauencesofProteinsofTmmunologicalInterest,第五版，National InstituteofHealth,Bethesda,Md. (1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但現(xiàn) 實(shí)多種效應(yīng)子功能，諸如抗體參與到抗體-依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0291] 抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的被稱為"Fab"片段的抗原-結(jié)合片段，各 自具有一個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)和殘余"Fc"片段，"Fab"片段的名稱反映了其易于結(jié)晶的能力。 胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個(gè)抗原-結(jié)合位點(diǎn)的F(ab)2片段并仍能夠交聯(lián)抗原。
[0292]"Fv"是指包含抗原-識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體。在雙鏈Fv種類中，該區(qū)域包含 一條重鏈和一條輕鏈可變域的非共價(jià)結(jié)合的二聚體。在單鏈Fv(scFv)種類中，一條重鏈和 一條輕鏈可變域可由柔性肽接頭共價(jià)地連接，進(jìn)而輕鏈和重鏈可以"二聚的"結(jié)構(gòu)連接，該 "二聚的"結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)類似于輕鏈和重鏈在雙鏈Fv(scFv)種類中。正是在這種構(gòu)型中，各個(gè) 可變域的3個(gè)⑶R相互作用以將抗原-結(jié)合位點(diǎn)限定在VH-VL二聚體的表面上。6個(gè)⑶R 共同賦予抗體的抗原-結(jié)合特異性。然而，即使一個(gè)可變域（或只含有三個(gè)抗原特異性的 Fv的一半）也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，雖然比完整結(jié)合位點(diǎn)更低的親和力。
[0293]Fab片段還含有輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域（CHl)。Fab'片段因在包含抗 體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸的重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羰基末端處添加幾個(gè)殘基而與Fab片 段不同。Fab' -SH本文指定為Fab'，其中恒定域的半胱氨酸殘基具有游離地硫醇基。F(ab'）2 抗體片段最初是作為Fab'片段對(duì)產(chǎn)生，該Fab'片段在其之間具有鉸鏈半胱氨酸。還已知 抗體片段的其他化學(xué)偶聯(lián)。
[0294] 基于脊椎動(dòng)物種類恒定域的氨基酸序列，將來(lái)自任何脊椎動(dòng)物種類的抗體（免疫 球蛋白）的"輕鏈"分配到兩個(gè)明顯不同類型的被稱為kappa(K)和IambdaU)的其中之 〇
[0295] 基于它們的重鏈恒定域的氨基酸序列，將免疫球蛋白分配成不同的類別。存在五 個(gè)重要類別的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM以及可進(jìn)一步分為亞類（同種型）的 一些免疫球蛋白，例如IgGpIgG2、IgG3、IgG4、IgAJPIgA2。對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白的不同種類 的重鏈恒定域分別被稱為a、S、ε、Y和μ。免疫球蛋白不同類別的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu) 型是眾所周知的。
[0296] "抗體片段"包含完整抗體的僅僅一部分，其中該部分優(yōu)選保留在完整抗體存在 時(shí)通常與該部分相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)、優(yōu)選大部分或全部功能?？贵w片段的實(shí)例包括：Fab、 Fab'、F(ab'）2、單鏈Fvs(scFv)、Fv、dsFv、雙抗體（例如（dsFv)2)、Fd和Fd' 片段、Fab 片段、Fd片段、scFv片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微抗體、柔性微抗體、雙特異性片段和 由抗體片段形成的多特異性抗體（參見(jiàn)，例如MethodsinMolecularBiology,第207 卷：RecombinantAntibodiesforCancerTherapyMethodsandProtocols(2003);第一 章；第3-25頁(yè)，Kipriyanov)。其他已知的片段包括但不限于：scFab片段（Hust等人，BMC Biotechnology(2007)，7:14)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn) 以及因此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)c區(qū)域的抗體 片段，保留在完整抗體存在時(shí)通常與該Fc區(qū)域相關(guān)聯(lián)的至少一個(gè)生物學(xué)功能，諸如FcRn結(jié) 合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和互補(bǔ)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段是具有體內(nèi)半衰 期基本類似于完整抗體的單價(jià)抗體。例如，此類抗體片段可包含與Fc序列連接的能夠賦予 片段體外穩(wěn)定性的抗原結(jié)合臂。再例如，抗體片段或抗體部分是指全長(zhǎng)抗體的任何部分，該 部分小于全長(zhǎng)但包含足以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體可變區(qū)的至少一部分（例如，一個(gè)或多 個(gè)CDR)并因此保留全長(zhǎng)抗體、抗體片段、包括由全長(zhǎng)抗體酶處理產(chǎn)生的抗體衍生物以及合 成例如重組產(chǎn)生的衍生物的結(jié)合特異性和/或活性。
[0297] "dsFv"是指具有工程化分子間二硫鍵并穩(wěn)定VH-VL對(duì)的Fv。
[0298] "Fd片段"是指包含可變區(qū)（VH)和抗體重鏈的一個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域（CHl)的抗體片 段。
[0299] "Fab片段"是指含有由全長(zhǎng)免疫球蛋白在木瓜蛋白酶下的消化產(chǎn)生的全長(zhǎng)抗體的 一部分的抗體片段或具有合成例如重組產(chǎn)生的相同結(jié)構(gòu)的片段。Fab片段包含輕鏈（含有 VL和CL部分）以及含有重鏈可變域（VH)和重鏈的一個(gè)恒定區(qū)域結(jié)構(gòu)域部分（CHl)的另一 條鏈；Fab片段可重組產(chǎn)生。
[0300] "F(ab'）2片段"是指由免疫球蛋白在胃蛋白酶pH4.0-4.5下的消化產(chǎn)生的抗體 片段或合成例如重組產(chǎn)生的具有相同結(jié)構(gòu)的抗體。F(ab'）2片段包含兩個(gè)Fab片段但其中 各個(gè)重鏈部分包含幾個(gè)附加氨基酸，包括形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，該二硫鍵連接兩個(gè) 片段；F(ab'）2片段可重組產(chǎn)生。
[0301] "Fab'片段"是指包含F(xiàn)(ab'）2片段的一半（一條重鏈和一條輕鏈）的片段。
[0302] "Fd'片段"是指包含F(xiàn)(ab'）2片段的一條重鏈部分的抗體的片段。
[0303] "Fv'片段"是指僅僅包含抗體分子的VH和VL結(jié)構(gòu)域的片段。
[0304] "scFv片段"是指包含可變輕鏈（VL)和可變重鏈（VH)的抗體片段，該可變輕鏈 (VL)和可變重鏈（VH)由多肽接頭以任何順序共價(jià)連接。接頭具有長(zhǎng)度以便于橋接兩個(gè)可 變域而無(wú)本質(zhì)干擾。示例性接頭是具有整個(gè)分散以增加溶解度的一些Glu或Lys殘基的 (Gly-Ser)η殘基。
[0305] 雙特異抗體是二聚的scFv;雙特異抗體通常具有比acFv短的肽接頭，并且雙特異 抗體優(yōu)選成為二聚體。
[0306] "HsFv"是指抗體片段，其中通常存在于Fab片段中的恒定域已經(jīng)被異源二聚卷曲 螺旋結(jié)構(gòu)域取代（參見(jiàn)，例如Arndt等人，（2001)JMolBiol. 7:312:221-228)。
[0307] "高變區(qū)"、"HVR"或"HV"、以及"互補(bǔ)決定區(qū)"或"⑶R"，可指抗體可變域的區(qū)域， 該抗體可變域是序列高變的和/或形成限定的環(huán)。通常，抗體包含6個(gè)高變或CDR區(qū)域、 3個(gè)VH(H1，H2,H3)和3個(gè)VL(L1，L2,L3)。許多高變區(qū)域或⑶R劃定都在使用中并涵蓋 于本文。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)（Kabat⑶R)是基于序列可變性并且是最常使用的（Kabat 等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第 5 版PublicHealth Service，NationalInstitutesofHealth，Bethesda,Md. (1991))。Chothia改為是指結(jié)構(gòu) 環(huán)的位置（Chothia和Lesk,J.Mol.Biol. 196:901-917(1987))。AbM高變區(qū)代表在Kabat ⑶R和Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)（Chothia"⑶R"）間的折中并被牛津分子AbM抗體建模軟件采用。 "接觸"高變區(qū)域是基于可獲得復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析。來(lái)自各個(gè)這些高變區(qū)域的殘基記錄 如下。（另請(qǐng)參見(jiàn)，例如，圖1和12. 3ICI抗體的粗體、斜體文本是Kabat⑶R且加下劃線的 文本是ChothiaCDR)

【權(quán)利要求】
1. 一種抗體或其結(jié)合片段的文庫(kù)，其中該抗體或其結(jié)合片段包含超長(zhǎng)CDR3。
2. -種編碼抗體或其結(jié)合片段的多核苷酸的文庫(kù)，其中該編碼的抗體或其結(jié)合片段包 含超長(zhǎng)CDR3。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3的長(zhǎng)度為35個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)、 長(zhǎng)度為40個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)、長(zhǎng)度為45個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)、長(zhǎng)度為50個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)、長(zhǎng)度為 55個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)或者長(zhǎng)度為60個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)。
4. 如權(quán)利要求3所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3的長(zhǎng)度為35個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘 基、4個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、5或更多個(gè)半胱氨酸殘基、6個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、7個(gè) 或更多個(gè)半胱氨酸殘基、8個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、9個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基、10個(gè)或 更多個(gè)半胱氨酸殘基、11個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基或12個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基。
6. 如權(quán)利要求5所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含3個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基。
7. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述抗體或其結(jié)合片段包含半胱氨酸基序。
8. 如權(quán)利要求7所述的文庫(kù)，其中所述半胱氨酸基序是SEQ ID NOS:45-99中的任一個(gè) 或 SEQ ID N0S: 100-56 中的任一個(gè)。
9. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含非人DH或其衍生物。
10. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含JH序列或其衍生物。
11. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含：(a)非人VH序列或其衍 生物；(b)非人DH序列或其衍生物；和/或（c) JH序列或其衍生物。
12. 如權(quán)利要求11所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含額外的氨基酸序列，該額外的 氨基酸序列包含位于VH序列與DH序列之間的2-6個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。
13. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含非牛序列。
14. 如權(quán)利要求13所述的文庫(kù)，其中所述非牛序列為非抗體或人序列。
15. 如權(quán)利要求13所述的文庫(kù)，其中所述非牛序列代替了所述超長(zhǎng)CDR3的至少一部 分。
16. 如權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所述的文庫(kù)，其中所述非牛序列是激素、淋巴因子、白 介素、趨化因子、細(xì)胞因子、毒素或它們的組合。
17. 如權(quán)利要求16所述的文庫(kù)，其中所述非牛序列是細(xì)胞因子。
18. 如權(quán)利要求17所述的文庫(kù)，其中所述細(xì)胞因子是粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)。
19. 如權(quán)利要求13所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含額外的序列，該額外的序列是 接頭。
20. 如權(quán)利要求19所述的文庫(kù)，其中所述接頭連接至所述非抗體序列的C-末端，N-末 端，或同時(shí)連接至C-末端和N-末端。
21. 如權(quán)利要求19所述的文庫(kù)，其中所述接頭是（GGGGS) n(SEQ ID NO:339)，其中η為 1至5的整數(shù)。
22. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含X 1X2X3X4X5基序，其中X 1S 蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)或纈氨酸（V)，其中X2為絲氨酸（S)、蘇氨 酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V)或天冬酰胺（N)，其中X 3為纈氨 酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4為組氨酸（H)、蘇氨酸（T)、精氨酸 (R) 、酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，且其中X5為谷氨酰胺（Q)。
23. 如權(quán)利要求21的所述的文庫(kù)，其中所述X1X2X3X4X 5基序選自SEQ ID N0S:159-191。
24. 如權(quán)利要求22所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3還包含（X aXb) z基序，其中X a為任 意氨基酸殘基，Xb為選自下組的芳族氨基酸：酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)、色氨酸（W)和組氨 酸⑶，并且其中z為1-4。
25. 如權(quán)利要求24所述的文庫(kù)，其中所述（X aXb) z基序?yàn)閅XYXYX。
26. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含X 1X2X3X4X5X n(XaXb)z基序， 其中X1為蘇氨酸（T)、甘氨酸（G)、丙氨酸（A)、絲氨酸（S)或纈氨酸（V)，其中X 2為絲氨酸 (S) 、蘇氨酸（T)、脯氨酸（P)、異亮氨酸（I)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V)或天冬酰胺（N)，其中X3 為纈氨酸（V)、丙氨酸（A)、蘇氨酸（T)或天冬氨酸（D)，其中X4為組氨酸（H)、蘇氨酸（T)、 精氨酸（R)、酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)或亮氨酸（L)，且其中X5為谷氨酰胺（Q)，其中XaS 任意氨基酸殘基，Xb為選自下組的芳族氨基酸：酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)、色氨酸（W)和組 氨酸（H)，其中η為27-54,并且其中z為1-4。
27. 如權(quán)利要求26所述的文庫(kù)，其中所述X 1X2X3X4X5基序是TTVHQ(SEQ ID NO. 159)或 TSVHQ (SEQ ID NO. 160)，并且其中所述（XaXb)z基序是 YXYXYX。
28. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含TSVHQETKKYQ(SEQ ID NO. 157), VHQETKKYQ(SEQ ID NO: 158), CTTVHQXn (SEQ ID NO. 223)m CTSVHQXn (SEQ ID NO. 224)，其中 n 為 1-8, TTVHQ(SEQ ID NO. 159)、TSVHQ(SEQ ID NO. 160)、VHQ、KKQ、VYQ、 YTYNYEW(SEQ ID NO: 235)，或它們的組合。
29. 如權(quán)利要求I或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含CX 1X2X3X4Q,其中X1為T、S、 A或G，其中X2為T、S、A、P或I，其中X 3為V或K，并且其中X 4為H、K或Y。
30. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含CX 1X2VHQ,其中X1為T、S、 A或G，并且其中X2為T、S、A、P或I。
31. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含CX 1X2VX3Q,其中X1為T、S、 A或G，其中X2為T、S、A、P或I，并且其中X 3為H、Y或K。
32. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含CX 1X2KKQ,其中X1為T、S、 A或G，并且其中X2為T、S、A、P或I。
33. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含YX 1YX2,其中X2為E或D。
34. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含YX 1YX2Y15
35. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含Y (E/D)X，其中X為H、W、 N、F、I 或 Y。
36. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含XY(E/D)，其中X為T、S、N 或I。
37. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含Y (E/D) X 1XnW，其中X1為H、 W、N、F、I或Y，并且其中η為1-4。
38. 如權(quán)利要求1或2的文庫(kù)，其中所述抗體或其結(jié)合片段是嵌合的、人工程化的或人 源化的。
39. 如權(quán)利要求1或2所述的文庫(kù)，其中所述超長(zhǎng)CDR3是反芻動(dòng)物的CDR3。
40. 如權(quán)利要求39所述的文庫(kù)，其中所述反芻動(dòng)物是牛。
41. 一種載體的文庫(kù)，其包含如權(quán)利要求2-40中任一項(xiàng)所述的多核苷酸文庫(kù)。
42. -種宿主細(xì)胞的文庫(kù)，其包含如權(quán)利要求41所述的載體文庫(kù)。
43. 如權(quán)利要求42所述的文庫(kù)，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌、昆蟲、病毒或噬菌體。
44. 如權(quán)利要求42所述的文庫(kù)，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
45. 如權(quán)利要求42所述的文庫(kù)，其中所述抗體或其結(jié)合片段被展示在細(xì)胞表面上。
46. 如權(quán)利要求42所述的文庫(kù)，其中所述抗體或其結(jié)合片段是從細(xì)胞分泌的。
47. 如權(quán)利要求42所述的文庫(kù)，其中所述抗體或其結(jié)合片段以空間尋址的格式存在。
48. -種重組抗體或其片段，其中所述重組抗體或其片段的至少一部分基于或來(lái)源于 超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分。
49. 一種抗體或其片段，其包含：(a)第一抗體序列，其中該第一抗體序列的至少一部 分來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分；(b)非抗體序列；和（c)任選的第二抗體序列，其中該第 二抗體序列的至少一部分來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分。
50. 如權(quán)利要求48或49所述的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體、人工程化抗體或人源 化抗體。
51. 如權(quán)利要求48或49所述的抗體，其中所述抗體是?？贵w、牛源化抗體、牛工程化抗 體或全?？贵w。
52. 如權(quán)利要求48或49所述的抗體，其中所述抗體包含F(xiàn)ab、scFv、dsFv、雙抗體、 (dsFv) 2、微抗體、柔性微抗體或雙特異性片段。
53. 如權(quán)利要求48或49所述的抗體，其中所述抗體是分離的抗體。
54. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其進(jìn)一步包含非抗體序列。
55. 如權(quán)利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
56. 如權(quán)利要求55所述的抗體，其中所述哺乳動(dòng)物是牛、人或非牛哺乳動(dòng)物。
57. 如權(quán)利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列來(lái)源于非牛動(dòng)物。
58. 如權(quán)利要求57所述的抗體，其中所述非牛動(dòng)物是蝎子、蜥蜴或蝸牛。
59. 如權(quán)利要求58所述的抗體，其中所述蜥蜴是鈍尾毒蜥。
60. 如權(quán)利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列來(lái)源于生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、 激素或毒素。
61. 如權(quán)利要求60所述的抗體，其中所述生長(zhǎng)因子是GSCF、GMCSF或FGF21。
62. 如權(quán)利要求61所述的抗體，其中所述GCSF是牛GCSF或人GCSF。
63. 如權(quán)利要求60所述的抗體，其中所述細(xì)胞因子是β-干擾素。
64. 如權(quán)利要求60所述的抗體，其中所述激素是毒蜥外泌肽-4、GLP-1、促生長(zhǎng)素抑制 素或促紅細(xì)胞生成素。
65. 如權(quán)利要求60所述的抗體，其中所述毒素是Mokal、VM-24、氯毒素、齊考諾肽或原 毒素2。
66. 如權(quán)利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列是合成序列。
67. 如權(quán)利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列是細(xì)胞因子序列、淋巴因子 序列、趨化因子序列、生長(zhǎng)因子序列、激素序列或毒素序列。
68. 如權(quán)利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列是IL-8序列、IL-21序列 中、SDF-I ( α )序列、促生長(zhǎng)素抑制素序列、氯毒素序列、原毒素2序列或齊考諾肽序列。
69. 如權(quán)利要求49或54所述的抗體，其中所述非抗體序列選自SEQ ID NOS: 317-332。
70. 如權(quán)利要求48或49所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3基于或來(lái)源于牛超長(zhǎng)CDR3。
71. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體的至少一部分來(lái)自哺乳動(dòng)物。
72. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述第一抗體序列的至少一部分和/或所述第二 抗體序列的至少一部分來(lái)自哺乳動(dòng)物。
73. 如權(quán)利要求71-72中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述哺乳動(dòng)物是牛、人或非牛哺乳動(dòng) 物。
74. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體在長(zhǎng)度上為3個(gè)或更多個(gè)氨基酸。
75. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述基于或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的抗體 的部分在長(zhǎng)度上為20個(gè)或更少的氨基酸。
76. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述基于或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的抗體 的部分在長(zhǎng)度上為3個(gè)或更多個(gè)氨基酸。
77. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體包含基于或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu) 域、超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域或其組合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
78. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中該抗體包含來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或 多個(gè)保守基序。
79. 如權(quán)利要求54所述的抗體，其中所述非抗體序列代替了所述超長(zhǎng)CDR3的至少一部 分。
80. 如權(quán)利要求48或49所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3的部分包含超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié) 構(gòu)域的至少一部分、超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的至少一部分或其組合。
81. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中該抗體包含選自SEQ ID N0S: 157-307和SEQ ID NOS:333-336中的任一個(gè)的序列。
82. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中該抗體包含與選自SEQ ID N0S:157-224和 235-295中任一個(gè)的序列50 %或更高同源的序列。
83. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中該抗體包含選自SEQ ID N0S: 157-234的第一序列 和選自 SEQ ID NOS :235-307 和 SEQ ID NOS :333-336 的第二序列。
84. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述重組抗體或其片段的一部分基于或來(lái)源于單 個(gè)超長(zhǎng)⑶R3序列的至少一部分。
85. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述重組抗體或其片段的一部分基于或來(lái)源于兩 種或更多種不同的超長(zhǎng)CDR3序列的至少一部分。
86. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3的一部分基于或來(lái)源于BLV1H12超 長(zhǎng)Q)R3序列。
87. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3的一部分基于或來(lái)源于與BLV1H12 超長(zhǎng)⑶R3序列50 %或更高同源的序列。
88. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)⑶R3的一部分基于或來(lái)源于BLV5B8、 BLVCVl、BLVOT3、BLV8C1 UBFlHl 或 F18 超長(zhǎng) CDR3 序列。
89. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3的一部分基于或來(lái)源于與BLV5B8、 81^(^1、81^^)3、81^8(：11、8?1!11或？18超長(zhǎng)〇)1?3序列50%或更高同源的序列。
90. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述第一和第二抗體序列的長(zhǎng)度為3個(gè)或更多個(gè) 氨基酸。
91. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序 列的一部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分在長(zhǎng)度上為20 個(gè)或更少的氨基酸。
92. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分在長(zhǎng)度上為 3個(gè)或更多的氨基酸。
93. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列包含基于或來(lái)源于 超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域、超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域或其組合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
94. 如權(quán)利要求77或93所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的隆突結(jié)構(gòu)域的一個(gè) 或多個(gè)氨基酸殘基是絲氨酸和/或半胱氨酸殘基。
95. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列包含來(lái)源于超長(zhǎng) CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)保守基序。
96. 如權(quán)利要求78或95所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的莖結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或 多個(gè)保守基序包含選自SEQ ID NOS:157-307和SEQ ID NOS:333-336中的任一個(gè)的序列。
97. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分包含選自SEQ ID NOS:157-307 和 SEQ ID NOS:333-336 中的任一個(gè)的序列。
98. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分和/或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分包含與選自 SEQ ID N0S: 157-224和235-295中的任一個(gè)的序列50%或更高同源的序列。
99. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體序 列的一部分包含選自SEQ ID NOS:157-234中的任一個(gè)的序列。
100. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分包含與選自SEQ ID N0S: 157-224中的任一個(gè)的序列50%或更高同源的序列。
101. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體 序列的一部分包含選自SEQ ID NOS:235-307和SEQ ID NOS:333-336中的任一個(gè)的序列。
102. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體 序列的一部分包含與選自SEQ ID N0S:235-295中的任一個(gè)的序列50%或更高同源的序列。
103. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分和所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分來(lái)源于相同 的超長(zhǎng)⑶R3序列。
104. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第一抗體 序列的一部分和所述來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的至少一部分的第二抗體序列的一部分來(lái)源于兩種 或更多種不同的超長(zhǎng)CDR3序列。
105. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列的超長(zhǎng)CDR3的部 分基于或來(lái)源于BLV1H12超長(zhǎng)CDR3序列。
106. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列的超長(zhǎng)CDR3的部 分基于或來(lái)源于與BLV1H12超長(zhǎng)⑶R3序列50%或更高同源的序列。
107. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列的超長(zhǎng)CDR3的部 分基于或來(lái)源于 BLV5B8、BLVCV1、BLVOT3、BLV8C11、BFlHl 或 F18 超長(zhǎng) CDR3 序列。
108. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其中所述第一和/或第二抗體序列的超長(zhǎng)CDR3的部 分基于或來(lái)源于與81^588、81^(^1、81^^)3、81^8(：11、8?1!11或？18超長(zhǎng)〇)1?3序列50%或 更高同源的序列。
109. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3基于或來(lái)源于長(zhǎng)度為 35個(gè)或更多個(gè)氨基酸的超長(zhǎng)CDR3。
110. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3基于或來(lái)源于包含3 個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基的超長(zhǎng)CDR3。
111. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3基于或來(lái)源于包含一 個(gè)或多個(gè)半胱氨酸基序的超長(zhǎng)CDR3。
112. 如權(quán)利要求111所述的抗體，其中所述一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸基序選自SEQ ID NOS:45-99。
113. 如權(quán)利要求112所述的抗體，其中所述一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸基序選自SEQ ID N0S:100-156。
114. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體基于或來(lái)源于長(zhǎng)度為35個(gè) 或更多個(gè)氨基酸的超長(zhǎng)CDR3。
115. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體基于或來(lái)源于包含3個(gè)或 更多個(gè)半胱氨酸殘基的超長(zhǎng)CDR3。
116. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體基于或來(lái)源于包含一個(gè)或 多個(gè)半胱氨酸基序的超長(zhǎng)CDR3。
117. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體包含長(zhǎng)度為35個(gè)或更多個(gè) 氨基酸的超長(zhǎng)CDR3。
118. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體含有包含3個(gè)或更多個(gè)半 胱氨酸殘基的超長(zhǎng)CDR3。
119. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體含有包含一個(gè)或多個(gè)半胱 氨酸基序的超長(zhǎng)CDR3。
120. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)⑶R3是重鏈⑶R3。
121. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含來(lái)源于或基于非 人DH序列的氨基酸序列。
122. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含來(lái)源于或基于 JH序列的氨基酸序列。
123. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含： a. 來(lái)源于或基于非人VH序列的氨基酸序列； b. 來(lái)源于或基于非人DH序列的氨基酸序列；和/或 c. 來(lái)源于或基于JH序列的氨基酸序列。
124. 如權(quán)利要求48-49中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3包含額外的氨基酸序 列，該額外的氨基酸序列包含位于VH衍生的氨基酸序列與DH衍生的氨基酸序列之間的至 少約兩個(gè)氨基酸殘基。
125. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體或其結(jié)合片段包含選自SEQ ID NOS :24-44的序列，該抗體或其結(jié)合片段由SEQ ID NOS :2-22的DNA編碼。
126. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體或其結(jié)合片段包含選自SEQ ID NO:23 的序列，該抗體或其結(jié)合片段由SEQ ID NO: 1的DNA編碼。
127. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含選自SEQ ID NOS :24-44的序 列。
128. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)⑶R3包含選自SEQ ID NO:23的序列。
129. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)CDR3是由來(lái)源于或基于SEQ ID NOS :2-22的DNA序列所編碼的。
130. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述超長(zhǎng)⑶R3是由來(lái)源于或基于SEQ ID NO: 1 的DNA序列所編碼的。
131. 如權(quán)利要求48、49或54所述的抗體，其進(jìn)一步包含第一接頭序列。
132. 如權(quán)利要求131所述的抗體，其進(jìn)一步包含第二接頭序列。
133. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和第二接頭序列包含相同的序列。
134. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和第二接頭序列包含不同的序列。
135. 如權(quán)利要求131-132中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列將 所述非抗體序列連接到基于或來(lái)源于超長(zhǎng)CDR3的部分的部分上。
136. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列將所述非抗體序 列連接到所述第一抗體序列上。
137. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列將所述非抗體序 列連接到所述第二抗體序列上。
138. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含序列GGGGS。
139. 如權(quán)利要求132的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含（a)序列（GGGGS) n且其中 η = 1 至 5 ; (b)序列 GGGSGGGGS ; (c)序列 GGGGSGGGS ;或（d) (a) - (c)的組合。
140. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列為相同的長(zhǎng)度。
141. 如權(quán)利要求132的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列為不同的長(zhǎng)度。
142. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列的長(zhǎng)度為3個(gè)或 更多個(gè)氨基酸。
143. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含1個(gè)或多個(gè) 甘氨酸殘基。
144. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含2個(gè)或更多 個(gè)連續(xù)甘氨酸殘基。
145. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含1個(gè)或多個(gè) 絲氨酸殘基。
146. 如權(quán)利要求132所述的抗體，其中所述第一和/或第二接頭序列包含1個(gè)或多個(gè) 極性氨基酸殘基。
147. 如權(quán)利要求146所述的抗體，其中所述1個(gè)或多個(gè)極性氨基酸殘基選自絲氨酸、蘇 氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。
148. 如權(quán)利要求146所述的抗體，其中所述極性氨基酸殘基包含不帶電荷的側(cè)鏈。
149. 如權(quán)利要求48所述的抗體，其進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)。
150. 如權(quán)利要求149所述的抗體，其中所述一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)包括蛋白酶的識(shí)別位 點(diǎn)。
151. 如權(quán)利要求149所述的抗體，其中所述蛋白酶為因子X(jué)a。
152. 如權(quán)利要求149所述的抗體，其中所述一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)包括IEGR的氨基酸序 列。
153. 如權(quán)利要求149所述的抗體，其中所述一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)位于所述第一抗體序 列與所述非抗體序列之間。
154. 如權(quán)利要求149所述的抗體，其中所述一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)位于所述第二抗體序 列與所述非抗體序列之間。
155. 如權(quán)利要求49所述的抗體，其進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)接 頭。
156. 如權(quán)利要求155所述的抗體，其中所述一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)位于所述一個(gè)或多個(gè) 接頭與所述非抗體序列之間。
157. 如權(quán)利要求155所述的抗體，其中所述一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)位于所述第一抗體序 列與所述一個(gè)或多個(gè)接頭之間。
158. 如權(quán)利要求155所述的抗體，其中所述一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)位于所述第二抗體序 列與所述一個(gè)或多個(gè)接頭之間。
159. -種抗體或其結(jié)合片段的文庫(kù)，其中該抗體或其結(jié)合片段包含超長(zhǎng)CDR3。
160. -種抗體或其結(jié)合片段的文庫(kù)，其中該抗體或其結(jié)合片段包含如權(quán)利要求 48-158中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合片段。
161. -種核酸文庫(kù)，其包含多個(gè)包含編碼抗體或其結(jié)合片段的序列的多核苷酸，其中 該抗體或其結(jié)合片段包含超長(zhǎng)CDR3。
162. -種核酸文庫(kù)，其包含多個(gè)包含編碼抗體或其結(jié)合片段的序列的多核苷酸，其中 該抗體或其結(jié)合片段包含如權(quán)利要求48-158中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合片段。
163. -種多核苷酸，其包含編碼可變區(qū)的核酸序列，其中該可變區(qū)包含超長(zhǎng)⑶R3。
164. -種包含多核苷酸的載體，其中該多核苷酸包含編碼可變區(qū)的核酸序列，其中該 可變區(qū)包含超長(zhǎng)⑶R3。
165. -種包含多核苷酸的宿主細(xì)胞，其中該多核苷酸包含編碼可變區(qū)的核酸序列，其 中該可變區(qū)包含超長(zhǎng)⑶R3。
166. -種多核苷酸，其包含編碼如權(quán)利要求48-158中任一項(xiàng)所述的抗體或其結(jié)合片 段的核酸序列。
167. -種包含多核苷酸的載體，其中該多核苷酸包含編碼如權(quán)利要求 [00144] -[00173]中任一項(xiàng)所述的抗體或其結(jié)合片段的核酸序列。
168. -種包含多核苷酸的宿主細(xì)胞，其中該多核苷酸包含編碼如權(quán)利要求48-158中 任一項(xiàng)所述的抗體或其結(jié)合片段的核酸序列。
169. -種產(chǎn)生包含超長(zhǎng)CDR3或其片段的抗體或其結(jié)合片段的方法，其包括在其中所 述多核苷酸序列得到表達(dá)并且所述包含超長(zhǎng)CDR3或其片段的抗體或其結(jié)合片段得以產(chǎn)生 的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求168的宿主細(xì)胞。
170. 如權(quán)利要求169所述的方法，其進(jìn)一步包括從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所述包含超 長(zhǎng)CDR3或其片段的抗體或其結(jié)合片段。
171. -種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求48-158中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段。
172. -種藥物組合物，其包含（a)包含基于或來(lái)源于超長(zhǎng)⑶R3的至少一部分的序列的 抗體或其片段；和（b)藥學(xué)上可接受的賦形劑。
173. 如權(quán)利要求172或173所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含治療劑。
174. 如權(quán)利要求172或173的藥物組合物，其中所述治療劑是抗體、小分子、有機(jī)化合 物、肽、蛋白質(zhì)。
175. -種治療有需要的受試者的疾病或病癥的方法，其包括向哺乳動(dòng)物施用治療有效 量的如權(quán)利要求48-158中任一項(xiàng)所述的抗體。
176. 如權(quán)利要求175所述的方法，其中所述抗體包含超長(zhǎng)CDR3序列和非抗體序列。
177. 如權(quán)利要求176所述的方法，其中所述非抗體序列選自Mokal、Vm24、GLP-l、毒蜥 外泌肽-4、β -干擾素、人EPO、人FGF21、人GMCSF、人干擾素-β、牛GCSF、人GCSF、IL8、齊 考諾肽、促生長(zhǎng)素抑制素、氯毒素 、SDFl ( α )、IL21、原毒素2以及它們的衍生物或變體。
178. 如權(quán)利要求175所述的方法，其中所述疾病或病癥選自：自身免疫性疾病、異種免 疫性疾病或病癥、炎性疾病、病原性感染、血栓栓塞性病癥、呼吸系統(tǒng)疾病或病癥、代謝病、 中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)病癥、骨病、癌癥、血液病癥、肥胖癥、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、貧血或疼 痛。
179. 如權(quán)利要求175所述的方法，其中所述疾病或病癥將受益于離子通道的調(diào)節(jié)。
180. 如權(quán)利要求179所述的方法，其中所述離子通道選自鉀離子通道、鈉離子通道或 酸敏感離子通道。
181. 如權(quán)利要求175所述的方法，其中所述離子通道選自KvL 3離子通道、NavL 7離 子通道和酸敏感離子通道（ASIC)。
182. 如權(quán)利要求175所述的方法，其中所述疾病或病癥將受益于受體的調(diào)節(jié)。
183. 如權(quán)利要求182所述的方法，其中所述受體選自GLPIR、GCGR、EPO受體、FGFR、 FGF21R、CSFR、GMCSFR、IL8R、IL21R 和 GCSFR。
184. 如權(quán)利要求175所述的方法，其中所述疾病或病癥是乳腺炎。
185. 如權(quán)利要求175所述的方法，其中所述受試者是哺乳動(dòng)物。
186. 如權(quán)利要求185所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是?；蛉?。
187. -種分離的晶體，其含有包含SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 23的?？贵wFab片段， 其中該晶體具有空間群a = 71. 4埃、b = 127. 6埃且c = 127. 9埃的晶胞尺寸。
188. -種分離的晶體，其含有包含SEQ ID NO: 340和SEQ ID NO: 341的牛抗體Fab片 段，其中該晶體具有空間群a = 54. 6埃、b = 53. 7埃且c = 330. 5埃的晶胞尺 寸。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK104520321SQ201380013323
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月9日
【發(fā)明者】奧馬爾·A·巴茲甘, 茅洪源, 沃恩·斯密德, 達(dá)米安·愛(ài)可爾特, P·舒爾茨, 峰·王, 伊恩·威爾森, 勇·張 申請(qǐng)人:斯克利普斯研究所, 奧馬爾·A·巴茲甘, 茅洪源