Her3結(jié)合多肽的制作方法
【專利說明】HER3結(jié)合多肽 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本公開內(nèi)容涉及與人類表皮生長因子受體3(本文中被稱為HER3)結(jié)合的多肽，并 且涉及此類多肽在成像和治療中的用途。
[0002] 背景
[0003]包括EGFR(ErbBl或HER1)、ErbB2 (HER2)、ErbB3 (ERBB3 或HER3)和ErbB4 (HER4) 的跨膜酪氨酸激酶受體中的表皮生長因子受體家族通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)參與 調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞功能（例如細(xì)胞增殖、存活、分化和迀移）。由于J1ER3的無活性的酪氨酸激酶 結(jié)構(gòu)域，J1ER3與該家族的其它受體不同，并因此通過配體引起的與其它酪氨酸激酶受體一 起形成的異源二聚體來傳遞信號(hào)（Guy等人，ProcNatlAcadSci91:8132-8136(1994); Sierke等人，BiochemJ322(Pt3):757-763(1997))。結(jié)果，該受體在腫瘤進(jìn)展中的意義 長期以來是個(gè)謎。但是，最近，ffiR3作為其家族成員的變構(gòu)的激酶激活劑已被感興趣。特 別地由HER2和HER3形成的異二聚體被稱為是下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常強(qiáng)烈的激活劑 (Jura等人，ProcNatlAcadSci106:21508-21613(2009);Citri等人，ExpCellRes 284:54-65(2003))。這種HER2-HER3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)甚至被認(rèn)為是在HER2驅(qū)動(dòng)的乳腺癌中的 致瘤單位（HolbroT等人，ProNatlAcadSci100:8933-8938(2003))。另外，HER3 受體 的上調(diào)已顯示在體外和體內(nèi)在過表達(dá)HER2的乳腺癌中對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的抵抗發(fā)揮重 要作用（Sergina等人，Nature445:437-441(2007) ;Kong等人，PLoSOne3:e2881 (2008); Garrett等人，ProcNatlAcadSci108:5021-5026(2011))。
[0004] 但是，在人類癌癥中HER3的重要性并不局限于HER2驅(qū)動(dòng)的乳腺癌。還顯示HER3 是HER3過表達(dá)的前列腺癌異種移植物的體內(nèi)致腫瘤性所需要的、通過自分泌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)回 路來維持卵巢癌的亞類的體內(nèi)增殖，并且參與ER+乳腺癌細(xì)胞系的內(nèi)分泌耐受，僅舉幾 個(gè)例子（Soler等人，IntJCancerl25:2565-2575(2009);ShengQ等人，CancerCell 17:412-412 (2010);Liu等人，IntJCancer120:1874-1882 (2007);Frogne等人&'east CancerResTreat114:263-275(2009))。總而言之，這些發(fā)現(xiàn)證明HER3信號(hào)通路作為在 人類癌癥中的重要的治療靶點(diǎn)的潛力。另外，HER3表達(dá)具有預(yù)后價(jià)值，因?yàn)楦咚降氖荏w表 達(dá)與過表達(dá)HER2的患者相比，與顯著地較短的存活時(shí)間有關(guān)（Tanner等人，JClinOncol 24 (26): 4317-23 (2006)，Reschke等人，ClinCancerRes14 (16): 5188-97 (2008))。
[0005]最近被批準(zhǔn)的針對(duì)EGFR和HER2受體的療法的相對(duì)大的比例基于單克隆抗體。與ErbB家族的被很好地研宄的EGFR和HER2受體成員形成對(duì)比，抗HER3抗體的用途有相對(duì)較 少的報(bào)道。Ullrich和合作者已報(bào)道抗HER3單克隆抗體在乳腺癌的細(xì)胞模型中抑制HER3 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（vanderHorst等人，IntJCancer115(4):519_27(2005))。但是，盡管 已報(bào)道了幾種利用全長單克隆抗體的成功的癌癥治療研宄，但是這類劑對(duì)于靶向?qū)嶓w腫瘤 (不是對(duì)于診斷也不是對(duì)于治療劑裝載目的）并不總是最佳的。治療效果取決于藥物遍及 腫瘤的有效分布，并且分子成像取決于在腫瘤吸收和周圍正常組織之間的高的比例。由于 腫瘤滲透率（包括溢出）與分子的大小負(fù)相關(guān)，相對(duì)較大的抗體分子（例如IgG)固有地具 有差的組織分布和滲透能力。而且，對(duì)于分子成像，抗體的異常地長的體內(nèi)半衰期導(dǎo)致相對(duì) 較高的血液信號(hào)以及從而相對(duì)較差的腫瘤-血液反差。
[0006] 最近，利用組合蛋白工程生成了源自來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的蛋白A的結(jié)構(gòu)域B的，基于Z結(jié)構(gòu)域的3-螺旋束支架的小的多的HER3特異的分 子（Kronqvist等人，ProteinEngDesSel24:385-396(2010) ;W02011/056124)。這些對(duì) HER3具有亞納摩爾級(jí)親和力的Z變體被證實(shí)在體外通過阻斷配體引起的HER3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具 有對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的抗增殖效應(yīng)（G6strillg等人，PLoSOne7:e40023(2012))。這些生長 抑制效應(yīng)被進(jìn)一步證實(shí)是在Z變體分子和配體調(diào)蛋白（heregulin)之間的競(jìng)爭(zhēng)性HER3結(jié) 合的結(jié)果。
[0007] 但是，由于該受體在腫瘤細(xì)胞中的相對(duì)低的表達(dá)，HER3受體的體內(nèi)靶向可能是 有挑戰(zhàn)的。已報(bào)道了每細(xì)胞1〇3至10 4個(gè)受體的典型表達(dá)水平（Aguilar等人，Oncogene 18:6050-6062(1999);Robinson等人，BrJCancer99:1415-1425 (2008))。除了高的腫瘤 吸收之外，在腫瘤中延長的保留時(shí)間對(duì)藥物的有效的治療效果是十分重要的。由于高的血 管通透性并快速地?cái)U(kuò)散至腫瘤，小的靶向劑諸如源自Z結(jié)構(gòu)域的多肽具有在腫瘤中以高水 平積累的能力（Schmidt和Wittrup,MolCancerTher8:2861-2871(2009))。但是，低分 子量的未結(jié)合蛋白將會(huì)被快速地從腫瘤清除并且然后通過腎從循環(huán)清除。結(jié)果，小尺寸靶 向劑對(duì)癌細(xì)胞的高親和力對(duì)于增加的腫瘤保留是十分重要的。而且，對(duì)于具有低表達(dá)（每 細(xì)胞1〇 4革巴蛋白或更少）的受體蛋白的有效靶向，最近的結(jié)果暗示小的多肽（例如源自Z 結(jié)構(gòu)域的多肽）的親和力應(yīng)該盡可能地高，優(yōu)選地具有以低皮摩爾級(jí)計(jì)或更小的結(jié)合常數(shù) KD(Tolmachev等人（2012)，JNuclMed53(6):953-60)。
[0008] 因?yàn)镠ER3可與EGF家族的其它成員在相同的腫瘤細(xì)胞上被表達(dá)，靶向HER3和EGF 家族的另一個(gè)成員的雙特異分子的制備最近已引起一些興趣。此類雙特異性分子可例如被 用作靶向載體用于在分子成像應(yīng)用中增加靶向的特異性以及同時(shí)地靶向HER3和在腫瘤上 表達(dá)的另一種抗原。
[0009] 發(fā)明描述
[0010] 本公開內(nèi)容的目的是提供一組新穎的HER3結(jié)合劑，其以高親和力結(jié)合HER3。
[0011] 本公開內(nèi)容的另一個(gè)目的是提供一組新穎的HER3結(jié)合劑，其例如可被用于靶向 HER3表達(dá)細(xì)胞、此類HER3表達(dá)細(xì)胞的分子成像和/或HER3相關(guān)狀況的治療。
[0012] 本公開內(nèi)容的另一個(gè)目的是提供一組經(jīng)限定的HER3結(jié)合劑，該組與以前在 W02011/056124中限定的HER3結(jié)合多肽的組不同。
[0013] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了HER3結(jié)合多肽，包含HER3結(jié)合基序（BM)，該基 序由選自以下的氨基酸序列組成：
[0014] i)EKYX4AYX7EIffXnLPNLTX17X18QX20AAFIGX26LX28D
[0015] 其中，彼此獨(dú)立地，
[0016] 父4選自六、￡、1、]\1、隊(duì)〇、1?、3和1';
[0017] X7選自F和Y;
[0018] Xn選自 E和Q;
[0019] X17選自 K、N、R和 V;
[0020] X18選自 F、M、N、R、T、Y和W;
[0021] X2Q選自 A和K;
[0022] X26選自K和S;
[0023] X28選自E和Q;以及
[0024] ii)與在i)中限定的序列具有至少96%同一性的氨基酸序列。
[0025] 以上關(guān)于HER3結(jié)合多肽的序列的類的限定是基于幾種新穎的多肽變體的序列的 分析，所述幾種新穎的多肽變體選自基于以前顯示展示J1ER3結(jié)合并在W02011/056124中公 開的序列而設(shè)計(jì)的文庫。這些多肽轉(zhuǎn)而是源自葡萄球菌蛋白A的結(jié)構(gòu)域之一的母本支架的 隨機(jī)變體。
[0026] 鑒定的HER3結(jié)合基序或"BM"對(duì)應(yīng)于母本支架的靶結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域構(gòu)成在三螺 旋束蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的兩個(gè)a螺旋。在母本支架中，兩個(gè)BM螺旋的變化的氨基酸殘基組成 用于與抗體的恒定的Fc部分相互作用的結(jié)合表面。通過結(jié)合表面殘基的隨機(jī)變異和隨后 的變體的選擇，結(jié)合表面的Fc相互作用能力最初地被與HER3相互作用的能力代替，如在 W02011/156124中所描述的。在導(dǎo)致本公開內(nèi)容的研宄中，生成了新的序列，其出乎意料地 顯示出例如與適合用于分子成像的親和力參數(shù)相關(guān)的優(yōu)越的性能。
[0027] 如技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的，諸如如本文限定的多肽的HER3結(jié)合能力的任何多肽的 功能取決于多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此對(duì)多肽的氨基酸序列進(jìn)行較小的改變而不大程度地影響 其三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能是可能的。
[0028] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽包括序列i)的BM的修飾的變體，其使得產(chǎn)生的序 列與屬于由序列i)限定的類的序列至少96%相同。在一些實(shí)施方案中，此類改變可在如本 文公開的HER3結(jié)合多肽的序列的所有位置進(jìn)行。在其它實(shí)施方案中，此類改變可僅在也被 稱為支架氨基酸殘基處的非可變位置進(jìn)行。在此類情況中，在可變位置即以"X"（例如以上 限定的BM的X4、X7、Xn、X17、X18、X2(l、\6和X28)表示的位置改變是不被允許的。例如，屬于 多個(gè)氨基酸殘基的某一功能分組（例如疏水性、親水性、極性等）中的氨基酸殘基可被取代 為來自相同功能組的另一個(gè)氨基酸殘基是可能的。
[0029] 可如以下計(jì)算如遍及說明書所使用的術(shù)語"％同一性"。利用CLUSTALW算法 (Thompson等人，NucleicAcidsResearch，22:4673_4680(1994))將查詢序列與革E序列比 對(duì)。在窗口中進(jìn)行對(duì)應(yīng)于最短的對(duì)齊序列的比較。在一些實(shí)例中最短的對(duì)齊序列可以是靶 序列。在其它實(shí)例中，查詢序列可構(gòu)成最短的對(duì)齊序列。在每一個(gè)位置的氨基酸殘基均被 比較，并且在查詢序列中具有靶序列中相同的對(duì)應(yīng)的位置的百分比被報(bào)告為％同一性。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供了如以上限定的HER3結(jié)合多肽，其中，在序列i)中， 彼此獨(dú)立地，
[0031] 父4選自六、已、]\1、隊(duì)〇、3和1';
[0032] X7選自F和Y;
[0033] Xn為Q;
[0034] X17選自K 和 R;
[0035] X18選自M、Y 和W;
[0036] X2(l為K;
[0037] 父26為K;
[0038] 父28為Q。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在序列1)中的乂4選自4、￡、11、隊(duì)〇、3和1'。在更特定的實(shí)施 方案中，在序列i)中的X4選自N和Q。在更加特定的實(shí)施方案中，在序列i)中的X4SN。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，在序列i)中的\為〇。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在序列i)中的XnSQ。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在序列i)中的X17選自K、N和R。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在序 列i)中的X17選自K和R。在更特定的實(shí)施方案中，在序列i)中的X17SK。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，在序列i)中的X17SR。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在序列i)中的X18選自M、Y和W。在更特定的實(shí)施方案中，在 序列i)中的X18選自Y和W。在更加特定的實(shí)施方案中，在序列i)中的X18SY。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，在序列i)中的X18SW。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在序列i)中的x18Sm。
[0043] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在序列i)中的X17X18選自KW、KY、KM和RY。
[0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在序列i)中的X2(l為K。
[0045] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在序列i)中的&6為1(。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在序列i)中的\8為〇。
[0047] 在一個(gè)實(shí)施方案中，序列i)符合以下四個(gè)條件I、II、III和IV中的至少兩個(gè)：
[0048] I)XnSQ;
[0049] II)X17X18選自KW、KY、KM和RY;
[0050] III)X2Q為K;
[0051] iv)x28Sq。
[0052] 在更特定的實(shí)施方案中，序列i)符合條件I、II、III和IV中的至少三個(gè)，諸如所 有四個(gè)。
[0053] 如在隨后的實(shí)驗(yàn)部分詳細(xì)描述的，HER3結(jié)合變體的選