本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌素是某些細(xì)菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的物質(zhì)，主要成分為小分子多肽、蛋白質(zhì)、酶、或蛋白質(zhì)復(fù)合物，最早是由jacob于1953年提出，后經(jīng)konisly進(jìn)一步補(bǔ)充完善。近年來，種類繁多的抗生素在食品工業(yè)、動物生產(chǎn)、醫(yī)療、畜禽飼料等方面廣泛使用的負(fù)面效應(yīng)日益突出，尋找新型抗生素得到了研究者的足夠重視，細(xì)菌素作為一種新型抗生素在抗菌方面，具有高效無毒、耐酸堿、耐高溫、無殘留、幾乎無抗藥性的特性，是極具潛力的傳統(tǒng)抗生素替代品。目前除了商業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)菌素nisin外、其它的細(xì)菌素還處在試驗(yàn)及臨床研究階段，其主要受限于細(xì)菌素的制備成本高，產(chǎn)量較低，產(chǎn)量不穩(wěn)定。上述問題在較大的程度限制了各類細(xì)菌素的鑒定及開發(fā)利用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法，用于高效生產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法，先獲取菌種，然后將獲取的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵獲得短短芽孢桿菌細(xì)菌素，根據(jù)菌體發(fā)酵開始后前6～18h的對數(shù)生長期和菌體發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束的穩(wěn)定期生長狀況按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整。
優(yōu)選的，所述獲取菌種具體為：將發(fā)酵菌種短短芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基中29～31℃培養(yǎng)12～16h得種子液。
優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)基包括葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀和tween-20，所述葡萄糖的質(zhì)量百分含量為0.5％，所述蛋白胨的質(zhì)量百分含量為1.2％、牛肉膏的質(zhì)量百分含量為0.65％，氯化鈉的質(zhì)量百分含量為0.4％，磷酸二氫鉀的質(zhì)量百分含量為0.14％、tween-20的質(zhì)量百分含量為0.1％，所述種子培養(yǎng)基的ph為7.2。
優(yōu)選的，所述發(fā)酵具體為：將產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素的菌種種子液按照體積比為2:25～3:50比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵。
優(yōu)選的，在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為29～31℃，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為27～29℃。
優(yōu)選的，在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為60％～80％，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為40％～60％。
優(yōu)選的，在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.3～7.5，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為6.8～7.2。
優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分含量包括馬鈴薯淀粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、吐溫-200.8％和吐溫-800.2％，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為6.8。
優(yōu)選的，所述菌種為bncc138469短短芽孢桿菌。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：
本發(fā)明通過對短短芽孢桿菌發(fā)酵過程菌種生長及產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素規(guī)律的的深入研究，提出了一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法，包括獲取菌種和短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵，其中，短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程為將培養(yǎng)14h后的菌種培養(yǎng)液按照體積比為2:25～3:50的比例接種到5l發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中制成發(fā)酵體系開始短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵；在短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程中按時(shí)間分段調(diào)控發(fā)酵體系的溫度、溶氧、以及ph，通過以上參數(shù)的調(diào)整可使發(fā)酵前期菌種能夠快速穩(wěn)定的生長，發(fā)酵中后期菌種能夠高效穩(wěn)定的產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素，降低其它副產(chǎn)物的生成。
進(jìn)一步的，本發(fā)明工藝菌種種子培養(yǎng)基的成分比如下：葡萄糖0.5％、蛋白胨1.2％、牛肉膏0.65％、氯化鈉0.4％、磷酸二氫鉀0.14％、tween-200.1％，在此營養(yǎng)成分比下，制備的發(fā)酵所用種子液中菌種的生長繁殖更快，菌種的活力達(dá)到最高。
進(jìn)一步的，本發(fā)明工藝根據(jù)產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素菌種的生長及產(chǎn)素規(guī)律，提出了分段控制發(fā)酵過程參數(shù)，有效的為菌種前期生長及后期產(chǎn)素提供了良好的條件，很大程度上提高了短短芽孢桿菌細(xì)菌素的生產(chǎn)水平，并且短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量穩(wěn)定，發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)配方主要原料廉價(jià)易得，節(jié)省成本，適合工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)。
進(jìn)一步的，本發(fā)明工藝菌種發(fā)酵培養(yǎng)基的成分比如下：馬鈴薯淀粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、tween-200.8％、tween-800.2％。在此營養(yǎng)成分比下，短短芽孢桿菌代謝分泌短短芽孢桿菌細(xì)菌素的活力更強(qiáng)，產(chǎn)量更高。
下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
附圖說明
圖1為采用本方法發(fā)酵對短短芽孢桿菌素抑菌活力的影響示意圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法，對短短芽孢桿菌的代謝規(guī)律進(jìn)行深入研究，根據(jù)不同營養(yǎng)調(diào)節(jié)因子對短短芽孢桿菌菌株產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素量的影響不同，對發(fā)酵營養(yǎng)配方進(jìn)行調(diào)整，同時(shí)根據(jù)菌體對數(shù)生長期和菌體穩(wěn)定期的生長狀況的不同，對發(fā)酵條件比如溫度、溶氧和發(fā)酵體系ph等按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整，達(dá)到提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的目的。
本發(fā)明提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法，包括獲取菌種以及將獲取的菌種接種到最適發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵獲得短短芽孢桿菌細(xì)菌素，在短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程中，在發(fā)酵開始后的前6～18h為菌種的菌體對數(shù)生長期，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期，根據(jù)菌體對數(shù)生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整。
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為29～31℃，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為27～29℃；
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為60％～80％，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為40％～60％；
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.3～7.5，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為6.8～7.2；
所述短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵方法具體步驟如下：
(1)獲取菌種：將發(fā)酵菌種短短芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)14h得種子液；
(2)將產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素的所述菌種種子液按照體積比為2:25～3:50比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵。
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為30℃，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為28℃。
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為70％，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為50％。
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.4，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.0。
所述種子培養(yǎng)基包括葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀和tween-20，所述葡萄糖的質(zhì)量百分含量為0.5％，所述蛋白胨的質(zhì)量百分含量為1.2％、牛肉膏的質(zhì)量百分含量為0.65％，氯化鈉的質(zhì)量百分含量為0.4％，磷酸二氫鉀的質(zhì)量百分含量為0.14％、tween-20的質(zhì)量百分含量為0.1％，所述種子培養(yǎng)基的ph為7.2。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分含量包括馬鈴薯淀粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、吐溫-200.8％和吐溫-800.2％，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為6.8。
所述菌種為短短芽孢桿菌(bncc138469)。
根據(jù)上述方法進(jìn)行短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵：
短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力測定
本發(fā)明涉及的細(xì)菌素活力測定為杯碟抑菌圈法測定：指示菌為金黃色葡萄球菌cicc21600，短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力表示方法(效價(jià)值au/ml)；將發(fā)酵上清液用ph6.8的tris-hcl緩沖液進(jìn)行二倍系列稀釋，取樣200μl進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以觀察不到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度定義為一個(gè)活力單位(1au)，其倒數(shù)即為原發(fā)酵液短短芽孢桿菌細(xì)菌素的效價(jià)值au/ml。
短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的測定
將發(fā)酵上清液(1l)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在0.1mpa，45℃的條件下濃縮至400ml，80％乙醇沉淀，透析除鹽24h，sephadexg-50凝膠純化，冷凍干燥20h，得粉末狀短短芽孢桿菌細(xì)菌素，稱其質(zhì)量。
實(shí)施例1
(1)菌種獲?。簩⒍潭萄挎邨U菌株接種于斜面，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后將斜面培養(yǎng)基上活化后的菌株制備成濃度為3×106個(gè)/ml。
菌懸液，按照2％的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中，于30℃，200rpm的搖床上震蕩培養(yǎng)。
(2)將培養(yǎng)14h后的種子液按照6％接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中(5l發(fā)酵罐裝液量3.6l)進(jìn)行培養(yǎng)，在短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程中，在發(fā)酵開始后的前6～18h為菌種的菌體對數(shù)生長期，在發(fā)酵開始后的18h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期，根據(jù)菌體對數(shù)生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整。
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為30℃，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為28℃；
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為70％，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為50％；
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.4，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.0；
發(fā)酵50h結(jié)束，采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力測定方法測定發(fā)酵液中短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力，得到短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力為814.08au/ml。同時(shí)采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的測定方法測得短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量為12.72g/l。
其中，發(fā)酵過程中采用1mol/l的hcl調(diào)節(jié)發(fā)酵液的ph。
短短芽孢桿菌細(xì)菌素最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分組成：馬鈴薯淀粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、吐溫-200.8％、吐溫-800.2％，初始ph為6.8。
實(shí)施例2
(1)菌種獲?。簩⒍潭萄挎邨U菌株接種于斜面，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后將斜面培養(yǎng)基上活化后的菌株制備成濃度為3×106個(gè)/ml。
菌懸液，按照2％的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中，于29℃，220rpm的搖床上震蕩培養(yǎng)。
(2)將培養(yǎng)12h后的種子液按照7％接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中(5l發(fā)酵罐裝液量3.6l)進(jìn)行培養(yǎng)，在短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程中，在發(fā)酵開始后的前6～18h為菌種的菌體對數(shù)生長期，在發(fā)酵開始后的18h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期，根據(jù)菌體對數(shù)生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整。
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為29℃，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為27℃；
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為60％，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為40％；
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.3，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為6.8；
發(fā)酵54h結(jié)束，采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力測定方法測定發(fā)酵液中短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力，得到短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力為726.4au/ml。同時(shí)采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的測定方法測得短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量為11.46g/l。
其中，發(fā)酵過程中采用1mol/l的hcl調(diào)節(jié)發(fā)酵液的ph。
短短芽孢桿菌細(xì)菌素最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分組成：馬鈴薯淀粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、吐溫-200.8％、吐溫-800.2％，初始ph為6.8。
實(shí)施例3
(1)菌種獲取：將短短芽孢桿菌株接種于斜面，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后將斜面培養(yǎng)基上活化后的菌株制備成濃度為3×106個(gè)/ml。
菌懸液，按照2％的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中，于31℃，180rpm的搖床上震蕩培養(yǎng)。
(2)將培養(yǎng)16h后的種子液按照8％接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中(5l發(fā)酵罐裝液量3.6l)進(jìn)行培養(yǎng)，在短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程中，在發(fā)酵開始后的前6～18h為菌種的菌體對數(shù)生長期，在發(fā)酵開始后的18h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期，根據(jù)菌體對數(shù)生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整。
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為31℃，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為29℃；
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為80％，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為60％；
在發(fā)酵開始后的前6～18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.5，發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.2；
發(fā)酵58h結(jié)束，采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力測定方法測定發(fā)酵液中短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力，得到短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力為747.6au/ml。同時(shí)采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的測定方法測得短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量為11.12g/l。
其中，發(fā)酵過程中采用1mol/l的hcl調(diào)節(jié)發(fā)酵液的ph。
短短芽孢桿菌細(xì)菌素最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分組成：馬鈴薯淀粉2％、豆餅粉3％、氯化鈣0.20％、磷酸氫二鉀0.025％、吐溫-200.8％、吐溫-800.2％，初始ph為6.8。
另外，請參閱圖1，為采用本工藝發(fā)酵對短短芽孢桿菌素抑菌活力的影響，其中，1未采用本工藝發(fā)酵抑菌直徑18.2mm，2為采用本工藝發(fā)酵抑菌直徑24.6mm，ck1為無菌水，ck2為空白發(fā)酵培養(yǎng)基，生產(chǎn)階段中對發(fā)酵過程不進(jìn)行控制以及對種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基成分組成不做調(diào)整作為空白實(shí)驗(yàn)，經(jīng)比較，采用本發(fā)明方法進(jìn)行實(shí)施案例1、2、3，即在不同發(fā)酵工藝條件下短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵，獲得的短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力及其產(chǎn)量與未采用本發(fā)明方法發(fā)酵獲得的短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力及其產(chǎn)量高低如下表1、2、3所示。采用本發(fā)明方法進(jìn)行實(shí)施案例1、2、3，短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力及其產(chǎn)量分別比未采用本發(fā)明方法提高了59％和48.9％、46.1％和38.7％、48.3％和36.1％。
根據(jù)實(shí)施例1得出下表
表1為是否采用本發(fā)明方法細(xì)菌素抑菌活力及產(chǎn)量的比較
根據(jù)實(shí)施例2得出下表
表2為是否采用本發(fā)明方法細(xì)菌素抑菌活力及產(chǎn)量的比較
根據(jù)實(shí)施例3得出下表
表3為是否采用本發(fā)明方法細(xì)菌素抑菌活力及產(chǎn)量的比較
表4為種子液制備培養(yǎng)基成分比改進(jìn)前后對菌體生長的影響
能夠得出在此營養(yǎng)成分比下，制備的發(fā)酵所用種子液中菌種的生長繁殖更快，菌種的活力達(dá)到最高。
表5為本發(fā)酵工藝所用發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分優(yōu)化前后對短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力及產(chǎn)量的影響(舊工藝下測定)
本發(fā)明中所用的短短芽孢桿菌(bncc138469)由北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司(bncc)購得。
以上內(nèi)容僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動，均落入本發(fā)明權(quán)利要求書的保護(hù)范圍之內(nèi)。