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一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法與流程

文檔序號:11246356閱讀:1164來源:國知局

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法。



背景技術(shù):

細(xì)菌素是某些細(xì)菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的物質(zhì),主要成分為小分子多肽、蛋白質(zhì)、酶、或蛋白質(zhì)復(fù)合物,最早是由jacob于1953年提出,后經(jīng)konisly進(jìn)一步補(bǔ)充完善。近年來,種類繁多的抗生素在食品工業(yè)、動物生產(chǎn)、醫(yī)療、畜禽飼料等方面廣泛使用的負(fù)面效應(yīng)日益突出,尋找新型抗生素得到了研究者的足夠重視,細(xì)菌素作為一種新型抗生素在抗菌方面,具有高效無毒、耐酸堿、耐高溫、無殘留、幾乎無抗藥性的特性,是極具潛力的傳統(tǒng)抗生素替代品。目前除了商業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)菌素nisin外、其它的細(xì)菌素還處在試驗(yàn)及臨床研究階段,其主要受限于細(xì)菌素的制備成本高,產(chǎn)量較低,產(chǎn)量不穩(wěn)定。上述問題在較大的程度限制了各類細(xì)菌素的鑒定及開發(fā)利用。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法,用于高效生產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:

一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法,先獲取菌種,然后將獲取的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵獲得短短芽孢桿菌細(xì)菌素,根據(jù)菌體發(fā)酵開始后前6~18h的對數(shù)生長期和菌體發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束的穩(wěn)定期生長狀況按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整。

優(yōu)選的,所述獲取菌種具體為:將發(fā)酵菌種短短芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基中29~31℃培養(yǎng)12~16h得種子液。

優(yōu)選的,所述種子培養(yǎng)基包括葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀和tween-20,所述葡萄糖的質(zhì)量百分含量為0.5%,所述蛋白胨的質(zhì)量百分含量為1.2%、牛肉膏的質(zhì)量百分含量為0.65%,氯化鈉的質(zhì)量百分含量為0.4%,磷酸二氫鉀的質(zhì)量百分含量為0.14%、tween-20的質(zhì)量百分含量為0.1%,所述種子培養(yǎng)基的ph為7.2。

優(yōu)選的,所述發(fā)酵具體為:將產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素的菌種種子液按照體積比為2:25~3:50比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵。

優(yōu)選的,在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為29~31℃,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為27~29℃。

優(yōu)選的,在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為60%~80%,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為40%~60%。

優(yōu)選的,在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.3~7.5,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為6.8~7.2。

優(yōu)選的,所述發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分含量包括馬鈴薯淀粉2%、豆餅粉3%、氯化鈣0.20%、磷酸氫二鉀0.025%、吐溫-200.8%和吐溫-800.2%,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為6.8。

優(yōu)選的,所述菌種為bncc138469短短芽孢桿菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明至少具有以下有益效果:

本發(fā)明通過對短短芽孢桿菌發(fā)酵過程菌種生長及產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素規(guī)律的的深入研究,提出了一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法,包括獲取菌種和短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵,其中,短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程為將培養(yǎng)14h后的菌種培養(yǎng)液按照體積比為2:25~3:50的比例接種到5l發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中制成發(fā)酵體系開始短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵;在短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程中按時(shí)間分段調(diào)控發(fā)酵體系的溫度、溶氧、以及ph,通過以上參數(shù)的調(diào)整可使發(fā)酵前期菌種能夠快速穩(wěn)定的生長,發(fā)酵中后期菌種能夠高效穩(wěn)定的產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素,降低其它副產(chǎn)物的生成。

進(jìn)一步的,本發(fā)明工藝菌種種子培養(yǎng)基的成分比如下:葡萄糖0.5%、蛋白胨1.2%、牛肉膏0.65%、氯化鈉0.4%、磷酸二氫鉀0.14%、tween-200.1%,在此營養(yǎng)成分比下,制備的發(fā)酵所用種子液中菌種的生長繁殖更快,菌種的活力達(dá)到最高。

進(jìn)一步的,本發(fā)明工藝根據(jù)產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素菌種的生長及產(chǎn)素規(guī)律,提出了分段控制發(fā)酵過程參數(shù),有效的為菌種前期生長及后期產(chǎn)素提供了良好的條件,很大程度上提高了短短芽孢桿菌細(xì)菌素的生產(chǎn)水平,并且短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量穩(wěn)定,發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)配方主要原料廉價(jià)易得,節(jié)省成本,適合工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)。

進(jìn)一步的,本發(fā)明工藝菌種發(fā)酵培養(yǎng)基的成分比如下:馬鈴薯淀粉2%、豆餅粉3%、氯化鈣0.20%、磷酸氫二鉀0.025%、tween-200.8%、tween-800.2%。在此營養(yǎng)成分比下,短短芽孢桿菌代謝分泌短短芽孢桿菌細(xì)菌素的活力更強(qiáng),產(chǎn)量更高。

下面通過附圖和實(shí)施例,對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

附圖說明

圖1為采用本方法發(fā)酵對短短芽孢桿菌素抑菌活力的影響示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法,對短短芽孢桿菌的代謝規(guī)律進(jìn)行深入研究,根據(jù)不同營養(yǎng)調(diào)節(jié)因子對短短芽孢桿菌菌株產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素量的影響不同,對發(fā)酵營養(yǎng)配方進(jìn)行調(diào)整,同時(shí)根據(jù)菌體對數(shù)生長期和菌體穩(wěn)定期的生長狀況的不同,對發(fā)酵條件比如溫度、溶氧和發(fā)酵體系ph等按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整,達(dá)到提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的目的。

本發(fā)明提高短短芽孢桿菌細(xì)菌素生產(chǎn)水平的發(fā)酵方法,包括獲取菌種以及將獲取的菌種接種到最適發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵獲得短短芽孢桿菌細(xì)菌素,在短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程中,在發(fā)酵開始后的前6~18h為菌種的菌體對數(shù)生長期,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期,根據(jù)菌體對數(shù)生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整。

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為29~31℃,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為27~29℃;

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為60%~80%,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為40%~60%;

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.3~7.5,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為6.8~7.2;

所述短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵方法具體步驟如下:

(1)獲取菌種:將發(fā)酵菌種短短芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)14h得種子液;

(2)將產(chǎn)短短芽孢桿菌細(xì)菌素的所述菌種種子液按照體積比為2:25~3:50比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵。

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為30℃,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為28℃。

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為70%,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為50%。

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.4,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.0。

所述種子培養(yǎng)基包括葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀和tween-20,所述葡萄糖的質(zhì)量百分含量為0.5%,所述蛋白胨的質(zhì)量百分含量為1.2%、牛肉膏的質(zhì)量百分含量為0.65%,氯化鈉的質(zhì)量百分含量為0.4%,磷酸二氫鉀的質(zhì)量百分含量為0.14%、tween-20的質(zhì)量百分含量為0.1%,所述種子培養(yǎng)基的ph為7.2。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分含量包括馬鈴薯淀粉2%、豆餅粉3%、氯化鈣0.20%、磷酸氫二鉀0.025%、吐溫-200.8%和吐溫-800.2%,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為6.8。

所述菌種為短短芽孢桿菌(bncc138469)。

根據(jù)上述方法進(jìn)行短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵:

短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力測定

本發(fā)明涉及的細(xì)菌素活力測定為杯碟抑菌圈法測定:指示菌為金黃色葡萄球菌cicc21600,短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力表示方法(效價(jià)值au/ml);將發(fā)酵上清液用ph6.8的tris-hcl緩沖液進(jìn)行二倍系列稀釋,取樣200μl進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),以觀察不到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度定義為一個(gè)活力單位(1au),其倒數(shù)即為原發(fā)酵液短短芽孢桿菌細(xì)菌素的效價(jià)值au/ml。

短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的測定

將發(fā)酵上清液(1l)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在0.1mpa,45℃的條件下濃縮至400ml,80%乙醇沉淀,透析除鹽24h,sephadexg-50凝膠純化,冷凍干燥20h,得粉末狀短短芽孢桿菌細(xì)菌素,稱其質(zhì)量。

實(shí)施例1

(1)菌種獲?。簩⒍潭萄挎邨U菌株接種于斜面,于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),然后將斜面培養(yǎng)基上活化后的菌株制備成濃度為3×106個(gè)/ml。

菌懸液,按照2%的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中,于30℃,200rpm的搖床上震蕩培養(yǎng)。

(2)將培養(yǎng)14h后的種子液按照6%接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中(5l發(fā)酵罐裝液量3.6l)進(jìn)行培養(yǎng),在短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程中,在發(fā)酵開始后的前6~18h為菌種的菌體對數(shù)生長期,在發(fā)酵開始后的18h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期,根據(jù)菌體對數(shù)生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整。

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為30℃,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為28℃;

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為70%,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為50%;

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.4,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.0;

發(fā)酵50h結(jié)束,采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力測定方法測定發(fā)酵液中短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力,得到短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力為814.08au/ml。同時(shí)采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的測定方法測得短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量為12.72g/l。

其中,發(fā)酵過程中采用1mol/l的hcl調(diào)節(jié)發(fā)酵液的ph。

短短芽孢桿菌細(xì)菌素最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分組成:馬鈴薯淀粉2%、豆餅粉3%、氯化鈣0.20%、磷酸氫二鉀0.025%、吐溫-200.8%、吐溫-800.2%,初始ph為6.8。

實(shí)施例2

(1)菌種獲?。簩⒍潭萄挎邨U菌株接種于斜面,于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),然后將斜面培養(yǎng)基上活化后的菌株制備成濃度為3×106個(gè)/ml。

菌懸液,按照2%的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中,于29℃,220rpm的搖床上震蕩培養(yǎng)。

(2)將培養(yǎng)12h后的種子液按照7%接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中(5l發(fā)酵罐裝液量3.6l)進(jìn)行培養(yǎng),在短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程中,在發(fā)酵開始后的前6~18h為菌種的菌體對數(shù)生長期,在發(fā)酵開始后的18h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期,根據(jù)菌體對數(shù)生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整。

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為29℃,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為27℃;

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為60%,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為40%;

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.3,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為6.8;

發(fā)酵54h結(jié)束,采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力測定方法測定發(fā)酵液中短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力,得到短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力為726.4au/ml。同時(shí)采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的測定方法測得短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量為11.46g/l。

其中,發(fā)酵過程中采用1mol/l的hcl調(diào)節(jié)發(fā)酵液的ph。

短短芽孢桿菌細(xì)菌素最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分組成:馬鈴薯淀粉2%、豆餅粉3%、氯化鈣0.20%、磷酸氫二鉀0.025%、吐溫-200.8%、吐溫-800.2%,初始ph為6.8。

實(shí)施例3

(1)菌種獲取:將短短芽孢桿菌株接種于斜面,于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),然后將斜面培養(yǎng)基上活化后的菌株制備成濃度為3×106個(gè)/ml。

菌懸液,按照2%的接種量接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中,于31℃,180rpm的搖床上震蕩培養(yǎng)。

(2)將培養(yǎng)16h后的種子液按照8%接種量接種至新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中(5l發(fā)酵罐裝液量3.6l)進(jìn)行培養(yǎng),在短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵過程中,在發(fā)酵開始后的前6~18h為菌種的菌體對數(shù)生長期,在發(fā)酵開始后的18h直至發(fā)酵結(jié)束為菌種的菌體穩(wěn)定期,根據(jù)菌體對數(shù)生長期和菌體穩(wěn)定期生長狀況的不同對發(fā)酵條件按照發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行分段調(diào)整。

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系溫度調(diào)整為31℃,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溫度調(diào)為29℃;

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系中溶氧調(diào)高為80%,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系溶氧調(diào)低為60%;

在發(fā)酵開始后的前6~18h內(nèi)發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.5,發(fā)酵開始18h后至發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵體系ph調(diào)整為7.2;

發(fā)酵58h結(jié)束,采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力測定方法測定發(fā)酵液中短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力,得到短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力為747.6au/ml。同時(shí)采用短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量的測定方法測得短短芽孢桿菌細(xì)菌素產(chǎn)量為11.12g/l。

其中,發(fā)酵過程中采用1mol/l的hcl調(diào)節(jié)發(fā)酵液的ph。

短短芽孢桿菌細(xì)菌素最適發(fā)酵培養(yǎng)基成分組成:馬鈴薯淀粉2%、豆餅粉3%、氯化鈣0.20%、磷酸氫二鉀0.025%、吐溫-200.8%、吐溫-800.2%,初始ph為6.8。

另外,請參閱圖1,為采用本工藝發(fā)酵對短短芽孢桿菌素抑菌活力的影響,其中,1未采用本工藝發(fā)酵抑菌直徑18.2mm,2為采用本工藝發(fā)酵抑菌直徑24.6mm,ck1為無菌水,ck2為空白發(fā)酵培養(yǎng)基,生產(chǎn)階段中對發(fā)酵過程不進(jìn)行控制以及對種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基成分組成不做調(diào)整作為空白實(shí)驗(yàn),經(jīng)比較,采用本發(fā)明方法進(jìn)行實(shí)施案例1、2、3,即在不同發(fā)酵工藝條件下短短芽孢桿菌細(xì)菌素發(fā)酵,獲得的短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力及其產(chǎn)量與未采用本發(fā)明方法發(fā)酵獲得的短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力及其產(chǎn)量高低如下表1、2、3所示。采用本發(fā)明方法進(jìn)行實(shí)施案例1、2、3,短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力及其產(chǎn)量分別比未采用本發(fā)明方法提高了59%和48.9%、46.1%和38.7%、48.3%和36.1%。

根據(jù)實(shí)施例1得出下表

表1為是否采用本發(fā)明方法細(xì)菌素抑菌活力及產(chǎn)量的比較

根據(jù)實(shí)施例2得出下表

表2為是否采用本發(fā)明方法細(xì)菌素抑菌活力及產(chǎn)量的比較

根據(jù)實(shí)施例3得出下表

表3為是否采用本發(fā)明方法細(xì)菌素抑菌活力及產(chǎn)量的比較

表4為種子液制備培養(yǎng)基成分比改進(jìn)前后對菌體生長的影響

能夠得出在此營養(yǎng)成分比下,制備的發(fā)酵所用種子液中菌種的生長繁殖更快,菌種的活力達(dá)到最高。

表5為本發(fā)酵工藝所用發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分優(yōu)化前后對短短芽孢桿菌細(xì)菌素抑菌活力及產(chǎn)量的影響(舊工藝下測定)

本發(fā)明中所用的短短芽孢桿菌(bncc138469)由北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司(bncc)購得。

以上內(nèi)容僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想,不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍,凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想,在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動,均落入本發(fā)明權(quán)利要求書的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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