本發(fā)明屬于涉及醫(yī)藥技術領域，更具體地講，涉及魷魚膠原多肽及其鐵絡合物的制備方法和應用。

背景技術：

魷魚(Loligo chinensis)為軟體動物門槍烏賊屬海洋生物。廣泛分布于我國的南海和東南亞海域。其營養(yǎng)豐富，蛋白質含量高，可加工為多種美味食品。魷魚加工過程中，除去外皮，魷魚皮往往作為廢棄物。國內外研究發(fā)現(xiàn)，魚類加工過程中廢棄物占總量的30％左右，其中含有豐富的蛋白質資源，以膠原蛋白為主，其水解產物含有多種活性肽?；钚噪挠锌鼓[瘤、抗?jié)?、降血壓、促進骨形成、促進皮膚代謝和增強免疫等生理和藥理活性。在醫(yī)藥、保健及美容化妝方面具有良好的應用前景。對魚類下腳料膠原蛋白的研究在國內開展不多，往往作為廢棄物處理，造成生物資源浪費和環(huán)境污染。我國膠原產品通常從屠宰動物的廢料中制取，水產動物中的膠原蛋白肽的利用一直是空白。利用現(xiàn)代生物技術提取膠原蛋白多肽，提高生物活性，進一步開發(fā)醫(yī)藥、保健及美容化妝品的原料，國內外目前未見有過報道。將海產魚類下腳料提取膠原蛋白并制備新的活性膠原多肽，進行結構修飾，既能滿足各行業(yè)對膠原蛋白多肽的需求，又能提升水產品的附加值并使廢棄物再利用，保護環(huán)境，對水產業(yè)發(fā)展提供廣闊的前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供魷魚膠原多肽的制備方法。

本發(fā)明的第二個目的在于提供魷魚膠原多肽鐵絡合物的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的在于提供魷魚膠原多肽好和魷魚膠原多肽鐵絡合物。

本發(fā)明的第四個目的在于提供魷魚膠原多肽及其鐵絡合物的應用。

為實現(xiàn)本發(fā)明第一個目的，本發(fā)明公開以下技術方案：魷魚膠原多肽的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

(1)取新鮮魷魚皮絞碎置高壓反應鍋內，加入質量百分比為2-10％的醋酸水溶液，邊加邊攪拌，攪拌均勻后蒸汽加熱，溫度控制在110-130℃，水解1-3小時后立即停止加熱，讓其自然降溫至105℃以下；

(2)緩慢開啟放氣閥，打開加料口加入活性炭，90～100℃保溫20-60分鐘，然后離心，離心液濃縮至1/3—1/5重量得到濃縮液1；

(3)步驟(2)獲得的濃縮液1冷卻到室溫后，加入3-5倍重量的乙醇，邊加邊攪拌，讓其沉淀過夜，沉淀液離心，濾液再壓濾，濾液回收乙醇并濃縮至1/9—1/11重量得到濃縮液2，將濃縮液2噴霧干燥，得橙黃色疏松固體即為魷魚膠原多肽(SP-1)。經質譜分析，含有20余種肽類成分。

作為一個優(yōu)選方案，步驟(1)水解1小時。

為實現(xiàn)本發(fā)明第二個目的，本發(fā)明公開以下技術方案：魷魚膠原多肽鐵絡合物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

(1)將上述魷魚膠原多肽溶于蒸餾水中，磁力攪拌下緩慢地加入重量百分比2.8％硫酸亞鐵水溶液，室溫反應3h-4h；

(2)反應液過濾后，向濾液中加入3-5倍重量的乙醇進行沉淀，2h后抽濾，無水乙醇洗滌，濾渣于室溫真空干燥除乙醇，干燥物復用蒸餾水溶解，冷凍干燥，得棕黃色鱗片疏松物即為魷魚膠原多肽鐵絡合物(SP-F)。得率為47.2％。

為實現(xiàn)本發(fā)明第三個目的，本發(fā)明公開以下技術方案：利用上述魷魚膠原多肽的制備方法制備獲得的魷魚膠原多肽，以及，利用上述魷魚膠原多肽鐵絡合物的制備方法制備獲得的魷魚膠原多肽鐵絡合物。

為實現(xiàn)本發(fā)明第四個目的，本發(fā)明公開以下技術方案：的魷魚膠原多肽在制備耐缺氧藥物或耐缺氧食品中的應用，以及，魷魚膠原多肽鐵絡合物在制備耐缺氧藥物或耐缺氧食品中的應用。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：本方法較之傳統(tǒng)的硫酸和鹽酸水解法，具有反應條件穩(wěn)定，易于控制，無污染物排放，符合清潔化生產。本發(fā)明從魷魚下腳料魚皮等海產魚類下腳料中提取膠原蛋白并制備新的活性膠原多肽，進行結構修飾，既能滿足各行業(yè)對膠原蛋白多肽的需求，又能提升水產品的附加值并使廢棄物再利用，保護環(huán)境，對水產業(yè)發(fā)展提供廣闊的前景。動物實驗表明，魷魚膠原多肽(SP-1)及其鐵絡合物(SP-F)可顯著提高耐缺氧存活時間；增加體內乳酸脫氫酶活性；減少體內血乳酸和血尿素氮的含量。本發(fā)明制備的SP-1和SP-F可顯著提高耐缺氧活性，可用于制備耐缺氧藥物及功能食品，對開發(fā)利用中國的海洋藥用生物資源具有重要意義。

附圖說明

圖1為耐缺氧存活時間。

圖2為乳酸脫氫酶活性。

圖3為血乳酸含量。

圖4為血尿素氮檢測。

圖5質譜測定結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1.魷魚皮膠原多肽的制備

新鮮魷魚皮200Kg，用絞肉機絞碎。絞碎的魷魚皮置高壓反應鍋內。加入1200L的3％醋酸水(即水1160L，冰醋酸36Kg或72瓶500ml的冰醋酸混合而成)，邊加邊攪拌，直到加完為止。醋酸水加完并攪拌均勻后，開始加熱，溫度控制在121℃，水解1小時后，立即停止加熱，讓其自然降溫至～105℃，然后緩慢開啟放氣閥，打開加料口，加入2.5Kg活性炭，90～100℃保溫20分鐘。然后離心，離心液濃縮至300L左右。濃縮液冷卻到室溫后，加入3倍量(V/V)95％乙醇，邊加邊攪，讓其沉淀過夜。沉淀液離心，濾液再壓濾。濾液回收乙醇并濃縮至200L左右，濃縮液再噴霧干燥，得橙黃色疏松固體(魷魚膠原多肽)4.5公斤。

質譜測定結果：采用直接進樣法，膠原總多肽經質譜負離子譜和正離子譜測定，膠原總多肽在分子量170-1334.5的范圍內，含有20余種寡肽類成分。質譜分析見圖5。

實施例2.魷魚皮膠原多肽的制備

新鮮魷魚皮100Kg，用絞肉機絞碎。絞碎的魷魚皮置高壓反應鍋內。加入600L的8％醋酸水(即水580L，冰醋酸18Kg混合而成)，邊加邊攪拌，直到加完為止。醋酸水加完并攪拌均勻后，開始加熱，溫度控制在110℃，水解1小時后，立即停止加熱，讓其自然降溫至～105℃，然后緩慢開啟放氣閥，打開加料口，加入1Kg活性炭，90～100℃保溫20分鐘。然后離心，離心液濃縮至150L左右。濃縮液冷卻到室溫后，加入3倍量(V/V)95％乙醇，邊加邊攪，讓其沉淀過夜。沉淀液離心，濾液再壓濾。濾液回收乙醇并濃縮至200L左右，濃縮液再噴霧干燥，得橙黃色疏松固體(魷魚膠原多肽)2.3公斤。

實施例3.魷魚膠原多肽鐵絡合物的制備

將魷魚皮水解肽30.00g溶于120mL的蒸餾水中，加入2.8％硫酸亞鐵溶于30mL。在磁力攪拌下，將硫酸亞鐵溶液緩慢地加入魷魚皮水解肽溶液中，室溫反應3h。反應液用脫脂棉過濾后，向濾液中加入3倍量的95％乙醇，進行沉淀。抽濾，無水乙醇洗滌兩次，濾渣于室溫真空干燥(除乙醇)。復用420mL蒸餾水溶解，冷凍干燥，得魷魚皮水解肽亞鐵鹽(棕黃色鱗片疏松物)。得率為47.8％。

實施例4.魷魚膠原多肽鐵絡合物的制備

將魷魚皮水解肽100.00g溶于400mL的蒸餾水中，加入2.8％硫酸亞鐵100mL。在磁力攪拌下，將硫酸亞鐵溶液緩慢地加入魷魚皮水解肽溶液中，室溫反應3h。反應液用脫脂棉過濾后，向濾液中加入3倍量的95％乙醇，進行沉淀。抽濾，無水乙醇洗滌兩次，濾渣于室溫真空干燥(除乙醇)。復用1400mL蒸餾水溶解，冷凍干燥，得魷魚皮水解肽亞鐵鹽(棕黃色鱗片疏松物)。得率為48.1％。

實施例5.魷魚多肽耐缺氧動物試驗

1.研究材料

1.1實驗動物：昆明小鼠，雄性，6-8周齡，18-22g，每組8只，高濃度組9只。

1.2試劑和藥物：血乳酸試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒和血尿素氮試劑盒(由南京建成公司提供)；維拉帕米(由天津市中央藥業(yè)有限公司提供)，受試樣品SP-1(魷魚膠原多肽)和SP-F(魷魚膠原多肽鐵絡合物)由第二軍醫(yī)大學易楊華教授課題組制備。

1.3實驗儀器：酶標儀，離心機。

2.實驗方法

小鼠隨機分為8組，對照組：兩個受試樣品SP-F和SP-1，分設：50mg/kg,100mg/kg，200mg/kg3個劑量組，耐缺氧實驗陽性藥物(維拉帕米)和生理鹽水對照組。每天灌胃給藥，維拉帕米注射給藥，共21天。末次給藥1h后，小鼠逐只放入盛有20g鈉石灰的125ml廣口瓶中，石蠟密閉瓶口，記錄小鼠存活時間。

小鼠死亡后立即心臟取血，按照試劑盒說明，進行血尿素氮、血乳酸含量和乳酸脫氫酶活性檢測。

實驗數(shù)據采用SPSS 13.0軟件處理

3.實驗結果

表3.1各組動物存活情況

表3.2耐缺氧存活時間(s)

表3.3乳酸脫氫酶活性

表3.4血乳酸含量

表3.5血尿素氮檢測

表3.6臟器指數(shù)(mg/g)

表3.7體重監(jiān)測

以上實驗結果表明，實驗過程中，小鼠的存活率、體重和各臟器指數(shù)均未見明顯改變；耐缺氧存活時間：SP-1的50mg/kg和100mg/kg劑量組以及SP-F的100mg/kg劑量組比生理鹽水組顯著延長；乳酸脫氫酶活性：SP-1的100mg/kg劑量組顯著增加；血乳酸含量：SP-1的50mg/kg和100mg/kg劑量組以及SP-F的50mg/kg和100mg/kg劑量組比生理鹽水組顯著減少；血尿素氮含量:SP-1的50mg/kg劑量和SP-F的200mg/kg劑量組比生理鹽水組顯著減少。實驗結果顯示SP-1和SP-F均有明顯的耐缺氧活性，可用于制備耐缺氧藥物及功能食品。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。