針對互補作用質(zhì)量性狀基因的分子標記篩選方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因的分子標記篩選領域，具體涉及一種針對由互補作用控制的質(zhì)量性狀的基因的分子標記篩選方法。
【背景技術】
[0002]在現(xiàn)在的生物技術研宄領域，基因定位是基因克隆以及進一步深入研宄基因的產(chǎn)物、功能、作用通路、作用機理及應用的基礎，目標基因連鎖的分子標記的篩選是基因定位的關鍵。隨著生物技術的發(fā)展，利用SNP芯片技術并結(jié)合以集團分離分析法(BSA)為基礎的多種分子標記對質(zhì)量性狀對應的單基因的分子標記的篩選已經(jīng)相對比較容易。
[0003]在基因連鎖的分子標記的篩選中，現(xiàn)在廣泛使用的集團分離分析法(BSA)首先從一對具有目標基因的表型差異的親本所產(chǎn)生的任何一種分離群體中，根據(jù)目標基因的表型分別選取一定數(shù)量的植株，構(gòu)成2個亞群或集團。將每群的DNA等量混合，形成兩個針對所研宄的相對性狀的“基因池”(gene pool)，然后用合適的分子標記對兩個基因池進行分析，在兩群間表現(xiàn)多態(tài)性的分子標記遺傳上與目標性狀基因座位相連鎖。在獲得了與目標基因相連鎖的分子標記以后，可以利用某一作圖群體進行分析以便進一步檢測所得分子標記與目標性狀基因的連鎖程度，以及其在某已知分子圖譜中或染色體上的位置，這樣就完成了真正意義上的對基因的標記定位。此方法由于建池時使用了特定的分離群體，并且在分組時僅對目標性狀進行選擇，這樣可以保證其他性狀的遺傳背景基本相同，兩個基因池之間理論上就應主要在目標基因區(qū)段存在差異，此方法得以實現(xiàn)的關鍵即在于此。
[0004]但是，生物的質(zhì)量性狀除了能夠有效建池的單基因決定的質(zhì)量性狀外，值得注意的是還有通過不能夠輕易有效建池的兩對或多對基因互補產(chǎn)生的質(zhì)量性狀。研宄基因互補產(chǎn)生的質(zhì)量性狀時，因為互為相對性狀的兩個群體之內(nèi)的某一個特定基因不是完全一致的(不是或均為顯性或均為隱性)，所以不能有效地針對其中的某一個基因有針對性地構(gòu)建“陰、陽基因池”，所以不能簡單有效地利用以集團分離分析法(BSA)為基礎的分子標記進行目的基因的定位，這將嚴重制約之后的系列研宄或應用。
[0005]現(xiàn)有的集團分離分析法(BSA)僅對能夠形成兩個針對性“基因池”(gene pool)的相對性狀的基因連鎖的分子標記的篩選有效，對于不能有效構(gòu)建“陰、陽基因池”的二或多對基因互補產(chǎn)生的質(zhì)量性狀的基因的分子標記篩選則無效。而本方法不僅對能夠構(gòu)建“基因池”(gene pool)的相對性狀的基因的分子標記篩選有效，且能夠?qū)τ诓荒苡行?gòu)建“陰、陽基因池”的二或多對基因互補產(chǎn)生的質(zhì)量性狀的基因的分子標記篩選仍然有效，且能夠分別篩選出互補的各個基因的相關分子標記。
[0006]集團分離分析法(BSA)的關鍵在于建池時使用了特定的分離群體，并且在分組時僅對目標性狀進行選擇，保證了其他性狀的遺傳背景基本相同，兩個基因池之間理論上就應僅存在目標基因區(qū)段的差異，一旦一個性狀對應的基因池混入另一個對應相對性狀的DNA，則導致兩個基因池之間針對主要在目標基因區(qū)段存在的差異不明顯或喪失，從而導致不能有效地對目標基因的分子標記進行篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對不能有效構(gòu)建“陰、陽基因池”的由二或多對基因互補控制質(zhì)量性狀的基因的標記篩選難題，本發(fā)明提供了一種針對由互補作用控制的質(zhì)量性狀的基因的分子標記篩選方法，結(jié)合SSR等分子標記使用本方法，使此類性狀基因的標記篩選變得相對簡單易行。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為:
[0009]針對互補作用質(zhì)量性狀基因的分子標記篩選方法，包括如下步驟:
[0010]S1、構(gòu)建3個初篩模板(2親本I對照)，按照相應引物的退火溫度做SSR-PCR，然后把PCR產(chǎn)物做聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，按照同一個引物的3個不模板為一組，以不同引物不同組的先后順序點樣，然后分析每一組即相同引物的3個樣品之間的帶型差異，進而篩選出在兩親本間有差異的SSR引物，以便進一步篩選驗證；
[0011]S2、構(gòu)建16個樣品小群體(2個親本I個對照13個F2顯性性狀樣本)，并以此為模板做SSR-PCR，然后用PCR產(chǎn)物做聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，分析同一引物對應的樣本組內(nèi)目的條帶的差異，選取符合在此群體中約定規(guī)律的引物作為疑似標記進入下一輪篩選;
[0012]S3、構(gòu)建38個樣品小群體(2個親本I個對照35個F2顯性性狀樣本)，并以此為模板進行SSR-PCR，然后用PCR產(chǎn)物做聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析同一引物對應的樣本組內(nèi)目的條帶的差異，選取符合在此群體中約定規(guī)律的引物作為疑似標記進入下一輪篩選;
[0013]S4、構(gòu)建24個樣品小群體(2個親本I個對照21個F2隱性性狀樣本)，并以此為模板進行SSR-PCR，然后用PCR產(chǎn)物做聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，分析同一引物對應的樣本組內(nèi)目的條帶的差異，以兩對基因顯性互補為例，理論上對隱性性狀群體而言，任何一對基因顯性帶型:隱性帶型=3: 4，考慮到采樣時的誤差、此樣本數(shù)較小等多種因素的影響，又因為此步驟只是作為輔證，顯隱性帶型的分離比在隱性性狀群體中和在顯性性狀群體中具有顯著差異即可，所以保留在21個隱性性狀群體中，有不少于5個且小于15個隱性帶型的引物，然后準備進一步用擴大了的顯性性狀群體驗證，此步是以隱性性狀樣本作為對照，用來從反面輔證S2、S3中所篩選出引物的可靠性；
[0014]S5、初步確定目標基因所在染色體，集中篩選預備標記；
[0015]S6、對另外互補的基因利用上述方法進行篩選；
[0016]S7、群體驗證篩出的互補作用的基因的分子標記，，定位出基因并作出遺傳圖譜。
[0017]其中，所述步驟SI中初篩模板的構(gòu)建方法為:以兩個親本分別建池后的基因池DNA樣品作為待研宄相對性狀的樣品，另外再選取一個與兩個親本沒有共同遺傳背景的品種或品系，建立基因池，取其作為對照DNA樣品，這樣即構(gòu)建成立3個樣品組成的親本初篩模板，以兩對基因互補為例，那么這個互補產(chǎn)生的性狀的顯性基因每個親本分別一個。
[0018]其中，所述步驟S2中選取在13個F2樣本之中主要目的條帶只有< 2個與具有隱性條帶親本的條帶一致，其余至少11個樣品的主要目的條帶均保持與具有顯性條帶的親本一致或具有雜合條帶的引物作為疑似標記。
[0019]其中，所述步驟S3中選取在35個F2樣本之中主要目的條帶只有< 3個有差異(與具有隱性條帶親本的條帶一致)，其余至少32個樣品的目的條帶均保持一致(與具有顯性條帶的親本一致或具有雜合條帶)，即在包括復篩13個F2樣品在內(nèi)的48個F2樣品中只有<5個樣品有差異目的條帶(與具有隱性條帶親本的條帶一致)的引物作為疑似標記。
[0020]其中，所述步驟S5的具體方法為:分析上述S1-S4步篩出的SSR標記，有多個標記集中在同一染色體上，初步斷定此染色體為目標基因所在的染色體，然后集中篩選此染色體上對應的SSR標記，選出足夠多的標記以便之后上群體驗證并作圖。
[0021]其中，所述步驟S6中對另外互補的基因進行初步篩選的方法為:以一對一對基因依次重復步驟S1-S5。
[0022]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0023]對不能有效構(gòu)建“陰、陽基因池”的二或多對基因互補產(chǎn)生的質(zhì)量性狀的基因的分子標記篩選的難題，以一種相對簡單有效的方式提出了解決辦法，結(jié)合SSR等分子標記使用本方法，使此類性狀的基因的分子標記篩選變得相對簡單易行。
【附圖說明】
[0024]圖1為步驟SI中的參考PAGE膠圖；
[0025]圖中:1-4組分別表示4種不同引物樣本；同一組內(nèi)，從左到右模板順序依次為親本1、親本2和對照樣本。
[0026]圖2為步驟S2中的參考PAGE膠圖；
[0027]圖中:a、b、c分別表示顯性條帶親本、隱性條帶親本、對照樣本；1_13分別表示F2小群體的樣本；
[0028]其中只有標記為12的樣本的條帶與隱性條帶親本一致，為異常條帶樣本。
[0029]圖3為步驟S3中的參考PAGE膠圖。
[0030]圖中:左側(cè)橫線標出的a、b、c分別表示顯性條帶親本、隱性條帶親本、對照樣本；后面為F2代顯性性狀群體，其中1-4標出的樣本條帶與隱性條帶樣本的條帶一致，為異常條帶；其余條帶或者與顯性條帶樣本的條帶一致或者為雜合條帶。
[0031 ] 圖4為步驟S4中參考PAGE膠圖；
[0032]圖中:左側(cè)橫線標出的a、b、c分別表示顯性條帶親本、隱性條帶親本、對照樣本；后面21個F2代隱性性狀群體中有標記為1-8的8個樣本的條帶與隱性條帶親本的條帶一致，其余樣本的條帶或者與顯性條帶樣本的條帶一致或者為雜合條帶總樣本數(shù)為13，隱性條帶樣本數(shù)介于5和15之間。
[0033]圖5為本發(fā)明實施例針對互補作用質(zhì)量性狀基因的分子標記篩選方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0034]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0035]本具體實施還包括實驗前期基礎，具體為:
[0036]I)研宄性狀的發(fā)現(xiàn)
[0037]發(fā)現(xiàn)感興趣或?qū)ιa(chǎn)研宄有用的性狀后，通過至少兩年多點多次連續(xù)的性狀調(diào)查，確定性狀的可靠性。
[0038]2)針對性設計實驗，普通遺傳分析，確定遺傳方式。
[0039]根據(jù)親本及Fl、F2代的表現(xiàn)型，設計雜交、回交、測交實驗，根據(jù)需要調(diào)查其對應FU F2代的分離比，以此作為普通遺傳分析的基礎，進而確定遺傳方式，為二或多對基因互補作用產(chǎn)生則使用此方法，其他遺傳方式根據(jù)具體情況再另行分析，以下是以二或多對基因互補作用為實驗前提。