基于fshr基因的豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其檢測方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物分子育種領(lǐng)域，尤其涉及一種基于FSHR基因的豬繁殖性狀相關(guān) 的分子標(biāo)記及其檢測方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子標(biāo)記輔助選擇是基因工程在現(xiàn)代家畜育種中的一項重要應(yīng)用，利用與育種性 狀相關(guān)的各種標(biāo)記代替以表型為基礎(chǔ)的選擇，從分子水平上分析個體的遺傳組成，從而實 現(xiàn)對基因型的直接選擇，可克服直接選擇的弊端，提高選擇的準(zhǔn)確性和縮短世代間隔。
[0003] 總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)等豬的繁殖性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，直接關(guān)系到養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng) 濟(jì)效益。
[0004] 促卵泡素（FSH)是由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，在卵巢卵泡的 生長、發(fā)育、分化、成熟和排卵過程中起重要作用。由于FSH是一種生物大分子，不能透過細(xì) 胞膜，只有通過位于靶細(xì)胞膜上促卵泡素受體（FSHR)的介導(dǎo)，將信息傳遞到靶細(xì)胞膜內(nèi)， 從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。FSHR基因的多態(tài)性研究報道主要集中在人、牛、綿羊、山羊上，目前 未見FSHR基因與豬繁殖性狀之間關(guān)系的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種基于FSHR基因的豬繁殖 性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。本發(fā)明還提供了該分子標(biāo)記的檢測方法和應(yīng)用。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明所述的基于FSHR基因的豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，它為豬FSHR基因片 段，所述的豬FSHR基因片段含有多態(tài)性位點，所述的多態(tài)性位點為如SEQ ID NO. 1所示序 列中第1166位，所述的多態(tài)性位點具有C/T堿基的變異。
[0008] 序列表中SEQ ID NO. 1所示的序列為豬FSHR mRNA序列，其第1166位為多態(tài)性位 點，與豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)緊密相關(guān)，可利用該位點開發(fā)與豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。
[0009] 本發(fā)明所述的豬FSHR基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示；或所述的豬 FSHR基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。當(dāng)然，本發(fā)明所述的豬FSHR基因片段也 可以為包含如SEQIDNO. 2所示核苷酸序列的DNA片段。根據(jù)檢測方法，可以選擇合適長 度的能夠包含多態(tài)性位點的DNA片段。
[0010] 本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記的檢測方法，包括：
[0011] (1)根據(jù)所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計引物；
[0012] (2)以待檢測豬的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0013] (3)判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中多態(tài)性位點的類型。
[0014] 步驟（3)中，可對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序或電泳分析，判斷多態(tài)性位點的堿基類型。
[0015] 優(yōu)選的，步驟（1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 10所示，下游引物的核 苷酸序列如SEQIDNO. 11所示。利用該引物，可采用PCR-SSCP的方法準(zhǔn)確方便的檢測多 態(tài)性位點的類型。
[0016] 作為另一種可選擇的，步驟（1)中，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記在豬繁殖性狀選擇中的應(yīng)用。
[0018] 具體的，豬可以為小梅山豬、楓涇豬或大白豬。繁殖性狀為總產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0020] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，豬FSHR基因第10外顯子存在一個突變位點（即多態(tài)性位點）， 該位點位于如SEQIDNO. 1所示序列的第1166位，該突變位點與豬的繁殖性狀尤其是總產(chǎn) 仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)相關(guān)，且容易檢測，從而本發(fā)明根據(jù)該突變位點提供了一種基于FSHR基因 的豬繁殖性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，并提供了該分子標(biāo)記的檢測方法及在豬繁殖性狀選擇中的 應(yīng)用，為豬分子育種、研究豬繁殖生理機(jī)制提供基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例1豬FSHR基因第10外顯子SNPs篩選結(jié)果；
[0022] 圖2為實施例1豬FSHR基因第10外顯子SNPs上氨基酸序列比對結(jié)果；
[0023] 圖3為實施例1豬FSHR基因第10外顯子Cl 166T的PCR-SSCP檢測部分樣本的電 泳結(jié)果；
[0024] 圖4為實施例1基因型分型檢測中AA基因型個體的測序結(jié)果；
[0025] 圖5為實施例1基因型分型檢測中BB基因型個體的測序結(jié)果。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價 形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0027] 實施例1
[0028] 2013年采集106頭小梅山豬、42頭楓涇豬和70頭大白豬的耳樣；同時整理了江蘇 農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院小梅山豬育種中心2004年~2012年期間上述106頭小梅山母豬的生產(chǎn) 檔案，共有698窩仔豬記錄，主要收集產(chǎn)仔年份、胎次、TNB、NBA等指標(biāo)。耳樣（約0. 15g) 用耳號鉗采集，_20°C凍存。用常規(guī)的酚氯仿抽提法提取豬耳樣的基因組DNA，對基因組DNA 進(jìn)行OD值測定，計算其濃度，并用CldH2O稀釋至終濃度為IOOng/ yL，原液-20°C保存，稀釋 液4°C保存。
[0029]第一步：獲取豬FSHR基因外顯子序列。
[0030] 根據(jù)GenBank公布的人FSHR基因全序列（登錄號：NG_008146)和豬FSHRmRNA序 列（登錄號：NM_214386,核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示），比對兩者的蛋白質(zhì)序列，確定 豬FSHR基因的所有外顯子區(qū)域。豬FSHR基因共10個外顯子，除外顯子1、9、10外，其余外 顯子大小均低于l〇〇bp，不能有效擴(kuò)增，并會影響測序結(jié)果的判讀。
[0031] 第二步：應(yīng)用生物軟件設(shè)計引物，引物擴(kuò)增覆蓋外顯子區(qū)域。
[0032] 采用Primer5. 0軟件設(shè)計3對引物，擴(kuò)增豬FSHR基因第10外顯子區(qū)域。3對引物 分別為：FSHR-10. 1、FSHR-10. 2和FSHR-10. 3。引物基本信息見表1。
[0033] 表1豬FSHR基因引物序列
[0034]
[0035] 注：F代表上游引物，R代表下游引物。
[0036] 第三步：PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測序。
[0037] 將每個個體基因組DNA樣本吸取5 y L進(jìn)行混合，形成DNA池，混合后分別采用上 述3對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接送上海生工生物公司進(jìn)行測序。FSHR-10. 1擴(kuò)增靶 向序列如SEQ ID NO. 3所示）。
[0038] PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 20yL，包括：10XBuffer2. 0yL、25mMMg2+2. 2yUlOmM dNTPs0? 8yL、10yM上、下游引物各IyL、DNA模板IyL(IOOng)、5U?yL1Taq酶 0? 2yL、 ddH20 11.8yL〇
[0039]PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min;31個循環(huán)（94°C變性lmin，60°C~63°C退 火30s，72°C延伸Imin);最后72°C延伸10min，4°C保存產(chǎn)物。退火溫度根據(jù)表1中的引物 進(jìn)行選擇。
[0040] 對不同基因型個體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。
[0041] 第四步：序列比對，尋