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一種基于納米金的分子信標(biāo)及其制備與應(yīng)用_3

文檔序號:8407750閱讀:來源:國知局
omatin Protocols (P. B. Becker,ed.) Humana Press,Totowa,1999 等。
[0074] 實(shí)施例1
[0075] (I)材料及設(shè)備
[0076] 氯金酸(HAuC14 · 4Η20,99·99 % ),檸檬酸三鈉,磷酸鹽,NaCl,MgC12, KC1, Milli-Q水;透射電子顯微鏡(TEM),紫外分光光度計(jì)(Hitachi U-3010),熒光分光光度計(jì) (F-4500, Hitachi),PH計(jì),冷凍高速離心機(jī)(Hitachi);分子信標(biāo)購于生工生物工程(上 海)股份有限公司并使用高效液相色譜純化,靶標(biāo)分子(miRNA)購于英濰捷基(上海)貿(mào) 易有限公司。
[0077] (2)納米金(AuNPs)的制備及表征
[0078] 可參照下述文獻(xiàn)中所記載的方法來制備納米金(AuNPs),參考文獻(xiàn):
[0079] K. C. Grabar, R. G. Freeman, M. B. Hommer, M. J. Natan, Analytical
[0080] Chemistry 1995,67,735。
[0081] 亦即,用檸檬酸還原法合成納米金?;静襟E如下:99mL水中加入ImL HAuC14(l%,M/V)溶液,加入圓底燒瓶。然后再油浴中攪拌加熱至沸騰,接著加入3. 5mL檸 檬酸鈉(1 %,M/V)溶液,加熱攪拌反應(yīng)20min。最后攪拌冷卻至室溫。該方法制備的納米 金濃度為2. 3nM,通過高速離心機(jī)離心(12000rpm,20min)濃縮至11. 5nM備用。不同濃度的 納米金溶液,通過加入不同體積的水稀釋11. 5nM納米金溶液得到。制備好的納米金表征如 圖2所示。
[0082] 此外,也可通過商業(yè)途徑購買納米金。
[0083] 實(shí)施例2
[0084] 最初設(shè)計(jì)針對miR155的分子信標(biāo),所述分子信標(biāo)的環(huán)狀區(qū)能與miR155特異結(jié)合, 所述分子信標(biāo)的5'端連接FAM熒光基團(tuán),3'端連接PolyAlO (亦即,10個(gè)連續(xù)的A堿基)。 為了讓分子信標(biāo)形成二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)后,熒光探針與與納米金表面有一定距離,使其構(gòu)象保 持直立,以利于雜交,在PolyAlO與熒光探針的3'端之間連接5個(gè)連續(xù)的T堿基。
[0085] 將3'端連接有5個(gè)連續(xù)的T堿基和PolyAlO的熒光探針
[0086] 5 '-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGTTTTTAAAAAAAAAA-3 ' (IOOuM, 1. 8uL)與 AuNPs(3nM,200uL)共組裝后孵育 16h。加鹽(1M NaCl,100mM PB)22ul,靜置孵育 24h.離心洗滌(0· IM PBS)。
[0087] 最終形成的分子信標(biāo)為:
[0088] 5' -FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGTTTTTAAAAAAAAAA-Au-3, (SEQ ID NO. 1)
[0089] 對形成的分子信標(biāo)與待測目標(biāo)分子miR155進(jìn)行雜交前后的熒光進(jìn)行檢測,獲得 對應(yīng)的熒光圖譜,結(jié)果如圖3所示,由上到下,上面一條曲線為分子信標(biāo)未與待測目標(biāo)分子 miR155進(jìn)行雜交時(shí)的焚光曲線,下面一條曲線為分子信標(biāo)未與待測目標(biāo)分子miR155進(jìn)行 雜交后的熒光曲線,可以發(fā)現(xiàn),雜交后的熒光曲線反而比雜交前的熒光曲線熒光值低,說明 采用短的T序列和PolyA連接納米金和熒光探針這種方式不成功。分析原因:短的T序列 有可能和PolyAlO結(jié)合,從而影響PolyAlO與納米金的結(jié)合,導(dǎo)致納米金與焚光探針連接不 理想。
[0090] 實(shí)施例3
[0091] (1)然后采用其他方式設(shè)計(jì)針對miR155的分子信標(biāo),所述分子信標(biāo)的環(huán)狀區(qū)能與 miR155特異結(jié)合,所述分子信標(biāo)的5'端連接FAM熒光基團(tuán),3'端連接PolyAlO (亦即,10個(gè) 連續(xù)的A堿基)或PolyA20(亦即,20個(gè)連續(xù)的A堿基)。在PolyA10、PolyA20與熒光探針 3'端之間直接連接,無 T堿基。
[0092] 將3'端連接PolyAlO的熒光探針
[0093] 5' -FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-3' (IOOuM, I. 8uL) 與八11即8(311]\1,20〇1^)共組裝后孵育1611.加鹽(1]\1似(:1,10〇1111?8)22111,靜置孵育2411.離 心洗滌(〇· IM PBS)。
[0094] 最終形成的分子信標(biāo)為:
[0095] 5' -FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-Au-3' (SEQ ID NO. 2),記為分子信標(biāo)3-1。
[0096] 將3'端連接PolyA20的熒光探針
[0097] 5 '-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'(100 uM, I. 8uL)與 AuNPs(3nM, 200uL)共組裝后孵育 16h.加鹽(1M NaCl, IOOmM PB)22ul,靜置 孵育24h.離心洗滌(0.1 M PBS)。
[0098] 最終形成的分子信標(biāo)為:
[0099] 5'-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Au-3' ( SEQ ID NO. 3)記為分子信標(biāo)3-2。
[0100] 將上述制備好的分子信標(biāo)溶于IOOmM PBS雜交溶液中,備用。
[0101] 對形成的分子信標(biāo)3-1和3-2進(jìn)行紫外檢測,獲得對應(yīng)的紫外圖譜,并用紫外定量 分子信標(biāo)的濃度,計(jì)算公式為:C分子信標(biāo)=A 52(lnm*2. 2*10 8M。
[0102] 如圖4所示,由上到下,最上面一條為單純的AuNPs紫外曲線;中間一條為 PolyA20+Au形成的分子信標(biāo)3-2的紫外曲線,最高峰值A(chǔ)523= 0. 412,分子信標(biāo)3-2的濃 度為I. 53nM ;最下面一條為PolyAlO+Au形成的分子信標(biāo)3-1的紫外曲線,最高峰值A(chǔ)523 = 0. 385,分子信標(biāo)3-1的濃度為I. 43nM。
[0103] (2)計(jì)算AuNPs表面熒光探針組裝密度
[0104] 1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0105] 將兩種熒光探針(帶FAM熒光,初始濃度均為IOOuM)分別進(jìn)行濃度梯度稀釋。稀 釋所用的溶液為IOOmM PBS,稀釋的濃度分別為100uM,80uM,60uM,40uM,20uM,10uM。將不 同濃度的稀釋液用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光檢測,得出520nm(FAM發(fā)射光波長)處熒光值, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為熒光探針濃度,縱坐標(biāo)為每種熒光探針濃度對應(yīng)的熒光 值。
[0106] 注:標(biāo)準(zhǔn)曲線是在同的離子強(qiáng)度、pH、ME濃度緩沖溶液下繪制的。
[0107] 結(jié)果:
[0108] 分子信標(biāo)3-1所對應(yīng)熒光探針
[0109] (5' -FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-3')的標(biāo)準(zhǔn)曲線如 圖5所示;
[0110] 分子信標(biāo)3-2所對應(yīng)熒光探針
[0111] (5 '-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3')的 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。
[0112] 2)將分子信標(biāo)3-1和3-2進(jìn)行巰基乙醇(MCH)取代,計(jì)算熒光探針組裝量:將分 子信標(biāo)3-1和3-2分別加入巰基乙醇MCH (MCH終濃度為20mM),室溫下?lián)u動(dòng)過夜,接著離心 法收集上清中熒光標(biāo)記的探針,檢測熒光強(qiáng)度。最后將520nm處熒光值代入各自所對應(yīng)的 標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算熒光標(biāo)記探針濃度。
[0113] (5 ' -FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-3 ')以及 MCH 取代 后分子信標(biāo)3-1所獲得的熒光曲線圖如圖7所示:從上到下,第一條曲線表示濃度為IOOuM 的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線;第二條曲線表示濃度為SOuM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲 線;第三條曲線表示濃度為60uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線;第四條曲線表示濃度為 40uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線;第五條曲線表示經(jīng)MCH取代后分子信標(biāo)3-1上連接的 熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線,其最高峰(520nm處)對應(yīng)的熒光值為1873593 ;第六條曲線 表示濃度為20uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線;第七條曲線表示濃度為IOuM的熒光探針 所對應(yīng)的熒光曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算后,得出分子信標(biāo)3-1上連接的熒光探 針濃度約為32. 4nM,結(jié)合紫外結(jié)果(3-1分子信標(biāo)濃度為I. 53nM),計(jì)算分子信標(biāo)3-1上每 個(gè)納米金上所對應(yīng)熒光探針的組裝量為21條。
[0114] (5 '-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3')以 及分子信標(biāo)3-2取代后所獲得的熒光曲線圖,如圖8所示:由上到下,第一條曲線表示濃度 為IOOuM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線;第二條曲線表示濃度為80uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的 熒光曲線;第三條曲線表示濃度為60uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線;第四條曲線表示濃 度為40uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線;第五條曲線表示經(jīng)MCH取代后分子信標(biāo)3-2上連 接的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線,其最高峰(520nm處)對應(yīng)的熒光值為1425361. 5 ;第六 條曲線表示濃度為20uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線;第七條曲線表示濃度為IOuM的熒 光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算后,得出分子信標(biāo)3-2上連接的 熒光探針濃度約為35. 6nM,結(jié)合紫外結(jié)果(3-2分子信標(biāo)濃度為I. 30nM),計(jì)算分子信標(biāo)3-2 上每個(gè)納米金上所對應(yīng)熒光探針的組裝量為27條。
[0115] 3)對分子信標(biāo)3-1和分子信標(biāo)3-2分別與待測目標(biāo)分子miR155進(jìn)行雜交后進(jìn)行
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