omatin Protocols (P. B. Becker，ed.) Humana Press，Totowa，1999 等。
[0074] 實(shí)施例1
[0075] (I)材料及設(shè)備
[0076] 氯金酸（HAuC14 · 4Η20,99·99 % )，檸檬酸三鈉，磷酸鹽，NaCl，MgC12, KC1， Milli-Q水；透射電子顯微鏡（TEM)，紫外分光光度計(jì)（Hitachi U-3010)，熒光分光光度計(jì) (F-4500, Hitachi)，PH計(jì)，冷凍高速離心機(jī)（Hitachi);分子信標(biāo)購于生工生物工程（上 海）股份有限公司并使用高效液相色譜純化，靶標(biāo)分子（miRNA)購于英濰捷基（上海）貿(mào) 易有限公司。
[0077] (2)納米金（AuNPs)的制備及表征
[0078] 可參照下述文獻(xiàn)中所記載的方法來制備納米金（AuNPs)，參考文獻(xiàn)：
[0079] K. C. Grabar, R. G. Freeman, M. B. Hommer, M. J. Natan, Analytical
[0080] Chemistry 1995,67,735。
[0081] 亦即，用檸檬酸還原法合成納米金?；静襟E如下：99mL水中加入ImL HAuC14(l%，M/V)溶液，加入圓底燒瓶。然后再油浴中攪拌加熱至沸騰，接著加入3. 5mL檸 檬酸鈉（1 %，M/V)溶液，加熱攪拌反應(yīng)20min。最后攪拌冷卻至室溫。該方法制備的納米 金濃度為2. 3nM，通過高速離心機(jī)離心（12000rpm，20min)濃縮至11. 5nM備用。不同濃度的 納米金溶液，通過加入不同體積的水稀釋11. 5nM納米金溶液得到。制備好的納米金表征如 圖2所示。
[0082] 此外，也可通過商業(yè)途徑購買納米金。
[0083] 實(shí)施例2
[0084] 最初設(shè)計(jì)針對miR155的分子信標(biāo)，所述分子信標(biāo)的環(huán)狀區(qū)能與miR155特異結(jié)合， 所述分子信標(biāo)的5'端連接FAM熒光基團(tuán)，3'端連接PolyAlO (亦即，10個(gè)連續(xù)的A堿基）。 為了讓分子信標(biāo)形成二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)后，熒光探針與與納米金表面有一定距離，使其構(gòu)象保 持直立，以利于雜交，在PolyAlO與熒光探針的3'端之間連接5個(gè)連續(xù)的T堿基。
[0085] 將3'端連接有5個(gè)連續(xù)的T堿基和PolyAlO的熒光探針
[0086] 5 '-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGTTTTTAAAAAAAAAA-3 ' (IOOuM, 1. 8uL)與 AuNPs(3nM，200uL)共組裝后孵育 16h。加鹽（1M NaCl，100mM PB)22ul，靜置孵育 24h.離心洗滌（0· IM PBS)。
[0087] 最終形成的分子信標(biāo)為：
[0088] 5' -FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGTTTTTAAAAAAAAAA-Au-3, (SEQ ID NO. 1)
[0089] 對形成的分子信標(biāo)與待測目標(biāo)分子miR155進(jìn)行雜交前后的熒光進(jìn)行檢測，獲得 對應(yīng)的熒光圖譜，結(jié)果如圖3所示，由上到下，上面一條曲線為分子信標(biāo)未與待測目標(biāo)分子 miR155進(jìn)行雜交時(shí)的焚光曲線，下面一條曲線為分子信標(biāo)未與待測目標(biāo)分子miR155進(jìn)行 雜交后的熒光曲線，可以發(fā)現(xiàn)，雜交后的熒光曲線反而比雜交前的熒光曲線熒光值低，說明 采用短的T序列和PolyA連接納米金和熒光探針這種方式不成功。分析原因：短的T序列 有可能和PolyAlO結(jié)合，從而影響PolyAlO與納米金的結(jié)合，導(dǎo)致納米金與焚光探針連接不 理想。
[0090] 實(shí)施例3
[0091] (1)然后采用其他方式設(shè)計(jì)針對miR155的分子信標(biāo)，所述分子信標(biāo)的環(huán)狀區(qū)能與 miR155特異結(jié)合，所述分子信標(biāo)的5'端連接FAM熒光基團(tuán)，3'端連接PolyAlO (亦即，10個(gè) 連續(xù)的A堿基）或PolyA20(亦即，20個(gè)連續(xù)的A堿基）。在PolyA10、PolyA20與熒光探針 3'端之間直接連接，無 T堿基。
[0092] 將3'端連接PolyAlO的熒光探針
[0093] 5' -FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-3' (IOOuM, I. 8uL) 與八11即8(311]\1，20〇1^)共組裝后孵育1611.加鹽（1]\1似(：1，10〇1111?8)22111，靜置孵育2411.離 心洗滌（〇· IM PBS)。
[0094] 最終形成的分子信標(biāo)為：
[0095] 5' -FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-Au-3' (SEQ ID NO. 2)，記為分子信標(biāo)3-1。
[0096] 將3'端連接PolyA20的熒光探針
[0097] 5 '-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'（100 uM, I. 8uL)與 AuNPs(3nM, 200uL)共組裝后孵育 16h.加鹽（1M NaCl, IOOmM PB)22ul，靜置 孵育24h.離心洗滌（0.1 M PBS)。
[0098] 最終形成的分子信標(biāo)為：
[0099] 5'-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Au-3' ( SEQ ID NO. 3)記為分子信標(biāo)3-2。
[0100] 將上述制備好的分子信標(biāo)溶于IOOmM PBS雜交溶液中，備用。
[0101] 對形成的分子信標(biāo)3-1和3-2進(jìn)行紫外檢測，獲得對應(yīng)的紫外圖譜，并用紫外定量 分子信標(biāo)的濃度，計(jì)算公式為：C分子信標(biāo)=A 52(lnm*2. 2*10 8M。
[0102] 如圖4所示，由上到下，最上面一條為單純的AuNPs紫外曲線；中間一條為 PolyA20+Au形成的分子信標(biāo)3-2的紫外曲線，最高峰值A(chǔ)523= 0. 412,分子信標(biāo)3-2的濃 度為I. 53nM ;最下面一條為PolyAlO+Au形成的分子信標(biāo)3-1的紫外曲線，最高峰值A(chǔ)523 = 0. 385,分子信標(biāo)3-1的濃度為I. 43nM。
[0103] (2)計(jì)算AuNPs表面熒光探針組裝密度
[0104] 1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0105] 將兩種熒光探針（帶FAM熒光，初始濃度均為IOOuM)分別進(jìn)行濃度梯度稀釋。稀 釋所用的溶液為IOOmM PBS，稀釋的濃度分別為100uM，80uM，60uM，40uM，20uM，10uM。將不 同濃度的稀釋液用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光檢測，得出520nm(FAM發(fā)射光波長）處熒光值， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為熒光探針濃度，縱坐標(biāo)為每種熒光探針濃度對應(yīng)的熒光 值。
[0106] 注：標(biāo)準(zhǔn)曲線是在同的離子強(qiáng)度、pH、ME濃度緩沖溶液下繪制的。
[0107] 結(jié)果：
[0108] 分子信標(biāo)3-1所對應(yīng)熒光探針
[0109] (5' -FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-3'）的標(biāo)準(zhǔn)曲線如 圖5所示；
[0110] 分子信標(biāo)3-2所對應(yīng)熒光探針
[0111] (5 '-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'）的 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。
[0112] 2)將分子信標(biāo)3-1和3-2進(jìn)行巰基乙醇（MCH)取代，計(jì)算熒光探針組裝量：將分 子信標(biāo)3-1和3-2分別加入巰基乙醇MCH (MCH終濃度為20mM)，室溫下?lián)u動(dòng)過夜，接著離心 法收集上清中熒光標(biāo)記的探針，檢測熒光強(qiáng)度。最后將520nm處熒光值代入各自所對應(yīng)的 標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算熒光標(biāo)記探針濃度。
[0113] (5 ' -FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAA-3 '）以及 MCH 取代 后分子信標(biāo)3-1所獲得的熒光曲線圖如圖7所示：從上到下，第一條曲線表示濃度為IOOuM 的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線；第二條曲線表示濃度為SOuM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲 線；第三條曲線表示濃度為60uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線；第四條曲線表示濃度為 40uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線；第五條曲線表示經(jīng)MCH取代后分子信標(biāo)3-1上連接的 熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線，其最高峰（520nm處）對應(yīng)的熒光值為1873593 ;第六條曲線 表示濃度為20uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線；第七條曲線表示濃度為IOuM的熒光探針 所對應(yīng)的熒光曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算后，得出分子信標(biāo)3-1上連接的熒光探 針濃度約為32. 4nM，結(jié)合紫外結(jié)果（3-1分子信標(biāo)濃度為I. 53nM)，計(jì)算分子信標(biāo)3-1上每 個(gè)納米金上所對應(yīng)熒光探針的組裝量為21條。
[0114] (5 '-FAM-CGCTGCACCCCTATCACGATTAGCATTAAGCAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'）以 及分子信標(biāo)3-2取代后所獲得的熒光曲線圖，如圖8所示：由上到下，第一條曲線表示濃度 為IOOuM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線；第二條曲線表示濃度為80uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的 熒光曲線；第三條曲線表示濃度為60uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線；第四條曲線表示濃 度為40uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線；第五條曲線表示經(jīng)MCH取代后分子信標(biāo)3-2上連 接的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線，其最高峰（520nm處）對應(yīng)的熒光值為1425361. 5 ;第六 條曲線表示濃度為20uM的熒光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線；第七條曲線表示濃度為IOuM的熒 光探針?biāo)鶎?yīng)的熒光曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算后，得出分子信標(biāo)3-2上連接的 熒光探針濃度約為35. 6nM，結(jié)合紫外結(jié)果（3-2分子信標(biāo)濃度為I. 30nM)，計(jì)算分子信標(biāo)3-2 上每個(gè)納米金上所對應(yīng)熒光探針的組裝量為27條。
[0115] 3)對分子信標(biāo)3-1和分子信標(biāo)3-2分別與待測目標(biāo)分子miR155進(jìn)行雜交后進(jìn)行