一種基于納米金的分子信標及其制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種基于納米金的多色分子信標及其制備與 應用。
【背景技術】
[0002] 1996年Tyagi和Kramer報道了一種具有發(fā)夾結構的新型熒光核酸探針--分子 信標（molecular beacon)，最初目的是能在液相中定量測定革El標的量。自由狀態(tài)時的分 子信標呈發(fā)夾結構，此時由于熒光基團與猝滅基團靠得很近，熒光被猝滅；當與靶序列結合 后，分子信標的空間構型發(fā)生改變，熒光恢復。分子信標技術以其操作簡單、靈敏度高、特異 性強、可對核酸進行實時定量測定、甚至可以用于活體分析等特點不僅在生物學研宄中有 著廣泛的應用，而且在疾病基因檢測與診斷等生物醫(yī)學基礎和臨床研宄中也將充當重要的 角色。近來，人們通過改變經典分子信標的結構，設計出許多新型的分子信標，如用ssDNA 鏈做環(huán)、用RNA-DNA雙鏈做莖的RNA-DNA嵌合型分子信標，用PNA鏈代替ssDNA形成的PNA 分子信標等。新型分子信標的出現為分子信標的進一步應用拓寬了領域。
[0003] 分子信標的設計一般包括三個部分：
[0004] (1)環(huán)狀區(qū)：一般為長度15~30堿基的序列，能與目標分子特異結合；
[0005] (2)信標莖干區(qū)：通常為長度5~8個堿基的互補序列，莖干區(qū)與雜交后環(huán)狀 區(qū)-目標分子的雙鏈結構之間的熱力學平衡關系，使分子信標的雜交特異性明顯高于常規(guī) 的線狀探針；
[0006] (3)熒光基團和猝滅基團，熒光基團一般聯接在信標分子的5端；猝滅基團聯接在 3'端。圖1為經典的分子信標結構，其中1-氨基萘-8-羧酸（EDANS)為熒光素，二甲氨基 偶氮苯甲酰（DABSYL)為猝滅劑。分子信標中常用4-(4' -二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸 (DABCYL)作為猝滅基團，德克薩斯紅（TexasRed)、熒光素（Fluoresein)等作為熒光基團。
[0007] 自由狀態(tài)時，發(fā)夾結構的兩個末端靠近，使焚光分子與猝滅分子靠近（約為 7-10nm)。此時發(fā)生熒光共振能量轉移，使熒光分子發(fā)出的熒光被猝滅分子吸收并以熱的 形式散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅，熒光本底極低。圖2為分子信標的工作原理，當分子信標 與序列完全互補的祀標分子結合形成雙鏈雜交體時，信標莖桿互補區(qū)被拉開，焚光分子和 猝滅分子距離增大。根據Foerster理論，中心熒光能量轉移效率與兩者距離的6次方成 反比。雜交后，信標分子的熒光幾乎100%恢復。且所檢測到的熒光強度與溶液中靶標的 量成正比。分子信標中最常用的猝滅劑是DABSYL，它對多種熒光素都有較強的熒光猝滅效 率。近來Dubertret等用金納米粒子簇代替DABSYL做猝滅劑，人們還可以通過調節(jié)金屬納 米簇的形狀、大小和組成而得到不同的猝滅劑。由于金納米簇對熒光試劑有著更高的猝滅 效率，所以用金納米粒子代替DABSYL后，大大提高了分子信標的靈敏度和特異性。Demidov 等人設計出DNA或PM無莖分子信標，與經典分子信標結構類似，只是不再含有雙鏈結構的 莖桿區(qū)。由于DNA戊糖骨架或PNA聚酰胺骨架具有很好的柔韌性，在無靶標存在的情況下， 熒光分子與猝滅分子間的疏水作用使得無莖分子信標近似于一個閉環(huán)結構。當分子信標與 靶標結合后，探針和靶標形成的雙鏈具有剛性結構使熒光分子和猝滅分子分開，熒光恢復。 無莖分子信標與經典的分子信標相比，它的優(yōu)點在于無莖分子信標不含有與靶標無關的序 列，但缺點是自由狀態(tài)時，無莖分子信標的熒光本底較高。
[0008] 現有的檢測miRNA的方法已有多種。如Northern blotting方法是一種直接檢測 的方法，不需要對miRNA樣本進行預擴增，其原理是首用聚丙烯酰胺電泳分離出小的RNA， 經洗膜、顯影后對條帶進行分析。雖然Northern bolt是當前miRNA分析的標準方法，但其 操作繁瑣、耗時長、靈敏度低和所需樣品量過多，且對RNase污染非常敏感。微列陣芯片是 實現miRNA表達譜分析和多種miRNA同時高通量檢測的主要技術，該方法的優(yōu)越性在于可 實現高通量多組分同時檢測，但微陣列芯片的制作成本和檢測費用很高，芯片上可利用的 樣品體積很小，因而導致靈敏度不高，獲得數據偏差較大。原位雜交是利用比色或熒光試劑 等標記的核酸探針與組織或細胞中的miRNA進行雜交，通過焚光成像或顯色來檢測miRNA 的表達情況，可直觀地展現miRNA的時空表達模式，此方法成功應用于多種組織和細胞內 miRNA原位分析，也提高了 miRNA的檢測靈敏度。然而由于miRNA序列較短，原位雜交技術 需進一步提高雜交的親和性，避免miRNA在雜交過程和洗脫過程中丟失。滾環(huán)擴增法模仿 生物體喚醒DNA分子滾環(huán)式復制的方式，以循環(huán)實現DNA的連續(xù)擴增。但以miRNA為模板 連接探針成環(huán)的特異性較差且效率低，需要通過電泳分離后利用放射性同位素檢測。

【發(fā)明內容】

[0009] 鑒于以上所述現有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種基于納米金的分子信 標及其制備與應用。
[0010] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現的：
[0011] 本發(fā)明的第一方面提供了一種基于納米金的分子信標，包括依次排布的熒光基 團、第一信標莖干區(qū)、環(huán)狀區(qū)、第二信標莖干區(qū)和納米金，所述環(huán)狀區(qū)為與待測目標分子特 異結合的核苷酸片段，所述第一信標莖干區(qū)的核苷酸序列與第二信標莖干區(qū)的核苷酸序列 互補。
[0012] 優(yōu)選地，所述納米金通過PolyA與第二信標莖干區(qū)連接。
[0013] PolyA，亦即，多聚腺苷酸，為多個連續(xù)的腺苷酸A組成的核苷酸片段。
[0014] 優(yōu)選采用 PolyA20 或 PolyAlO。
[0015] 所述PolyA20的核苷酸序列如SEQID NO. 18所示，具體為：
[0016] AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 〇
[0017] 所述PolyAlO的核苷酸序列如SEQID NO. 19所示，具體為：
[0018] AAAAAAAAAAo
[0019] 更優(yōu)選采用PolyA20。
[0020] 優(yōu)選地，所述環(huán)狀區(qū)為含有15~30個堿基的核苷酸片段。所述環(huán)狀區(qū)能與待測 目標分子特異結合，所述環(huán)狀區(qū)可以根據待測目標分子的核苷酸序列來設計。
[0021] 優(yōu)選地，所述第一信標莖干區(qū)和第二信標莖干區(qū)均為含有5~8個堿基的核苷酸 片段。
[0022] 所述第一信標莖干區(qū)的核苷酸序列與第二信標莖干區(qū)的核苷酸序列互補。
[0023] 優(yōu)選地，所述分子信標的5'端連接熒光基團，3'端連接納米金。
[0024] 優(yōu)選地，所述熒光基團的激發(fā)波長與所述納米金的發(fā)射波長有部分重疊。更優(yōu)選 地，所述熒光基團選自FAM、ROX、Cy3或Cy5。
[0025] 優(yōu)選地，所述納米金的粒徑為13~15nm。所述納米金為現有技術，既可以參考現 有的文獻制備，也可以通過商業(yè)途徑購買。
[0026] 優(yōu)選地，所述環(huán)狀區(qū)的核苷酸序列以及任一信標莖干區(qū)的核苷酸序列均與待測目 標分子的靶核苷酸序列互補。
[0027] 自由狀態(tài)時，分子信標的兩個末端靠近，使焚光基團與納米金靠近，此時發(fā)生焚光 共振能量轉移效應。當分子信標與序列完全互補的待測目標分子結合形成雙鏈雜交體時， 信標莖桿互補區(qū)被拉開，熒光基團和納米金距離增大，熒光共振能量轉移效應減弱甚至消 失。從而根據熒光強度變化來檢測目標分子的含量。
[0028] 本發(fā)明的第二方面還提供了一種制備前述基于納米金的分子信標的方法，所述方 法包括如下步驟：
[0029] (1)將由依次首尾連接的熒光基團、第一信標莖干區(qū)、環(huán)狀區(qū)、第二信標莖干區(qū)和 PolyA組成的熒光探針與納米金混合；
[0030] (2)在步驟⑴中所得混合液中，加入PolyA5 ;
[0031] (3)調節(jié)PH至中性，離心，洗絳，重懸于雜交液，備用即可。
[0032] 優(yōu)選地，所述PolyA5的核苷酸序列如如SEQID NO. 20所示，具體為：AAAAA。
[0033] 優(yōu)選地，所述熒光探針、納米金以及PolyA5三者之間的摩爾比例為：（200~800): 1 : (100 ~400) 〇
[0034] 更優(yōu)選地，三者之間的摩爾比例為：300 :1 :100。
[0035] 優(yōu)選地，所述熒光探針的濃度為：50uM~lOOuM。更優(yōu)選地，所述熒光探針的濃度 為 100uM。
[0036] 優(yōu)選地，所述納米金的濃度為3nM~10nM。更優(yōu)選地，所述納米金的濃度為3nM。
[0037] 優(yōu)選地，所述PolyA5的濃度為50uM~100uM。更優(yōu)選地，所述PolyA5的濃度為 IOOuM0
[0038] 優(yōu)選地，調節(jié)PH時，采用0. 2M的PB溶液。
[0039] 優(yōu)選地，所述離心的速度為12000rpm，時間為20~30min。
[0040] 優(yōu)選地，洗滌時采用0.1 M的PB溶液。
[0041] 優(yōu)選地，雜交液采用0.1 M的PBS溶液。
[0042] 本發(fā)明的第三方面公開了一種非疾病診斷目的的檢測目標分子的方法，包括如下 步驟：先將待測目標分子和前述基于納米金的分子信標混合，再進行熒光值檢測。
[0043] 優(yōu)選地，所述目標分子包括DNA、miRNA、mRNA。
[0044] 優(yōu)選地，所述前述基于納米金的分子信標如上所述。
[0045] 本發(fā)明第四方面還提供了前述基于納米金的分子信標在制備DNA、miRNA或mRNA 檢測試劑中的應用。
[0046] 本發(fā)明第五方面，提供了一種試劑盒，包括前述基于納米金的分子信標。
[0047] 本發(fā)明檢測原理如圖1所示：
[0048] 利用大粒徑的納米金顆粒（15nm)作為猝滅基團，通過PolyA連接多種帶有不同焚 光基團的DNA探針。當沒有靶標存在時，分子探針自身堿基互補配對，熒光基團的熒光被淬 滅基團淬滅。當有靶標存在時，靶標與分子探針互補配對，熒光基團發(fā)出熒光，通過檢測熒 光信號，實現檢測。
[0049] 本發(fā)明的技術關鍵點在于，用PolyA連接納米金及熒光探針，避免了以往用巰基 連接，合成復雜，成本高。且用PolyA連接方法簡單