在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1抗體，尤其是在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的 抗人Dlk-1抗體。另外本發(fā)明涉及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤和該抗體的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人D化-1 (delta-likeIhomolog(Drosophila) ; 5 樣 1 同源物（果禍）；W下也稱 為"hD化-1")是全長為383個氨基酸殘基的單次跨膜型的1型膜蛋白，其在細(xì)胞外區(qū)域具 有6個EGF樣基序。其細(xì)胞外區(qū)域與Notch/Delta/Serrate家族顯示出同源性。hD；Lk-l基 因作為在GRP(gastrinreleasingpeptide,胃泌素釋放膚）應(yīng)答性的肺小細(xì)胞癌來源的細(xì) 胞株中表達(dá)的分子（非專利文獻(xiàn)1)或作為抑制前脂肪細(xì)胞分化的因子被克?。ǚ菍＠?獻(xiàn)2)。hD化-1由于與作為細(xì)胞分化控制因子的Notch受體的配體5的氨基酸序列具有同 源性，通常用DLK1該樣的基因標(biāo)識來命名，此外，雖然具有Pref-1 (非專利文獻(xiàn)2)、pG2 (非 專利文獻(xiàn)3)、SCP-1 (非專利文獻(xiàn)4)和Z0G(非專利文獻(xiàn)5)多個基因標(biāo)識，但它們基本是同 一分子。
[000引而且，hD化-1的細(xì)胞外區(qū)域的細(xì)胞膜附近被一種尚未鑒定的蛋白酶切斷，并分 泌到血液中。游離hD化-1化1)化-1細(xì)胞外區(qū)域）與225~262個氨基酸殘基的被稱為 FA-l(Fetalantigen-1，胎兒抗原-1)(非專利文獻(xiàn)6)的糖蛋白質(zhì)是同一分子。
[0004] hD化-1基因及其基因產(chǎn)物在未分化的增殖能力高的胚胎細(xì)胞中顯示出高表達(dá)。尤 其是，在胚胎肝臟、胚胎腎臟、胚胎骨骼肌、胚胎腦等中顯示出高表達(dá)，但出生后，在大部分 組織中沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)，在正常的成體組織中，表達(dá)局限于腎上腺、胎盤、垂體中（專利文獻(xiàn) 1、非專利文獻(xiàn)2)。
[0005] 而且，即使在成體組織中，在被認(rèn)為是未分化的干細(xì)胞和前體細(xì)胞的細(xì)胞中 也發(fā)現(xiàn)了hD化-1的表達(dá)。例如，hD化-1在成體肝臟中未分化的具有多向分化潛力 (multilineagepotential)的肝卵圓細(xì)胞（非專利文獻(xiàn)7、8)、骨/軟骨/脂肪細(xì)胞的干細(xì) 胞即間充質(zhì)干細(xì)胞（非專利文獻(xiàn)9)和前列腺的基底細(xì)胞層的前列腺上皮前體細(xì)胞（非專 利文獻(xiàn)18)中的表達(dá)已有報道。另外，據(jù)報道；在小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞中，游離Dlk-1(小鼠 D化-1細(xì)胞外區(qū)域）使E服/MAP激酶活化，誘導(dǎo)Sox-9的表達(dá)，從而抑制向脂肪細(xì)胞的分化， 同時誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞的分化，但它們對向成骨細(xì)胞的分化和軟骨細(xì)胞的成熟產(chǎn)生抑制（非 專利文獻(xiàn)19、20)。該些提示hDlk-1與組織干細(xì)胞的性質(zhì)、例如未分化能力的維持等相關(guān)。
[0006] hD化-1的該種局限于胎兒期的細(xì)胞和干細(xì)胞中表達(dá)的模式，W及具有EGF樣基序 的基因/基因產(chǎn)物的家族（Notch受體，Notch配體（5 ,Jagged,serrate)等）一般通過 EGF樣基序介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用來控制細(xì)胞的增殖和分化，由此提示hD化-1也具有該種 功能。事實(shí)上，已知隨著脂肪前體細(xì)胞的分化而表達(dá)降低，而且若在脂肪前體細(xì)胞中強(qiáng)制表 達(dá)hD化-1基因，則脂肪分化被抑制（非專利文獻(xiàn)2)。但是，目前，與hD化-1相互作用的分 子（配體）的詳細(xì)情況尚不清楚。
[0007] 另一方面，據(jù)報道hD化-1基因及其基因產(chǎn)物在各種癌和腫瘤中也W高頻率表達(dá)。 迄今為止，作為已確認(rèn)其表達(dá)的癌的種類，在實(shí)體癌中，已知有神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、神經(jīng)母細(xì) 胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、1型神經(jīng)纖維瘤病、小細(xì)胞肺癌、肝癌、腎癌、卵巢癌、大腸癌、乳腺癌和膜 臟癌（專利文獻(xiàn)1、2、4、5和非專利文獻(xiàn)1、3、10、11、12、13、14、21)，在血癌中，已知有骨髓 發(fā)育異常綜合征（專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)15、16)和急性髓系白血?。ǚ菍＠墨I(xiàn)16)。 據(jù)報道如果在紅白血病細(xì)胞株（e巧t虹ole址emia)K562細(xì)胞中導(dǎo)入hD化-1基因，貝Ij細(xì)胞增 殖受到促進(jìn)（非專利文獻(xiàn)16)，同樣，如果在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中導(dǎo)入hD化-1基因，不僅細(xì) 胞增殖被促進(jìn)，而且細(xì)胞的接觸抑制也喪失，獲得銷著非依存性的（anchorage-dependent) 細(xì)胞增殖能力，該提示hD化-1與致癌之間的關(guān)聯(lián)性（非專利文獻(xiàn)17)。
[0008] W往，針對人的肝癌細(xì)胞，作為在體外在補(bǔ)體存在下顯示出細(xì)胞毒性的抗hD化-1 單克隆抗體，已知作為大鼠抗hD化-1單克隆抗體的1CU4C4和31C4(克隆名）（專利文獻(xiàn) 1)，另一方面，還已知該些克隆抗體不顯示體內(nèi)（人癌細(xì)胞荷瘤小鼠中的治療模型）的抗腫 瘤活性（腫瘤生長抑制活性）（專利文獻(xiàn)4、5)。
[0009] <專利文獻(xiàn)>
[0010] 專利文獻(xiàn) 1 ;W0 2005/052156
[0011] 專利文獻(xiàn) 2 ;W0 02/081625
[0012] 專利文獻(xiàn)3 :日本特開2001-269174號
[0013] 專利文獻(xiàn) 4 ;W0 2008/056833
[0014] 專利文獻(xiàn) 5 ;W0 2009/116670
[0015] <非專利文獻(xiàn)>
[0016] 非專利文獻(xiàn) 1 ;Laborda,J.etal. ,J.Biol.Chem. ,vol. 268 (6) ,p. 3817-3820(1993)
[0017] 非專利文獻(xiàn) 2 ;Smas，C.M.etal.，Cell,vol. 73(4)，p. 725-7：M(1993)
[001 引 非專利文獻(xiàn) 3 ;He1man,L.J.eta1. ,Proc.Na11.Acad.Sci.USA,vol. 84,p. 2336-2339 (1987)
[0019] 非專利文獻(xiàn) 4 :Maruyama,K.etal. ,Unpublished,Genebankaccessionnumber 016847(1993)
[0020] 非專利文獻(xiàn) 5 ;Halder,S.K.etal. ,Elndocrinology,vol. 139,p. 3316-3328 (1998) [00引]非專利文獻(xiàn) 6Jay,T.N.etal. ,Eur.J.Obstet.Gynecol.Reprod. Biol. ,vol. 29,p. 73-85(1988)
[0022] 非專利文獻(xiàn) 7:Tanimizu,N.eta1 . ,GeneExpression 化tterns,vol. 5,p. 209-218 (2004)
[0023] 非專利文獻(xiàn) 8 ;Jensen,CH.etal. ,Am.J.Pathol. ,vol. 164 (4) ，p. 1:347-1359(2004)
[0024] 非專利文獻(xiàn) 9;Abdallah,B.M.etBoneMiner. Res.，vol. 19 巧），p. 841-852 (2004)
[00巧]非專利文獻(xiàn) 10 ;Jensen,C.H.etal. ,Br.J.Dermatol. ,vol. 140 (6) ,p. 1054-1059(1999)
[0026] 非專利文獻(xiàn) 11Jensen,C.H.etal.，TumourBiol.，vol. 20 巧），p. 256-262 (1999)
[0027] 非專利文獻(xiàn) 12 ;Yin，D.etal.，Int.J.Oncol.，vol. 24(4)，p. 1011-1015(2004)
[0028]非專利文獻(xiàn) 13 ;Yin,D.etal. ,Oncogene,vol. 25 (13),p. 1852-1861 (2006)
[0029]非專利文獻(xiàn) 14 ;Rikuzawa，R.etal.，J.Clin.化thol.，vol. 58,p. 145-150 (2006)
[0030]非專利文獻(xiàn) 15 ;Miyazato,A.etal. ,Blood,vol. 98,p. 422-427 (2001)
[0031]非專利文獻(xiàn) 16 ;Sakajiri，S.etal.，Leukemia,vol. 19 巧），p. 1404-1410(2005)
[0032]非專利文獻(xiàn) 17 ;Yin,D.etal. ,Oncogene,vol. 25 (13),p. 1852-1861 (2006)
[0033]非專利文獻(xiàn) 18 ;Ceder,J.A.etal.，化r.化ol.，Vol. 54 化），pl：M4-1353 (2008)
[0034]非專利文獻(xiàn) 19 ;Sul,服.，Mol.化docrinol.，vol. 23(ll)，pl717-1725(2009)
[00巧]非專利文獻(xiàn) 20 ;Wang，Y.etal.，Mol.CellBiol.,vol. 30(14)，p：M80-3492 (2010)
[0036]非專利文獻(xiàn) 21 ;Yanai,H.etal. ,J.Biochem. ,vol. 148 (1),p85_92 (2010)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0037] 如上所述，在正常組織中，hD化-1的表達(dá)局限于胎兒期的細(xì)胞或干細(xì)胞；癌組織 中，hD化-1則在各種腫瘤中高頻率表達(dá)，并且hD化-1是細(xì)胞膜蛋白/分泌蛋白，由此認(rèn)為 hD化-1在各種腫瘤的治療等中是好的祀標(biāo)。并認(rèn)為W該hD化-1為祀標(biāo)時，抗hD化-1抗體 是有用的。另外，例如為了用作癌治療用抗體，更理想的是，在使用了人癌細(xì)胞的荷瘤小鼠 治療模型中通過抗體單獨(dú)給藥而顯示出顯著的抗腫瘤活性，而且，在液劑處方中和人或猴 的血中具有穩(wěn)定的抗原結(jié)合活性的保持能力。
[0038] 因此，本發(fā)明要解決的問題在于提供具有抗腫瘤活性的抗hD化-1抗體，具體來說 是在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗hD化-1單克隆抗體、尤其是該抗體為人源化抗體。另外，還 在于提供產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、該抗體與藥劑的復(fù)合體等。此外，在于提供使用上述抗體或 上述復(fù)合體等的、腫瘤的診斷用或治療用藥物組合物、腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)用藥物組 合物、腫瘤治療劑、腫瘤診斷劑、腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)劑、腫瘤的治療方法、腫瘤的檢測 方法、腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)方法、腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒、W及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞 調(diào)亡誘導(dǎo)用試劑盒等。
[0039] 本發(fā)明人為了解決上述問題進(jìn)行了積極的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與hD化-1特異性反 應(yīng)的抗體（尤其是抗hDlk-1單克隆抗體），該抗體具有抗腫瘤活性（尤其是人源化抗體）， 并確認(rèn)了它們在體內(nèi)具有抗腫瘤活性。另外，該種抗體在人源化抗體的制作中得W成功。此 夕F，還發(fā)現(xiàn)該些抗體和復(fù)合體對于腫瘤的治療、診斷和檢測、W及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo) 有用，從而完成了本發(fā)明。
[0040]目P，本發(fā)明如下所述。
[0041] (1) 一種抗人〇化-1的抗體，其中，H鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號35、40、69、 73、77、81、85和89中的任一者所示的氨基酸序列，L鏈V區(qū)域的氨基酸序列包含序列號45 所示的氨基酸序列。
[004引上述（1)的抗體，例如，可W舉出在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗體。此處，作為腫瘤， 例如，可W舉出選自由人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌、人膜臟癌、人小細(xì)胞肺癌和人神經(jīng)母細(xì) 胞瘤組成的組中的至少1種。
[004引上述（1)的抗體，例如，可W舉出人源化抗體。
[0044]上述（1)的抗體，例如，可W舉出單克隆抗體。
[004引上述（1)的抗體，例如，可W舉出與序列號2所示的人D化-1的氨基酸序列中的包 含第24位~第91位氨基酸的區(qū)域的至少一部分結(jié)合的抗體。
[004引似一種抗體片段，其來源于上述（1)的抗體。
[0047]上述似的抗體片段，例如，可W舉出含有序列號35、40、69、73、77、81、85和89中 的任一者所示的氨基酸序列的抗體片段、和含有序列號45所示的氨基酸序列的抗體片段、 W及含有序列號35、40、69、73、77、81、85和89中的任一者所示的氨基酸序列和序列號45 所示的氨基酸序列的抗體片段。
[004引做一種抗體-藥劑復(fù)合體，其含有上述（1)的抗體和具有抗腫瘤活性和/或細(xì)胞 殺傷活性的化合物。
[0049] (4) -種抗體片段-藥劑復(fù)合體，其含有上述（2)的抗體片段和具有抗腫瘤活性和 /或細(xì)胞殺傷活性的化合物。
[0050] 妨一種藥物組合物，其含有選自由上述（1)的抗體、上述似的抗體片段、和上述 (3)或（4)的復(fù)合體組成的組中的至少1種。
[0051] 上述巧）的藥物組合物，例如，可W舉出用于腫瘤的治療的藥物組合物，尤其可W 舉出沒有體重減少的副作用的藥物組合物。另外，上述巧）的藥物組合物，例如，可W舉出 用于腫瘤的診斷的藥物組合物。此外，上述巧）的藥物組合物，例如，可W舉出用于腫瘤細(xì) 胞的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)的藥物組合物。
[005引做一種腫瘤治療劑，其含有選自由上述（1)的抗體、上述似的抗體片段、和上述 (3)或（4)的復(fù)合體組成的組中的至少1種。
[0053] 上述化）的腫瘤治療劑，例如，可W舉出沒有體重減少的副作用的腫瘤治療劑。
[0054] (7) -種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)劑，其含有選自由上述（1)的抗體、上述似的 抗體片段、和上述（3)或（4)的復(fù)合體組成的組中的至少1種。
[0055]此處，在上述巧）的藥物組合物、上述化）的腫瘤治療劑、和上述（7)的細(xì)胞調(diào)亡 誘導(dǎo)劑中，作為腫瘤，例如，可W舉出選自由人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌、人膜臟癌、人小細(xì) 胞肺癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤組成的組中的至少1種。
[005引做一種腫瘤的治療方法，其包括向患者給藥選自由上述（1)的抗體、上述似的 抗體片段、和上述（3)或（4)的復(fù)合體組成的組中的至少1種。
[0057] 上述巧）的治療方法，例如，可W舉出在患者中沒有體重減少的副作用的治療方 法。
[0058] (9) 一種腫瘤的檢測方法，其包括；使選自由上述（1)的抗體、上述（2)的抗體片 段、和上述（3)或（4)的復(fù)合體組成的組中的至少1種與從生物體采集的試樣反應(yīng)，檢測反 應(yīng)的抗體和/或抗體片段的信號。
[0059] (10) -種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)方法，其包括使選自由上述（1)的抗體、上述 (2)的抗體片段、和上述（3)或（4)的復(fù)合體組成的組中的至少1種與從生物體采集的試樣 反應(yīng)，檢測反應(yīng)的抗體和/或抗體片段的信號。
[0060] 此處，在上述巧）的治療方法、上述（9)的檢測方法、和上述（10)的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo) 方法中，作為腫瘤，例如，可W舉出選自由人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌、人膜臟癌、人小細(xì)胞 肺癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤組成的組中的至少1種。
[006。（11) 一種腫瘤的治療用、診斷用或檢測用試劑盒，其含有選自由上述（1)的抗體、 上述（2)的抗體片段、和上述（3)或（4)的復(fù)合體組成的組中的至少1種。
[006引（。）一種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡誘導(dǎo)用試劑盒，其含有選自由上述（1)的抗體、上 述（2)的抗體片段、和上述（3)或（4)的復(fù)合體組成的組中的至少1種。
[0063] 此處，在上述（11)和（12)的試劑盒中，作為腫瘤，例如，可W舉出選自由人大腸 癌、人乳腺癌、人肝癌、人膜臟癌、人小細(xì)胞肺癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤組成的組中的至少1種。
【附圖說明】
[0064] 圖1是表示小鼠抗hD化-1單克隆抗體克隆BA-1-3D的H鏈（重鏈）可變區(qū)（VH) 的cDNA堿基序列（序列號12)和推定氨基酸序列（序列號13)的圖。氨基酸殘基用一 個字母標(biāo)記表示，信號膚（從該推定氨基酸序列的N末端起19個氨基酸構(gòu)成的膚）用西 文斜體字表示。畫了雙下劃線的谷氨