專利名稱：在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1抗體，尤其是在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1抗體。另外本發(fā)明涉及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤和該抗體的用途。
背景技術(shù)：
人Dlk-1 (delta-like I homo log (Drosophila) ; δ 樣 I 同源物(果妮)；以下也稱為“hDlk-Ι”)是全長為383個氨基酸殘基的單次跨膜型的I型膜蛋白，其在細(xì)胞外區(qū)域具有6個EGF樣基序。其細(xì)胞外區(qū)域與Notch/Delta/Serrate家族顯示出同源性。hDlk_l基因作為在GRP (gastrin releasing peptide,胃泌素釋放肽)應(yīng)答性的肺小細(xì)胞癌來源的細(xì)胞株中表達(dá)的分子(非專利文獻(xiàn)I)或作為抑制前脂肪細(xì)胞分化的因子被克隆(非專利文獻(xiàn)2)。hDlk-Ι由于與作為細(xì)胞分化控制因子的Notch受體的配體δ的氨基酸序列具有同源性，通常用DLKl這樣的基因標(biāo)識來命名，此外，雖然具有Pref-1 (非專利文獻(xiàn)2)、pG2(非專利文獻(xiàn)3)、SCP-1 (非專利文獻(xiàn)4)和ZOG (非專利文獻(xiàn)5)多個基因標(biāo)識，但它們基本是同一分子。而且，hDlk-Ι的細(xì)胞外區(qū)域的細(xì)胞膜附近被一種尚未鑒定的蛋白酶切斷，并分泌到血液中。游離hDlk-1 (hDlk-Ι細(xì)胞外區(qū)域)與225 262個氨基酸殘基的被稱為FA-1(Fetal antigen-1,胎兒抗原一 I)(非專利文獻(xiàn)6)的糖蛋白質(zhì)是同一分子。hDlk-Ι基因及其基因產(chǎn)物在未分化的增殖能力高的胚胎細(xì)胞中顯示出高表達(dá)。尤其是，在胚胎肝臟、胚胎腎臟、胚胎骨`骼肌、胚胎腦等中顯示出高表達(dá)，但出生后，在大部分組織中沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)，在正常的成體組織中，表達(dá)局限于腎上腺、胎盤、垂體中(專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)。而且，即使在成體組織中，在被認(rèn)為是未分化的干細(xì)胞和前體細(xì)胞的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了 hDlk-Ι的表達(dá)。例如，hDlk-Ι在成體肝臟中未分化的具有多向分化潛力(multilineage potential)的肝卵圓細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)7、8)、骨/軟骨/脂肪細(xì)胞的干細(xì)胞即間充質(zhì)干細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)9)中的表達(dá)已有報道，這提示其與這些組織干細(xì)胞的性質(zhì)、例如未分化能力的維持等相關(guān)。hDlk-Ι的這種局限于胎兒期的細(xì)胞和干細(xì)胞中表達(dá)的模式，以及具有EGF樣基序的基因/基因產(chǎn)物的家族(Notch受體，Notch配體(δ，Jagged, serrate)等)一般通過EGF樣基序介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用來控制細(xì)胞的增殖和分化，由此提示hDlk-Ι也具有這種功能。事實上，已知隨著脂肪前體細(xì)胞的分化而表達(dá)降低，而且若在脂肪前體細(xì)胞中強制表達(dá)hDlk-Ι基因，則脂肪分化被抑制(非專利文獻(xiàn)2)。但是，目前，與hDlk-Ι相互作用的分子(配體)的詳細(xì)情況尚不清楚。
另一方面，據(jù)報道hDlk-Ι基因及其基因產(chǎn)物在各種癌和腫瘤中也以高頻率表達(dá)。迄今為止，作為已確認(rèn)其表達(dá)的癌的種類，在實體癌中，已知有神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、I型神經(jīng)纖維瘤病、小細(xì)胞肺癌、肝癌、腎癌和卵巢癌(專利文獻(xiàn)1、2和非專利文獻(xiàn)1、3、10、11、12、13、14)，在血癌中，已知有骨髓增生異常綜合征(專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)15、16)和急性髓系白血病(非專利文獻(xiàn)16)。據(jù)報道如果在紅白血病細(xì)胞株(erythroleukemia) K562細(xì)胞中導(dǎo)入hDlk-Ι基因，貝U細(xì)胞增殖受到促進(非專利文獻(xiàn)16)，同樣，如果在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中導(dǎo)入hDlk-Ι基因，不僅細(xì)胞增殖被促進，而且細(xì)胞的接觸抑制也喪失，獲得錨著非依存性的(anchorage-dependent)細(xì)胞增殖能力，這提示hDlk-Ι與致癌之間的關(guān)聯(lián)性(非專利文獻(xiàn)17)。<專利文獻(xiàn)>專利文獻(xiàn)1:W0 2005/052156專利文獻(xiàn)2:TO 02/081625專利文獻(xiàn)3:日本特開2001-269174號<非專利文獻(xiàn)>非專利文獻(xiàn)I:Laborda, J.et al.，J.Biol.Chem.，vol.268 (6)，p.3817-3820(1993)
非專利文獻(xiàn)2:Smas，C.M.et al., Cell, vol.73 (4) ,p.725-734 (1993)非專利文獻(xiàn)3: He I man, L.J.et a1., Pr o c.Natl.Acad.Sc1.USA, vol.84, p.2336-2339 (1987)非專利文獻(xiàn)4:Maruyama, K.et al., Unpublished, Genebank accession number D16847 (1993)非專利文獻(xiàn)5:Halder, S.K.et al., Endocrinology, vol.139, p.3316-3328( 1998)非專利文獻(xiàn)6:Fay, T.N.et al., Eur.J.0bstet.Gynecol.Reprod.Biol., vol.29, p.73-85 (1988)非專利文獻(xiàn)7:Tanimizu, N.et a1., Gene ExpressionPatterns, vol.5, p.209-218 (2004)非專利文獻(xiàn)8: Jensen, CH.et al., Am.J.Pathol., vol.164 (4)，p.1347-1359(2004)非專利文獻(xiàn)9:Abdallah, B.M.et al., J.Bone Miner.Res., vol.19(5), p.841-852(2004)非專利文獻(xiàn)10:Jensen, C.H.et al., Br.J.Dermatol., vol.140 (6), p.1054-1059(1999)非專利文獻(xiàn)11 Jensen, C.H.et al., Tumour Biol., vol.20(5), p.256-262( 1999)非專利文獻(xiàn)12:Yin, D.et al.，Int.J.0ncol.，vol.24 (4)，p.1011-1015 (2004)非專利文獻(xiàn)13:Yin，D.et al., Oncogene, vol.25 (13)，p.1852-1861 (2006)非專利文獻(xiàn)14:Fukuzawa, R.et al., J.Clin.Pathol., vol.58, p.145-150 (2006)非專利文獻(xiàn)15:Miyazato, A.et al., Blood, vol.98, p.422-427 (2001)非專利文獻(xiàn)16:Sakajiri, S.et al., Leukemia, vol.19 (8), p.1404-1410 (2005)非專利文獻(xiàn)17:Yin，D.et al., Oncogene, vol.25 (13)，p.1852-1861 (2006)

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，在正常組織中，hDlk-Ι的表達(dá)局限于胎兒期的細(xì)胞或干細(xì)胞；癌組織中，hDlk-Ι則在各種腫瘤中高頻率表達(dá)，并且hDlk-Ι是細(xì)胞膜蛋白/分泌蛋白，由此認(rèn)為hDlk-Ι在各種腫瘤的治療等中是好的靶標(biāo)。并認(rèn)為以該hDlk-Ι為靶標(biāo)時，抗hDlk-Ι抗體是有用的。因此，本發(fā)明要解決的問題在于提供具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1抗體，尤其是在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1單克隆抗體。而且，還在于提供產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、該抗體與藥劑的復(fù)合體、腫瘤的診斷用或治療用藥物組合物、腫瘤的檢測方法、腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒。本發(fā)明人為了解決上述問題進行了積極的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與人Dlk-1特異性反應(yīng)的抗體(尤其是抗人Dlk-1單克隆抗體)，其具有抗腫瘤活性；以及該抗體與各種藥劑的復(fù)合體(免疫結(jié)合物(immunoconjugate)),并確認(rèn)了它們在體內(nèi)具有抗腫瘤活性。而且，還發(fā)現(xiàn)這些抗體和復(fù)合體對于腫瘤的治療、診斷和檢測有用，從而完成本發(fā)明。即，本發(fā)明內(nèi)容如下。( I)在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1的抗體。上述腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。在上述(I)的抗體中，抗腫瘤活性例如可以例舉腫瘤血管生成抑制活性。上述(I)所述的抗體，例如，可以例舉多克隆抗體和單克隆抗體。上述(I)所述的抗體，例如，可以例舉H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3的氨基酸序列依次分別為序列號30 32所示的氨基酸序列`、和/或L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列依次分別為序列號33 35所示的氨基酸序列。作為本發(fā)明的抗體，可以例舉雜交瘤所產(chǎn)生的抗體、基因重組抗體等。所謂雜交瘤，是指使通過對人以外的哺乳動物免疫抗原而獲得的B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進行細(xì)胞融合而獲得的、產(chǎn)生具有所希望的抗原特異性的抗體的細(xì)胞。作為基因重組抗體，包括嵌合抗體(人源化嵌合抗體)、人化抗體、人抗體或它們的抗體片段等通過基因重組制備的抗體。基因重組抗體中，具有單克隆抗體的特征、抗原性低、血中半衰期延長的抗體優(yōu)選作為治療藥。其中，作為嵌合抗體，例如，可以例舉H鏈V區(qū)域的氨基酸序列由序列號23所示的氨基酸序列構(gòu)成，L鏈V區(qū)域的氨基酸序列由序列號25所示的氨基酸序列構(gòu)成。(2)由保藏號為FERM BP-10707的雜交瘤產(chǎn)生的抗人Dlk-1的單克隆抗體。(3)由保藏號為FERM BP-10899的雜交瘤產(chǎn)生的抗人Dlk-1的單克隆抗體。(4)由保藏號為FERM BP-10900的雜交瘤產(chǎn)生的抗人Dlk-1的單克隆抗體。上述(I) (4)中所述的抗體，例如，可以例舉與序列號2所示的人Dlk-1的氨基酸序列中的第26位 第85位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域、第92位 第167位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域、或第131位 第244位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域中的至少一部分結(jié)合(識別該部分)的抗體。(5)作為上述(I) (4)中所述的抗體，例如，可以例舉與由保藏號為FERMBP-10707、FERM BP-10899或FERM BP-10900的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合(識別)的部位(例如表位)結(jié)合的抗體。(6)來源于上述(I) (5)中任意一項所述的抗體的抗體片段。上述(6)所述的抗體片段，可以例舉例如含有序列號30 32所示的氨基酸序列的抗體片段，具體而言可以例舉含有序列號23所示的氨基酸序列的抗體片段。上述(6)所述的抗體片段，例如，可以例舉含有序列號33 35所示的氨基酸序列的抗體片段，具體而言可以例舉含有序列號25所示的氨基酸序列的抗體片段。(7)產(chǎn)生上述(I)所述的抗體的雜交瘤。(8)保藏號為FERM BP-10707的產(chǎn)生抗人Dlk-1的單克隆抗體的雜交瘤。(9)保藏號為FERM BP-10899的產(chǎn)生抗人Dlk-1的單克隆抗體的雜交瘤。(10)保藏號為FERM BP-10900的產(chǎn)生抗人Dlk-1的單克隆抗體的雜交瘤。(11)含有上述(I) (5)中任意一項所述的抗體和具有抗腫瘤活性和/或細(xì)胞殺傷活性的化合物的抗體-藥劑復(fù)合體。(12)含有上述(6)所述的抗體片段和具有抗腫瘤活性和/或細(xì)胞殺傷活性的化合物的抗體片段-藥劑復(fù)合體。 在上述(11)和(12 )所述的復(fù)合體中，腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。在上述(11)和(12)所述的復(fù)合體中，抗腫瘤活性例如可以例舉腫瘤血管生成抑制活性。(13)含有選自于由上述(I) (5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種的藥物組合物。上述(13)所述的組合物例如可以例舉用于腫瘤的治療的組合物，作為腫瘤的治療，例如，可以例舉抑制腫瘤血管生成。而且，該組合物可以例舉例如沒有體重減少的副作用的組合物。上述(13)所述的組合物可以例舉例如用于腫瘤的診斷的組合物。在上述(13)所述的組合物中，腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。(14)含有選自于由上述(I) (5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種的腫瘤治療劑。上述(14)所述的治療劑，例如，可以例舉沒有體重減少的副作用的治療劑。在上述(14)所述的治療劑中，腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。(15)含有選自于由上述(I) (5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種的腫瘤血管生成抑制劑。上述(15)所述的抑制劑，例如，可以例舉沒有體重減少的副作用的抑制劑。上述(15 )所述的抑制劑中，腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。(16)含有選自于由上述(I) (5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種的腫瘤診斷劑。
上述(16)所述的診斷劑中，腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。(17)—種腫瘤的檢測方法,其特征在于,使選自于由上述(I) (5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種與從生物體采集的試樣反應(yīng)，檢測反應(yīng)的抗體的信號。上述腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。(18)—種腫瘤的診斷和/或治療方法，其包括向患者給予選自于由上述(I) (5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種，或給予上述(13)的藥物組合物。上述腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。作為上述(18)的方法，例如，可以例舉通過阻礙或抑制腫瘤的血管生成而進行腫瘤治療的方法。(19)腫瘤的診斷用和/或治療用的上述(I) (5)中任意一項所述的抗體、上述
(6)所述的抗體片段、或上述(11)或(12)所述的復(fù)合體。上述腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。(20)上述(I) (5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段、或上述(11)或(12)所述的復(fù)合體在制備用于診斷和/或治療腫瘤的藥物中的用途。上述腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。(21)含有選自于由上述(I) (5)中任意一項所述的抗體、上述(6)所述的抗體片段和上述(11)或(12)所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種的腫瘤的檢測用、診斷用或治療用試劑盒。上述腫瘤例如可以例舉選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。


圖1是表示在使用表達(dá)hDlk-Ι的肝癌細(xì)胞株(Huh-7-hDlk細(xì)胞)的異種移植治療(Xenograft Treatment)模型中，給予公知的(W0 2005/052156)抗hDlk-Ι單克隆抗體3個克隆(1C1、4C4、31C4)時的結(jié)果的圖。各抗體在第I天(Dayl)、第4天(Day4)、第7天(Day7)和第10天(DaylO)共計4次(箭頭)進行腹腔內(nèi)給藥。A:大鼠 IgG (對照組)(#),1C1 (O)B:大鼠 IgG (對照組)(#),4C4 (O)
C:大鼠 IgG (對照組)(#),31C4 (O)在A C中，各組的個體數(shù)用N表示，各測定值(腫瘤體積)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。這些實驗至少進行3次獨立的實驗。任意一個情況下，對于在裸小鼠皮下建立的肝癌都看不到抗腫瘤活性。
圖2是在使用Huh-7-hDlk細(xì)胞的異種移植治療模型中，評價新抗hDlk_l單克隆抗體克隆D1-2-14 (小鼠IgGl)的抗腫瘤活性的圖。A:經(jīng)時表示對照組(小鼠IgG)和D1-2-14給藥組的腫瘤生長(平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差)。箭頭表示給予抗體(20mg/kg體重,腹腔內(nèi)給藥)。*P〈0.01 (通過Student’s t檢驗)B:A的試驗中，把第14天(Dayl4)(實驗最后一天)時各小鼠中的腫瘤重量作圖而得的圖。各圖上所示的數(shù)值為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P〈0.01 (通過Student’ S t檢驗)C:表示在獨立的其它實驗中評價D1-2-14的抗腫瘤活性的結(jié)果。*P〈0.01 (通過Student’ s t 檢驗)圖3是在使用Huh-7-hDlk細(xì)胞的異種移植治療模型中，評價A:克隆2-13 (大鼠 IgG2b)、B:克隆 BA-1-3D (小鼠 IgG2a)、C:克隆 D1-6 (小鼠 IgGl)、D:克隆 M3-1 (小鼠IgGl)的抗腫瘤活性的圖。腫瘤體積用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，星號表示差異顯著性檢驗(*Ρ〈0.01, **Ρ〈0.05,通過 Student’ s t 檢驗)的結(jié)果。圖4是表示抗hDlk-Ι單克隆抗體(克隆2-13)在采用表達(dá)hDlk-Ι的大腸癌細(xì)胞株(SW480-hDlk細(xì)胞)的異種移植治療模型中的抗腫瘤活性的圖。將SW480-hDlk細(xì)胞移植到裸小鼠皮下，建立大腸癌組織。在箭頭指示的時間點進行腹腔內(nèi)給予抗體(20mg/kg體重)。腫瘤體積用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(*P〈0.01, **P〈0.05,通過Student’ s t檢驗)。圖5是表示使用HEK293_hDlk細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)進行的抗hDlk_l單克隆抗體反應(yīng)性的圖。各圖上所示的編號表示克隆編號。涂黑的部分是同種型對照抗體。黑線是抗hDlk-Ι單克隆抗體。圖6是表示采用Huh-7-hDlk細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)進行的抗hDlk-Ι單克隆抗體的反應(yīng)性的圖。各圖上所示的編號表示克隆編號。涂黑的部分是同種型對照抗體。黑線是抗hDlk-Ι單克隆抗體。
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圖7是為分析抗hDlk-Ι單克隆抗體所識別的表位而制備的缺失了各EGF樣基序的突變體的示意圖。圖8是表示克隆D1-2-14的表位分析的結(jié)果的圖。A:在C0S-7細(xì)胞中通過脂質(zhì)體瞬時導(dǎo)入所述hDlk-Ι基因的突變體基因，24 72小時后進行FAC S分析的圖(左:小鼠IgGl、右:D1-2-14)。設(shè)門部分表示克隆D1-2-14所識別的各突變體表達(dá)細(xì)胞。B:是用陽性對照(抗hDlk-Ι多克隆抗體)和克隆D1-2-14對表達(dá)EGF (1-2)的C0S-7細(xì)胞的涂片標(biāo)本進行免疫染色的照片。染成茶褐色的部分表示EGF (1-2)的表達(dá)。圖9是表示克隆D1-6、BA-1-3D和2_13的表位分析的結(jié)果的圖。A:是在C0S-7細(xì)胞中通過脂質(zhì)體瞬時導(dǎo)入所述hDlk-Ι基因的突變體基因，24 72小時后進行FACS分析的圖。設(shè)門部分表示各克隆識別的各突變體表達(dá)細(xì)胞。B:是用克隆D1-6、BA-1-3D和2-13對表達(dá)EGF (1-2)的C0S-7細(xì)胞的涂片標(biāo)本進行免疫染色的照片。箭頭表示的染成茶褐色的部分表示EGF (1-2)的表達(dá)。圖10是表示克隆M3-1通過FACS進行表位分析的結(jié)果的圖。在C0S-7細(xì)胞中通過脂質(zhì)體瞬時導(dǎo)入所述hDlk-Ι基因的突變體基因，24 72小時后進行FACS分析的圖。設(shè)門部分表示克隆D1-2-14所識別的各突變體表達(dá)細(xì)胞。圖11是表示抗hDlk-Ι單克隆抗體結(jié)合抗原后的內(nèi)化活性的分析結(jié)果的圖。
A:使HEK293-hDlk細(xì)胞與抗hDlk_l單克隆抗體(克隆M3_l、M1-290和M3-4)反應(yīng)(4°C，20分鐘)，用PBS清洗2次后，于37°C進行圖中所述時間的孵育。然后，使之與PE標(biāo)記抗小鼠IgG反應(yīng)，進行FACS分析。數(shù)值用相對值表示，所述相對值為以不孵育時(O分鐘)的平均螢光強度作為100%時的相對值。B:是表示使 FITC 標(biāo)記的克隆 M3-1 (FITC-M3-1)與 HEK293_hDlk 細(xì)胞反應(yīng)(4°C，20分鐘)，用PBS清洗2次后，于37°C下孵育120分鐘時的平均螢光強度的變化的圖。黑柱表示:像A那樣，使未標(biāo)記的M3-1與細(xì)胞反應(yīng)后，于37°C下孵育120分鐘，與PE標(biāo)記的抗小鼠IgG反應(yīng)時的平均螢光強度的變化。圖12是表示羅丹明標(biāo)記的抗hDlk-Ι單克隆抗體結(jié)合抗原后的內(nèi)化活性的分析結(jié)果的圖。A:是使 HEK-293-hDlk 細(xì)胞與羅丹明標(biāo)記-M3-1 (Rho-M3_l)反應(yīng)(4°C，20 分鐘)，用PBS清洗2次后，立即制備涂片標(biāo)本，用螢光顯微鏡觀察Rho-M3-l的定位的照片。橙色所示的部分表示Rho-M3-l的定位,觀察到在細(xì)胞膜中定位。B E:是使 Rho-M3-l (B)、Rho-D1-1 (C)、Rho-Ml-290 (D)和 Rho-M3_4 (E)與HEK293-hDlk細(xì)胞反應(yīng)，用PBS清洗2次后，于37°C下孵育15分鐘后，制備涂片標(biāo)本，用螢光顯微鏡觀察各克隆的定位的照片。觀察到識別相同表位(EGF4-6)的Rho-M3-l和Rho-D1-1均進入到細(xì)胞內(nèi)，以點狀定位的樣子。

圖13是表示結(jié)合了阜草素(Saporin)的抗hDlk-Ι單克隆抗體對于Huh-7-hDlk細(xì)胞和SK-N-Fl細(xì)胞的細(xì)胞損傷活性的圖。A:是表示對照(小鼠IgG-皂草素(IgG-SAP))和M3-1-SAP對Huh_7_hDlk細(xì)胞的效果的圖。縱軸用相對值表示，所述相對值為以未添加時的細(xì)胞的存活率為100%時的相對值(N=3，平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差)。B:是表示對照(IgG-SAP)、M3-l-SAP 和 M1-290-SAP 對 SK-N-Fl 細(xì)胞的效果的圖。圖14是表示Huh-7-hDlk細(xì)胞的異種移植模型中，給予小鼠IgG (20mg/kg體重)、M3-1-SAP (5mg/kg體重)和M1-290-SAP (5mg/kg體重)時的、A:給藥后的各小鼠的體重變化、B:小鼠存活率的圖。值用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。箭頭表示給予抗體時間。圖15是表示Huh-7-hDlk細(xì)胞的異種移植模型中，腹腔內(nèi)給予小鼠IgG(.；N=8)和M3-1-SAP (O:N=8)時的腫瘤生長抑制效果的圖。箭頭表示給予抗體時間。值用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(*Ρ〈0.01, **Ρ〈0.05,通過 Student’ s t 檢驗)。圖16是表示Huh-7-hDlk細(xì)胞的異種移植模型中，腫瘤內(nèi)給予A和B即小鼠IgG(.:N=5)和M3-1-SAP (O:N=5) (40 μ g)時的腫瘤生長抑制效果(A)和體重變化(B)的圖和腹腔內(nèi)給予C和D即PBS (.:N=4)和順鉬(Cisplatin) (O:N=4) (5mg/kg體重)時的腫瘤生長抑制效果(C)和體重變化(D)的圖。在任意一張圖中，箭頭均表示給予抗體時間，值用平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(*P〈0.01，#P〈0.05，通過Student’ s t檢驗)。圖17是表示用抗hDlk-Ι抗體對人大腸癌組織陣列(Cybrdi公司制、CC05-01-001)進行免疫染色時的代表例的照片。茶褐色部分表示用抗hDlk-Ι抗體染色的癌組織。hDlk-Ι陰性是指如N0.48的切片(69歲男性，腺癌，階段III)所示，完全沒有觀察到染色的區(qū)域的切片。N0.19 (55歲女性，腺癌，階段II)顯示出非常強的染色性，將顯示出與N0.19同等的染色性的切片作為hDlk-Ι強陽性。另外，將N0.25 (75歲男性，腺癌，階段II)所示那樣的、可明確地確認(rèn)為hDlk-Ι陽性但染色性弱的切片作為hDlk-Ι弱陽性。圖18是表示用抗hDlk-Ι抗體對人乳腺癌組織陣列(Cybrdi公司制、CC08-02-002)進行免疫染色時的代表例的照片。茶褐色部分表示用抗hDlk-Ι抗體染色的
癌組織。照片上面部分是組織陣列中所含的正常乳腺組織被抗hDlk-Ι抗體染色時的照片。左:N0.07 (68歲女性，正常乳管；hDlk-l陰性)、右:N0.01 (43歲女性，正常乳腺小葉；hDlk-Ι弱陽性)。箭頭表示hDlk-Ι弱陽性的部位。照片下面部分表示浸潤性導(dǎo)管癌患者的照片。左:N0.08 (45歲女性，階段II;hDlk-Ι陰性)，中央:N0.56 (28歲女性，階段II ;hDlk_l弱陽性)，右:N0.20 (59歲女性，階段II;hDlk-l強陽性)。圖19是表示在Huh-7-dlk細(xì)胞異種移植治療模型中，克隆D1-2-14的用量依賴性抗腫瘤活性的圖。圖20是表示在SK-N-Fl細(xì)胞異種移植治療模型中，克隆DI_2_14的用量依賴性的抗腫瘤活性的圖。A:表示開始給予抗體以后的腫瘤生長。腫瘤體積用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(*Ρ〈0.01, **Ρ〈0.05,通過 Student’ s t 檢驗)。B:是表示給予抗體后第23天(Day23)時摘出的癌組織的重量的圖。圖21是表示克隆D1-2-14H鏈(重鏈)可變區(qū)(VH)的cDNA堿基序列(序列號22)和推定氨基酸序列(序列號23)的圖。信號肽用西文斜體字表示。畫了雙下劃線的谷氨酸(E)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。CDR序列(下劃線)按照Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH PublicationN0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定義?？寺1-2-14VH的⑶Rl 3的氨基酸序列依次分別不于序列號30 32。圖22是表示克隆D1-2-14L鏈(輕鏈)可變區(qū)(VL)的cDNA堿基序列(序列號24)和推定氨基酸序列(序列號25)的圖。信號肽用歐文斜體字表示。畫了雙下劃線的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸殘基。⑶R序列(下劃線)按照Kabat等人(1991 ;上述)的定義。克隆D1-2-14VL的⑶Rl 3的氨基酸序列依次分別示于序列號33 35。圖23是表示克隆D1-2-14VH基因的堿基序列(序列號26)和氨基酸序列(序列號27)的圖。5’末端添加了 SpeI位點，3’末端添加了 Hind III位點(分別添加了下劃線。)。用歐文斜體字文字表示的堿基序列表示相當(dāng)于內(nèi)含子的序列。圖24是表示克隆D1-2-14VL基因的堿基序列(序列號28)和氨基酸序列(序列號29)的圖。在5’末端添加了 Nhe I位點，在3’末端添加了 EcoR I位點(分別添加了下劃線。)。用歐文斜體字文字表示的堿基序列表示相當(dāng)于內(nèi)含子的序列。

圖25是嵌合D1-2-14基因表達(dá)載體(pChD1-2-14)的概略圖。該載體從SalI位點起順時針地包括由人巨細(xì)胞病毒主要即刻早期動子(human cytomegalovirus (CMV)majorimmediate early promoter)和用于抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄開始的增強子起始的重鏈翻譯單元。接著CMV區(qū)域的是VH外顯子、人Y I重鏈恒定區(qū)(夾著內(nèi)含子地包含CH1、鉸鏈區(qū)域、CH2和CH3的外顯子)的基因序列和CH3，接著是mRNA加工的聚A位點。重鏈基因序列后存在由CMV啟動子和增強子起始的輕鏈翻譯單元，接著是與VL外顯子和在上游有內(nèi)含子部分的人K鏈恒定區(qū)的外顯子(CL)以及K基因的聚A信號。該輕鏈基因后接SV40早期啟動子、大腸桿菌來源的黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)基因(xanthine guaninephosphoribosyl transferase (gpt) gene)和含有SV40的聚A位點的片段。最后,該質(zhì)粒具有含有細(xì)菌的復(fù)制起點和β -內(nèi)酰胺酶基因的PUC19質(zhì)粒的一部分。圖26是小鼠D1-2-14和嵌合D1-2-14 (ChDI_2_14)的用SDS-PAGE展開后并經(jīng)CBB染色的圖。MW表示分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物，箭頭分別表示條帶的分子量(kD)。圖27是表示利用純化FA-1 (hDlk_l細(xì)胞外區(qū)域)的固相ELISA的、D1-2-14和ChD1-2-14的抗原結(jié)合活性的圖。〇表示小鼠IgGl抗體(克隆D1-2-14)，.表示嵌合抗體(ChD1-2-14)。圖28是表示使用HEK293-hDlk細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)進行的D1-2-14和ChD1-2-14的反應(yīng)性的圖。涂黑的圖是同種型對照抗體，黑線(白色空心)圖分別是D1-2-14和 ChD1-2-14。圖29是用流式細(xì)胞術(shù)分析人肝癌細(xì)胞株中細(xì)胞表面Dlk-1的表達(dá)的圖。標(biāo)號為“I”的線表不小鼠IgGl,標(biāo)號為“2”的線表不抗人Dlk-1抗體,表不將各細(xì)胞染色時的圖。圖30是用流式細(xì)胞術(shù)分析人乳腺癌細(xì)胞株中的細(xì)胞表面Dlk-1的表達(dá)的圖。標(biāo)號為“I”的線表不小鼠IgGl,標(biāo)號為“2”的線表不抗人Dlk-1抗體,表不將各細(xì)胞染色時的圖。圖31是用流式細(xì)胞術(shù)分析人白血病細(xì)胞株中的細(xì)胞表面Dlk-1的表達(dá)的圖。標(biāo)號為“I”的線表不小鼠IgGl,標(biāo)號為“2”的線表不抗人Dlk-1抗體,表不將各細(xì)胞染色時的圖。圖32是表示Huh-7-dl k細(xì)胞異種移植治療模型中的摘出的癌組織中的Flk-1/VEGF-R2的免疫組化染色的圖。A:是分別用抗小鼠Flk-1/VEGF_R2抗體對取自(摘自)小鼠IgG給藥組(對照組)和克隆D1-2-14給藥組的癌組織的新鮮冷凍切片進行免疫染色的照片(物鏡200倍)。照片中，箭頭狀的標(biāo)記(▲)示出的區(qū)域表示Flk-1/VEGF-R2陽性的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞。B:是用抗小鼠Flk-1/VEGF-R2抗體對從IgG給藥組(2個個體)和D1-2-14給藥組(4個個體)分別采集的新鮮冷凍切片進行免疫染色，在各個切片中，對于物鏡200倍下8 13個視場(IgG給藥組:共21個視場、D1-2-14給藥組:共35個視場)，對Flk_l/VEGF_R2陽性的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)，表示每I個視場的細(xì)胞數(shù)的圖(*p〈0.01，通過Student’ st檢驗)。圖33是表示Huh-7-dlk細(xì)胞異種移植治療模型中摘出的癌組織中的Flk-1/VEGF-R2的基因表達(dá)的圖。A:從IgG給藥組(N=7)和DI_2_14給藥組(N=7)分別摘出腫瘤后，用Trizol試劑提取RNA，然后合成第I鏈cDNA，分別使用各第I鏈cDNA作為模板，通過PCR法(30個循環(huán))確認(rèn)小鼠Flk-1/VEGF-R2 (mFlk_l)和小鼠/人GAPDH (GAPDH)的基因表達(dá)的電泳圖像的圖。下圖是用NIH image定量mFlk_l和GAPDH的PCR擴增產(chǎn)物的條帶并以比例(mFlk-1/GAPDH)表示的圖。B:是除了通過PCR法進行35個循環(huán)的擴增反應(yīng)以外，與A同樣情況的圖。
具體實施例方式以下，對本發(fā)明進行詳細(xì)地說明。本發(fā)明的范圍不局限于這些說明，在不損害本發(fā)明的主要內(nèi)容的范圍內(nèi)可以在以下的例示的基礎(chǔ)上適當(dāng)變更而實施。而且，本說明書包括作為本申請優(yōu)先權(quán)主張的基礎(chǔ)的日本特愿2006-305355號說明書的全部內(nèi)容。而且，本說明書中引用的所有的出版物，例如現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)和公開公報、專利公報以及其它的專利文獻(xiàn)作為參照并入本說明書。1.本發(fā)明的概要如前所述，人Dlk-1 (delta-like I homolog (果蜆);hDlk_l)是全長為 383 個氨基酸殘基的單次跨膜型的I型膜蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞外區(qū)域具有6個EGF樣基序。而且，已知hDlk-Ι基因及其基因產(chǎn)物在各種癌和腫瘤細(xì)胞中以高頻率表達(dá)。一般來說，由于難以制得在體內(nèi)顯示抗腫瘤活性的抗體，因此即使制備抗hDlk-Ι單克隆抗體，大多在體外具有抗腫瘤活性，但在體內(nèi)并不顯示出相同活性。而且，由于針對hDlk-Ι的癌細(xì)胞的增殖等功能的區(qū)域、hDlk-Ι的配體(或受體)和細(xì)胞內(nèi)信號傳遞途徑等尚不清楚，縮小靶點來有效地進行抗體制備也基本是不可能的。這種狀況下，本發(fā)明中，通過從多個克隆中進行篩選，成功地獲得了在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的克隆。

首先，本發(fā)明人通過使用公知的抗hDlk-Ι抗體的免疫組織化學(xué)，在迄今為止確認(rèn)了 hDlk-Ι的表達(dá)的前述癌和腫瘤細(xì)胞以外，還新發(fā)現(xiàn)了 hDlk-Ι在大腸癌和乳腺癌中也表達(dá)。然后，本發(fā)明人以制備可以在個體水平上使得表達(dá)hDlk-Ι的癌細(xì)胞死亡或可以抑制腫瘤生長的抗hDlk-Ι抗體，即在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗hDlk-Ι抗體作為目的，重新制備了約100個克隆的抗hDlk-Ι單克隆抗體。而且，就這些克隆，將各種癌細(xì)胞株移植到裸小鼠皮下，用這樣建立的荷瘤小鼠進行體內(nèi)的藥效(抗腫瘤作用)評價。其結(jié)果是，成功地獲得了多個顯示出顯著的腫瘤生長抑制活性的克隆(克隆名:D1-2-14、2-13、BA-1-3D, D1-6、M3-1)。而且，本發(fā)明人在上述抗hDlk-Ι抗體中發(fā)現(xiàn)了在向表達(dá)hDlk-Ι的細(xì)胞內(nèi)的移動能力(內(nèi)化活性)方面優(yōu)異的抗體，制備出含有這種抗體和具有抗腫瘤活性和細(xì)胞殺傷活性的化合物的抗體-藥劑復(fù)合體。該復(fù)合體，作為所謂的免疫結(jié)合物，其對目標(biāo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物送達(dá)能力優(yōu)異。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用具有上述抗腫瘤活性的抗hDlk-Ι抗體和抗體-藥劑復(fù)合體，對于各種腫瘤的治療或腫瘤的診斷和檢測有用。2.抗hDlk-Ι抗體的制作(I)抗原的制備hDlk-Ι的氨基酸序列(序列號2)的信息，例如在NCBI (GenBank)的網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上以“登錄號:NP_003827”公布。而且,編碼hDlk-1的氨基酸序列的堿基序列(序列號I)的信息在同一網(wǎng)站上以“登錄號:NM 003836”公布。作為抗原，可以使用含有hDlk-Ι的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的多肽或肽(也簡稱為肽)，可優(yōu)選使用含有hDlk-Ι的細(xì)胞外區(qū)域(FA-1)的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部)的肽。hDlk-Ι的細(xì)胞外區(qū)域為如前所述的含有6個EGF樣基序(EGF-1 EGF-6)的區(qū)域，為含有序列號2所示的氨基酸序列中的第26位 第244位的氨基酸的區(qū)域，優(yōu)選為序列號2所示的氨基酸序列中的“第24位”至“第248 285位”的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域(約225 262個氨基酸殘基)。其中，就作為抗原使用的肽來說，上述“氨基酸序列的至少一部分”的長度沒有特別限定，例如優(yōu)選含有6個EGF樣基序中的I個或2個以上的區(qū)域。更優(yōu)選例如含有EGF-1和EGF-2的區(qū)域(即序列號2所示的氨基酸序列中的第26位 第85位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域)、含有EGF-3和EGF-4的區(qū)域(即序列號2所示的氨基酸序列中的第92位 第167位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域)、和含有EGF-4、EGF-5和EGF-6的區(qū)域(即序列號2所示的氨基酸序列中的第131位 第244位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域)。作為抗原的肽的制作方法可以是化學(xué)合成，也可以通過采用大腸桿菌等的基因工程法合成，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。進行肽的化學(xué)合成時，可以通過肽合成的公知方法進行合成。而且，其合成也可以使用固相合成法和液相合成法中的任意一種。還可以使用市售的肽合成裝置(例如，島津制作所制:PSSM-8等)。在用基因工程學(xué)方式合成肽時，首先設(shè)計并合成編碼該肽的DNA。該設(shè)計和合成例如可以使用以含有全長hDlk-Ι基因的載體等作為模板，使用設(shè)計為可以合成所希望的DNA區(qū)域的引物，通過PCR法進行。然后，通過將上述DNA連接到適當(dāng)?shù)妮d體上而獲得蛋白質(zhì)表達(dá)用重組載體，將該重組載體導(dǎo)入宿主中并使得目的基因可以表達(dá)，由此獲得轉(zhuǎn)化子(Sambrook J.et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001)。使用可以在宿主微生物中自我增殖的噬菌體或質(zhì)粒作為載體。而且還可以使用動物病毒、昆蟲病毒載體。重組載體的制作可如下進行，即用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖袛嗉兓腄NA，插入適當(dāng)?shù)妮d體DNA的限制性酶位點等中而與載體連接。作為轉(zhuǎn)化時使用的宿主，只要是可以表達(dá)目的基因的宿主即可，沒有特別的限定。例如，可以例舉細(xì)菌(大腸桿菌、枯草桿菌等)、酵母、動物細(xì)胞(C0S細(xì)胞、CHO細(xì)胞等)、昆蟲細(xì)胞或昆蟲。還可以使用山羊等哺乳動物作為宿主。向宿主導(dǎo)入重組載體的方法是公知的。然后，培養(yǎng)前述轉(zhuǎn)化子，從其培養(yǎng)物中收集作為抗原使用的肽?！芭囵B(yǎng)物”是指(a)培養(yǎng)上清、(b)培養(yǎng)細(xì)胞或者培養(yǎng)菌體或其破碎物中的任意一種。培養(yǎng)后，目的肽在菌體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生時，通過破碎菌體或細(xì)胞來提取肽。而且，目的肽在菌體外或細(xì)胞外產(chǎn)生時，直接使用培養(yǎng)液或通過離心分離等除去菌體或細(xì)胞。然后，可以通過單獨使用可以在肽的分離純化中使用的一般的生物化學(xué)方法，例如硫酸銨沉淀、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等或?qū)⑦@些方法組合使用，來分離純化目的肽。本發(fā)明中，還可以使用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，通過體外翻譯獲得作為抗原的肽。此時，可以使用以RNA作為模板的方法和以DNA作為模板的方法(轉(zhuǎn)錄/翻譯)這2種方法。作為無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，可以使用市售的系統(tǒng)，例如Expressway 系統(tǒng)(Invitrogen公司)、PURESYSTEM (注冊商標(biāo)；post genome研究所)、TNT系統(tǒng)(注冊商標(biāo)；Promega公司)
坐寸ο如上所述獲得的肽還可以結(jié)合到適當(dāng)?shù)妮d體蛋白質(zhì)，例如牛血清白蛋白(BSA)^.孔血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)、人甲狀腺球蛋白、雞Y-球蛋白等。

另外，抗原可以是在hDlk-Ι的氨基酸序列(序列號2)或前述的序列的部分序列中缺失、置換或添加了 I個或多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的肽。例如，還可以使用hDlk-Ι的氨基酸序列或其部分序列中缺失I個或多個(優(yōu)選I個或多個(例如I個 10個，更優(yōu)選I個 5個))氨基酸，I或多個(優(yōu)選I個或多個(例如I個 10個，更優(yōu)選I個 5個))氨基酸被其它氨基酸置換，或添加了 I個或多個(優(yōu)選I個或多個(例如I個 10個，更優(yōu)選I個 5個))其它氨基酸的氨基酸序列所構(gòu)成的肽。本發(fā)明中，作為用于導(dǎo)入于細(xì)胞等的基因，可以例舉編碼hDlk-Ι蛋白質(zhì)或其部分片段的基因、或編碼其突變型的蛋白質(zhì)或片段的基因。作為這種基因，例如可以使用具有序列號I所不的喊基序列或其部分序列的基因。而且，作為用于導(dǎo)入于細(xì)胞等的基因，還可以使用與序列號I所示的堿基序列互補的序列在嚴(yán)緊條件下雜交，且編碼具有hDlk-Ι活性的蛋白質(zhì)的堿基序列或其部分序列?！皣?yán)緊條件”是指雜交后清洗時的條件，緩沖液的鹽(鈉)濃度為10 500mM，溫度為42°C 72°C，優(yōu)選上述鹽濃度為50 300mM，溫度為55 68°C的條件。為了在基因中導(dǎo)入突變，可以通過Kunkel法或帶缺口的雙鏈體(Gappedduplex)法等公知方法進行，例如使用利用定點突變法的突變導(dǎo)入用試劑盒GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen 公司 制)、TaKaRa Site-DirectedMutagenesis System (Mutan-K、Mutan-Super Express Km 等:TAKARA BIO 公司制)來進行。(2)多克隆抗體的制作將制備的抗原給予到用于免疫的哺乳動物。哺乳動物沒有特別限定，例如可以例舉大鼠、小鼠和兔等，其中優(yōu)選小鼠。每一只動 物的抗原給藥量，可以根據(jù)佐劑的有無適當(dāng)設(shè)定。作為佐劑，可以例舉弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、氫氧化鋁佐劑等。免疫主要可以通過注入到靜脈內(nèi)、腳掌、皮下、腹腔內(nèi)等來進行。而且，免疫的間隔沒有特別限定，以數(shù)天至數(shù)周的間隔優(yōu)選I周的間隔進行I 10次、優(yōu)選2 3次免疫。然后，在最后的免疫日起3 7天后，通過酶免疫測定法(ELISA或EIA)或放射性免疫測定法(RIA)等測定抗體效價，可以在出現(xiàn)所希望的抗體效價之日采血，獲得抗血清。在上述抗體的提取方法中，在需要純化抗體時，可以通過適當(dāng)選擇或組合硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等公知方法來進行純化。然后，通過ELISA法等測定抗血清中的多克隆抗體的反應(yīng)性。(3)單克隆抗體的制作(3-1)抗體產(chǎn)生細(xì)胞的提取本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體并沒有限制，但優(yōu)選為單克隆抗體。將制備的抗原給予用于免疫的哺乳動物，例如大鼠、小鼠和兔等。每只動物的抗原給藥量可以根據(jù)有無佐劑適當(dāng)設(shè)定。佐劑與上述同樣。免疫方法也與前述同樣。而且，在最后的免疫日起I 60天后，優(yōu)選為I 14天后，提取抗體產(chǎn)生細(xì)胞。作為抗體產(chǎn)生細(xì)胞，可以例舉脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞和外周血細(xì)胞等，其中優(yōu)選淋巴結(jié)細(xì)胞和脾臟細(xì)胞。(3-2)細(xì)胞融合為了獲得雜交瘤(抗體產(chǎn)生細(xì)胞株)，進行抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合。作為與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞，可以使用小鼠等動物的一般可以獲得的已建立的細(xì)胞株。作為使用的細(xì)胞株，優(yōu)選具有藥劑選擇性，具有未融合的狀態(tài)下在HAT選擇培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脫氧核苷)中無法生存而只有在與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合的狀態(tài)下可以生存的性質(zhì)的細(xì)胞株。作為骨髓瘤細(xì)胞，例如可以例舉P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8(X63)、P3-X63_Ag8.Ul (P3U1)、P3/NS I/1-Ag4-1 (NSl)和 Sp2/0_Ag 14 (Sp2/0)等小鼠骨髓瘤細(xì)胞株。骨髓瘤細(xì)胞的選擇，可以適當(dāng)考慮與抗體產(chǎn)生細(xì)胞的適合性而進行。然后，使骨髓瘤細(xì)胞與抗體產(chǎn)生細(xì)胞進行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合時，在不含血清的DMEM和RPM1-1640培養(yǎng)基等動物細(xì)胞用培養(yǎng)基中，混合I X IO6 I X IO7個/mL的抗體產(chǎn)生細(xì)胞和2 X IO5 2 X IO6個/mL的骨髓瘤細(xì)胞?？贵w產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞比(抗體產(chǎn)生細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞)沒有限制，但通常優(yōu)選為1:1 10:1，更優(yōu)選為3:1。然后，在細(xì)胞融合促進劑的存在下進行融合反應(yīng)。作為細(xì)胞融合促進劑，例如可以使用平均分子量為1000 6000道爾頓(D)的聚乙二醇等。而且,還可以使用利用電刺激(例如電穿孔)的市售的細(xì)胞融合裝置，使抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。(3-3)雜交瘤的挑選和克隆從細(xì)胞融合處理后的細(xì)胞中挑選出目的雜交瘤。作為該方法，將細(xì)胞懸浮液用例如含有胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng) 基等適當(dāng)稀釋后，接種于微板上，在各孔中加入選擇培養(yǎng)基，以后適當(dāng)更換選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。其結(jié)果是，在選擇培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)后，可以將14天前后開始生長的細(xì)胞作為雜交瘤。然后，在逐步增殖的雜交瘤的培養(yǎng)上清中，篩選是否存在與hDlk-Ι反應(yīng)的抗體。雜交瘤的篩選可以按照通常的方法，沒有特別限制。例如，可以采集已長出雜交瘤的孔中所含的培養(yǎng)上清的一部分，通過ELISA、EIA和RIA等進行篩選。融合細(xì)胞的克隆可以通過有限稀釋法等進行。通過流式細(xì)胞術(shù)等判斷與hDlk-1顯示出強反應(yīng)性的抗體，選擇產(chǎn)生該抗體的雜交瘤，建立克隆。(3-4)單克隆抗體的提取作為培養(yǎng)已建立的雜交瘤并從獲得的培養(yǎng)物中提取單克隆抗體的方法，可以采取通常的細(xì)胞培養(yǎng)法或腹水形成法等?！芭囵B(yǎng)”是指在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中使雜交瘤生長，或如下使雜交瘤在動物的腹腔內(nèi)增殖。細(xì)胞培養(yǎng)法中，可以在含有10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基等動物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，在通常的培養(yǎng)條件(例如37°C，5%C02濃度)下培養(yǎng)雜交瘤7 14天，從其培養(yǎng)上清中獲得抗體。腹水形成法的情況下，在與骨髓瘤細(xì)胞來源的哺乳動物同種系動物的腹腔內(nèi)給予約I X IO7個雜交瘤，使雜交瘤大量增殖。并且，優(yōu)選在2 3周后提取腹水。在上述抗體的提取方法中，在需要純化抗體時，可以通過適當(dāng)選擇或組合硫酸銨鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等公知方法來進行純化。(3-5)具有抗腫瘤活性的克隆的挑選本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體是在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗體。這里，“抗腫瘤活性”是指使腫瘤細(xì)胞(癌細(xì)胞)死亡的活性或抑制腫瘤生長的活性。本發(fā)明中，作為抗腫瘤活性,例如可優(yōu)選例舉腫瘤血管生成抑制活性。而且,作為本發(fā)明的抗體可以發(fā)揮抗腫瘤活性的人腫瘤(腫瘤細(xì)胞)的種類,可以例舉已確認(rèn)hDlk-Ι的表達(dá)的前述公知的人腫瘤(具體而言，實體癌有神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、I型神經(jīng)纖維瘤病、小細(xì)胞肺癌、肝癌、腎癌和卵巢癌等，血癌有骨髓發(fā)育異常綜合征和急性髓系白血病等。)和本發(fā)明人新確認(rèn)hDlk-Ι的表達(dá)的人大腸癌和人乳腺癌。其中尤其可優(yōu)選例舉大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的I種或2種以上。體內(nèi)的抗腫瘤活性的確認(rèn)，例如可以使用在小鼠的皮下移植了所希望的腫瘤細(xì)胞的荷瘤小鼠，通過對該小鼠給予前述獲得的抗體來進行。此時，抗體的給藥可以在腫瘤細(xì)胞的移植后立即進行(預(yù)防模型)，也可以在確認(rèn)移植腫瘤達(dá)到預(yù)定體積之后進行(治療模型)。給藥方法并沒有限制，例如可以3天I次，以20mg/kg體重進行腹腔內(nèi)給藥。預(yù)防模型的情況下，可以通過腫瘤形成頻率和腫瘤體積評價抗腫瘤活性的有無和水平。治療模型的情況下，可以根據(jù)腫瘤體積評價抗腫瘤活性的有無和水平。 本發(fā)明中，作為在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗hDlk-Ι抗體，例如可以優(yōu)選例舉由保藏號為FERM BP-10707的雜交瘤產(chǎn)生的抗hDlk-Ι單克隆抗體(克隆名:M3_1)，由保藏號為FERM BP-10899的雜交瘤產(chǎn)生的抗hDlk-Ι單克隆抗體(克隆名:DI_2_14)和由保藏號為FERM BP-10900的雜交瘤產(chǎn)生的抗hDlk-Ι單克隆抗體(克隆名:DI_6)等。而且，克隆名:D1-2-14的抗hDlk-1單克隆抗體作為在體內(nèi)具有高抗腫瘤活性的抗體是優(yōu)選的。其中，保藏號為FERM BP-10707 的雜交瘤命名為“Mouse-Mouse hybridoma:M3-1”，于2006年10月18日保藏，保藏號為FERM BP-10899的雜交瘤命名為“Mouse-Mousehybridoma D1-2-14”，于2007年8月21日保藏，保藏號為FERM BP-10900的雜交瘤稱為“Mouse-Mouse hybridoma D1-6”于2007年8月21日保藏，均保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)。另外，作為本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體，例如可優(yōu)選例舉H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3的氨基酸序列依次分別為序列號30 32所示的氨基酸序列、和/或L鏈V區(qū)域的CDRl 3的氨基酸序列依次分別為序列號33 35所示的氨基酸序列的抗體。作為上述H鏈V區(qū)域，例如，優(yōu)選序列號23所示的氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域，作為上述L鏈V區(qū)域，例如，優(yōu)選序列號25所示的氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域。而且，作為本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體，例如還可優(yōu)選列舉與由保藏號為FERMBP-10707.FERM BP-10899、或FERM BP-10900的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體所結(jié)合(識別)的部位(例如表位)結(jié)合的抗hDlk-Ι抗體。(3-6)抗hDlk-Ι抗體的表位 本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體的表位(抗原決定簇)只要是抗原h(huán)Dlk_l的至少一部分即可，并沒有限制，例如，優(yōu)選為序列號I所示的hDlk-Ι的氨基酸序列中的第26位 第85位的氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域(含有hDlk-Ι的EGF-1 EGF-2的區(qū)域)、第92位 第167位的氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域(含有hDlk-Ι的EGF-3 EGF-4的區(qū)域)、或第131位 第244位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域(含有hDlk-Ι的EGF-4 EGF-6的區(qū)域)中的至少一部分。其中更為優(yōu)選含有hDlk-Ι的EGF-4 EGF-6的區(qū)域和含有EGF-4 EGF-6的區(qū)域，尤其優(yōu)選含有第92位 第120位的氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域(含有hDlk-Ι的EGF-3的區(qū)域)。識別該區(qū)域(與該區(qū)域結(jié)合)的抗hDlk-Ι抗體，例如，對腫瘤細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化活性高，在后述的免疫結(jié)合物等用途中極為有用。(4)基因重組抗體和抗體片段(4-1)基因重組抗體
作為本發(fā)明的抗hDlk-1抗體的優(yōu)選方式之一，可以例舉基因重組抗體。作為基因重組抗體，沒有限制，但例如可以例舉嵌合抗體、人源化抗體和人抗體等。嵌合抗體(即人源化嵌合抗體)是小鼠源抗體的可變區(qū)連接到(接合)人來源的恒定區(qū)的抗體(參照 Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81, 6851-6855，(1984)等)，在制作嵌合體時，為了獲得這樣連結(jié)的抗體，可以通過基因重組技術(shù)容易地構(gòu)建。其中，作為小鼠源抗體的可變區(qū)，H鏈V區(qū)域例如優(yōu)選序列號23所示的氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域，L鏈V區(qū)域例如優(yōu)選序列號25所示的氨基酸序列構(gòu)成的區(qū)域。在制作人源化抗體時，通過從小鼠抗體的可變區(qū)將互補性決定區(qū)(⑶R)移植到人可變區(qū)，框架區(qū)(FR)為人來源，CDR由小鼠來源的CDR構(gòu)成，制備重構(gòu)的可變區(qū)(即CDR移植(⑶R grafting))。然后，將這些人源化的重構(gòu)的人可變區(qū)與人恒定區(qū)連結(jié)。這種人源化抗體的制作方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參照Nature, 321, 522-525 (1986) ；J.Mol.Biol.，196,901-917 (1987):Queen C et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86:10029-10033 (1989)；日本特表平4-502408號公報(日本特許第2828340號公報；Queen等人)等)。其中，作為可以在本發(fā)明的人源化抗hDlk-Ι抗體中使用的小鼠來源的CDR序列，沒有限制，例如，作為H鏈V區(qū)域的⑶Rl 3，可例舉優(yōu)選(依次分別)序列號30 32所示的氨基酸序列，作為L鏈V區(qū)域的⑶Rl 3，可以優(yōu)選例舉(依次分別)序列號33 35所示的氨基酸序列。人抗體(完全人抗體),一般是V區(qū)域的抗原結(jié)合部位即高變區(qū)(Hyper Variableregion)，V區(qū)域的其它部分和恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)具有與人的抗體相同的結(jié)構(gòu)。但是，高變部位也可以來源于其它動物。制作人抗體的技術(shù)也是公知的，已建立了通過基因工程學(xué)的手法來制作人共通的基因序列的方法。人抗體例如可以通過使用含有具有人抗體的H鏈和L鏈基因的人染色體片段的人抗體產(chǎn)生小鼠的方法(參照Tomizuka, K.et al., NatureGenetics, (1977)16, 133-143 ；Kuroiwa, Y.et.al., Nuc.Acids Res., (1998)26, 3447-3448 ；Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects, (1999)10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T.and Iijima, S.eds.),Kluwer Academic Publishers ；Tomizuka, K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, (2000) 97，722-727 等)和獲得從人抗體文庫挑選的曬菌體展示來源的人抗體的方法(參照Wormstone,1.M.et.al, InvestigativeOphthalmology&Visual Science., (2002) 43 (7) , 2301-8 ；Carmen, S.et.al., Briefingsin Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2),189-203 ；Siriwardena, D.et.al., Opthalmology, (2002) 109 (3)，427-431 等)而獲得。上述嵌合抗體、人源化抗體和人抗體，優(yōu)選為抗體Fe區(qū)域中的N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的N-乙酰葡糖胺不與巖藻糖結(jié)合的糖鏈，具體而言可以例舉在抗體分子的Fe區(qū)域中具有該巖藻糖的I位不與N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位發(fā)生α結(jié)合的糖鏈的基因重組抗體分子所構(gòu)成的抗體。如果是這種抗體，則可以使ADCC活性極大提高。而且，前述的多克隆抗體和單克隆抗體同樣優(yōu)選這一點(抗體Fe區(qū)域中N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈的特征)。(4-2)抗體片段本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體的片段也包含于本發(fā)明的抗體中。其中，本發(fā)明的抗體片段與本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體一樣，具有與hDlk-Ι結(jié)合的活性，在體內(nèi)具有抗腫瘤活性。作為該抗體的片段 ，是指抗hDlk-Ι多克隆抗體或抗hDlk-1單克隆抗體的一部分的區(qū)域(即，來源于本發(fā)明的抗hDlk-1抗體的抗體片段)，例如，可以例舉Fab、Fab’、F(ab’ ) 2、Fv (抗體可變區(qū))、單鏈抗體(H鏈、L鏈、H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域等)、scFv、雙抗體(diabody) (scFv 二聚物)、dsFv (二硫化物穩(wěn)定化V區(qū)域)和至少一部分含有互補性決定區(qū)(complementarity determining region:CDR)的月太等。Fab是用蛋白質(zhì)分解酶中的木瓜蛋白酶處理抗體分子而獲得的片段中，H鏈的N末端側(cè)約一半和L鏈全體通過二硫鍵結(jié)合的、分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。而且，還可以通過將編碼抗體的Fab的DNA插入于原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，通過將該載體導(dǎo)入到原核生物或真核生物而使之表達(dá)，制造Fab。F (ab’)2是用蛋白質(zhì)分解酶中的胃蛋白酶處理抗體分子而獲得的片段中，F(xiàn)ab通過鉸鏈區(qū)的二硫鍵結(jié)合的稍大的、分子量約為10萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。而且，還可以通過后述的使Fab形成硫醚鍵或二硫鍵進行制作。Fab’是切斷上述F (ab’)2的鉸鏈區(qū)的二硫鍵的、分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。而且，還可以通過將編碼抗體的Fab’片段的DNA插入于原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，通過將該載體導(dǎo)入于原核生物或真核生物而使之表達(dá)，制造Fab’。scFv是將I條H鏈V區(qū)域(VH)和I條L鏈V區(qū)域(VL)用適當(dāng)?shù)碾倪B接子(P)連結(jié)的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。scFv可以如下制備，即，獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將該DNA插入于原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，再將該表達(dá)載體導(dǎo)入于原核生物或真核生物中使之表達(dá)而進行制造。雙抗體是scFv 二聚化形成的抗體片段，其為具有二價的抗原結(jié)合活性的抗體片段。二價的抗原結(jié)合活性可以是相同的，也可以是其中一方為不同的抗原結(jié)合活性。雙抗體可以如下制備，即，通過獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA并使P的氨基酸序列的長度達(dá)到8個殘基以下，將該DNA插入于原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，再將該表達(dá)載體導(dǎo)入于原核生物或真核生物使之表達(dá)而進行制造。dsFv是指使VH和VL中的各I個氨基酸殘基被換成半胱氨酸殘基的多肽通過該半胱氨酸殘基間的二硫鍵結(jié)合形成的抗體。被換成半胱氨酸殘基的氨基酸殘基可以按照Reiter等人公開的方法(Protein Engineering, 7, 697-704, 1994),基于抗體的立體結(jié)構(gòu)預(yù)測進行選擇。dsFv可以如下制備:通過獲得編碼抗體的VH和VL的cDNA,構(gòu)建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，再將該表達(dá)載體導(dǎo)入于原核生物或真核生物中使之表達(dá)而進行制造。含有⑶R的肽包含VH或VL的⑶R (⑶R I 3)中的至少I個以上區(qū)域而構(gòu)成。含有多個CDR的肽可以如下制備:通過直接或適當(dāng)?shù)碾倪B接子結(jié)合。含有CDR的肽可以通過構(gòu)建編碼抗體的VH和VL的⑶R的DNA，將該DNA導(dǎo)入于原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，再將該表達(dá)載體導(dǎo)入于原核生物或真核生物中使之表達(dá)而進行制造。而且，含有⑶R的肽還可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成法來制造。 作為本發(fā)明的抗體片段，可以是以原有的形狀含有N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的N-乙酰葡糖胺不與巖藻糖結(jié)合的糖鏈的抗體Fe區(qū)域的一部分或全部的抗體片段，而且，也可以是上述抗體片段與N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈為該糖鏈的還原末端的N-乙酰氨基葡萄糖不與巖藻糖結(jié)合的糖鏈的抗體Fe區(qū)域的一部分或全部的融合蛋白質(zhì)。這種抗體片段可以極大地提高ADCC活性，因而優(yōu)選。作為本發(fā)明的抗體片段的具體例子并沒有限制，但可以例舉例如至少部分中含有序列號30 32所示的氨基酸序列(H鏈V區(qū)域的CDRl 3)的片段，具體而言，可以例舉含有序列號23所示的氨基酸序列(H鏈V區(qū)域)的片段。另外，作為該抗體片段，可以例舉至少部分中含有序列號33 35 (L鏈V區(qū)域的⑶Rl 3)所示的氨基酸序列的片段，具體而言可以例舉含有序列號25所示的氨基酸序列(L鏈V區(qū)域)的片段。以下本說明書中的說明中，上述抗體片段也包含于本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體中。3.抗體-藥劑復(fù)合體的制作作為使用上述本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體的免疫結(jié)合物等，可以提供含有該抗體和具有抗腫瘤活性和/或細(xì)胞殺傷活性的化合物的抗體-藥劑復(fù)合體。予以說明，在預(yù)先分別制備該抗體分子和具有抗腫 瘤活性和/或細(xì)胞殺傷活性的化合物之后，將它們復(fù)合化而獲得的物質(zhì)一般被稱為免疫結(jié)合物。而且，通過使用基因重組技術(shù)，將具有抗腫瘤活性和/或細(xì)胞殺傷活性的化合物中的蛋白質(zhì)毒素在基因上與抗體基因連接，作為I個蛋白質(zhì)(融合蛋白質(zhì))表達(dá)而獲得的物質(zhì)一般被稱為免疫毒素。作為具有抗腫瘤活性的化合物，例如，可以例舉阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)、絲裂霉素(mitomycin) C、Auristatin E 等。作為具有細(xì)胞殺傷活性的化合物，例如，可以例舉皂草素、篦麻毒素、綠膿桿菌外毒素、白喉毒素等，其中優(yōu)選使用皂草素和綠膿桿菌外毒素。作為抗體-藥劑復(fù)合體的制作方法并沒有限制，例如，可以例舉通過二硫鍵或腙鍵將抗體與藥劑偶聯(lián)的方法等。上述本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體在對表達(dá)hDlk-1的目標(biāo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化活性方面優(yōu)異。因此，通過預(yù)先使具有抗腫瘤活性和/或細(xì)胞殺傷活性的化合物復(fù)合化，可以使這些化合物直接且高選擇地作用于腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的抗體-藥劑復(fù)合體在向目標(biāo)腫瘤細(xì)胞傳送藥劑的能力上極為優(yōu)異。而且，對細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化活性可以如下評價，S卩，通過用羅丹明等對抗體進行螢光標(biāo)記，用螢光顯微鏡等觀察向細(xì)胞內(nèi)的進入舉動和抗體的定位性。另外本發(fā)明中，還可以提供在抗體-藥劑復(fù)合體中，使用前述抗體片段代替抗體的抗體片段-藥劑復(fù)合體?？贵w片段-藥劑復(fù)合體的詳細(xì)內(nèi)容可以適當(dāng)應(yīng)用上述抗體-藥劑復(fù)合體的說明。以下，本說明書的說明中，抗體片段-藥劑復(fù)合體也包含于本發(fā)明的抗體-藥劑復(fù)合體中。4.藥物組合物本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體和抗體-藥劑復(fù)合體作為包含于藥物組合物中的有效成分是有用的。該藥物組合物作為腫瘤的治療用和/或診斷用的藥物組合物是有用的。尤其是，由于本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體和含有該抗體的抗體-藥劑復(fù)合體具有腫瘤血管生成抑制活性的抗腫瘤活性，因此優(yōu)選在腫瘤的治療用中使用。即，本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體和抗體-藥劑復(fù)合體作為包含于腫瘤治療劑、腫瘤血管生成抑制劑和腫瘤診斷劑中的有效成分是有用的。
本發(fā)明的藥物組合物含有本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體和/或抗體-藥劑復(fù)合體作為有效成分，而且優(yōu)選以包括藥學(xué)上允許的載體的藥物組合物的形態(tài)提供。作為本發(fā)明的藥物組合物的適用對象疾病(腫瘤)，可以例舉確認(rèn)了表達(dá)hDlk-Ι的前述公知的人腫瘤和本發(fā)明人新確認(rèn)的表達(dá)hDlk-Ι的人大腸癌和人乳腺癌。其中，尤其優(yōu)選例舉大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)細(xì)胞瘤中的I種或2種以上。這些疾病可以是單獨的，也可以是2種以上并發(fā)。所謂“藥學(xué)上允許的載體”，可以例舉賦形劑、稀釋劑、增量劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖劑、乳化劑、芳香劑、著色劑、甜味劑、粘稠劑、矯味劑、增溶劑或其它添加劑等。通過使用I種以上這種載體，可以制備注射劑、液劑、膠囊劑、懸浮劑、乳劑或糖漿劑等形態(tài)的藥物組合物。這些藥物組合物可以經(jīng)口或非經(jīng)口給藥。作為用于非經(jīng)口給藥的其它形態(tài)，包括含有I種以上的活性物質(zhì)的通過常規(guī)方法制備的注射劑等。注射劑的情況中，可以通過溶解或懸浮于生理鹽水或市售的注射用蒸餾水等藥學(xué)上允許的載體中來制造。尤其是，對生物體內(nèi)給予本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體來源的抗體片段(其中尤其是低分子的物質(zhì))時，在其基礎(chǔ)上還可以使用膠體分散系。膠體分散系可期待具有提高化合物(抗體片段)在生物體內(nèi)穩(wěn)定性的效果和將化合物高效輸送到特定的內(nèi)臟器官、組織或細(xì)胞的效果。膠體分散系只要為通常使用的即可，沒有限制，可以例舉聚乙二醇、高分子復(fù)合體、高分子凝集體、納米膠囊、微球體、珠子和水包油系的乳化劑、膠束、混合膠束和以包含脂質(zhì)體在內(nèi)的脂質(zhì)為基礎(chǔ)的分散系，優(yōu)選為具有將化合物高效輸送到特定臟器、組織或細(xì)胞的效果的多個脂質(zhì)體、人工膜的小囊泡(Mannino et al.，Biotechniquesj 1988，6，682 ；Blume and Cevcj Biochem.et Biophys.Acta, 1990，1029，91 ；Lappalainen et al.，Antiviral Res.，1994，23，119 ；Chonn andCullisj Current Op.Biotech.，1995，6，698)。本發(fā)明的藥物組合物的給藥量根據(jù)患者的年齡、性別、體重和癥狀、治療效果、給藥方法、處理時間或藥物組合物所含的本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體和抗體-藥劑復(fù)合體的種類等而不同。通常，成人每人每次可以在600 μ g到6000mg的范圍內(nèi)給予，但并不限于此范圍。例如通過注射劑給予時，對人患者I次的給藥中，每Ikg體重可以平均I天以I次 數(shù)次給予ΙΟΟμ g IOOmg的量。作為給予的形態(tài)，可以例舉靜脈內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射或腹腔內(nèi)注射等，優(yōu)選為靜脈內(nèi)注射。而且，注射劑根據(jù)情況還可以調(diào)制成非水性的稀釋劑(例如聚乙二醇、橄欖油等植物油、乙醇等醇類等)、懸浮劑或乳濁劑。這種注射劑的無菌化可以通過過濾器進行過濾殺菌、配合殺菌劑等來進行。注射劑可以制備成使用時調(diào)制的形態(tài)。即，可以通過冷凍干燥法等制成無菌的固體組合物，在使用前溶解于無菌的注射用蒸餾水或其它溶劑中再使用。另外，本發(fā)明還提供用于制造治療和/或診斷腫瘤的藥物(藥劑)的前述本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體和/或抗體-藥劑復(fù)合體的應(yīng)用。而且，本發(fā)明還提供治療和/或診斷腫瘤用的前述本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體和/或抗體-藥劑復(fù)合體。此外，本發(fā)明還提供腫瘤的治療和/或診斷方法，其特征在于其使用前述本發(fā)明的抗hDlk-1抗體和/或抗體-藥劑復(fù)合體(即給予患者)，而且還提供前述本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體和/或抗體-藥劑復(fù)合體在用于治療和/或診斷腫瘤中的應(yīng)用。5.腫瘤的檢測方法本發(fā)明的腫瘤檢測方法的特征在于，使前述本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體與從生物體采集的試樣(以下稱生物體試樣)反應(yīng)，檢測反應(yīng)的抗體的信號的方法。如前所述，由于確認(rèn)了 hDlk-Ι在各種腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)，hDlk-Ι，尤其是游離hDlk-1 (hDlk-1的細(xì)胞外區(qū)域部分)可以作為各種腫瘤靶標(biāo)來使用。其中，優(yōu)選作為人大腸癌、人乳腺癌和人肝癌的靶標(biāo)來使用。因此，可以通過使本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體與生物體試樣反應(yīng)，檢測反應(yīng)的抗體的信號來檢測腫瘤。獲得的抗體的信號成為生物體試樣中的抗原量(即hDlk-Ι量或游離hDlk-Ι量)的指標(biāo)。使用本發(fā)明的抗體的腫瘤的檢測，首先，使作為試樣的從被驗者中提取的生物體試樣，例如作為檢查對象的組織 片或血液等與本發(fā)明的抗體通過抗原抗體反應(yīng)結(jié)合。然后，通過基于結(jié)合的抗體量的測定結(jié)果，通過測定生物體試樣中的目的抗原量而進行。該測定可以按照公知的免疫學(xué)測定法進行，例如，可以使用免疫沉淀法、免疫凝集法、標(biāo)記免疫測定法、免疫比池法、western blot法、流式細(xì)胞術(shù)法等。標(biāo)記免疫測定法中,抗體的信號除了以用標(biāo)記抗體直接檢測的標(biāo)記量表示之外，還可以以已知濃度或已知抗體效價的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)液相對地表示。S卩，可以通過測定計測定標(biāo)準(zhǔn)液和試樣，以標(biāo)準(zhǔn)液的值作為基準(zhǔn)，相對地表示生物體試樣中的抗體信號。作為標(biāo)記免疫測定法，例如可以例舉ELISA法、EI法、RIA法、螢光免疫測定法(FIA)、化學(xué)發(fā)光免疫測定法(Luminescence immunoassay)等。其中尤其是，ELISA法由于簡便和高靈敏度而優(yōu)選。本發(fā)明中，可以將通過上述檢測方法獲得的檢測結(jié)果作為指標(biāo)來評價或診斷腫瘤的狀態(tài)。例如，檢測結(jié)果超過預(yù)定的基準(zhǔn)值時判斷為腫瘤陽性，在預(yù)定的基準(zhǔn)值以下時判斷為腫瘤陰性，為陽性時，判斷為有發(fā)生任意一種腫瘤的可能性，可以評價腫瘤的狀態(tài)。這里，所謂腫瘤的狀態(tài)是指是否患有腫瘤或其進行程度，可以例舉腫瘤發(fā)癥的有無、進行度、惡性程度、轉(zhuǎn)移的有無和復(fù)發(fā)的有無等。在上述評價時，作為腫瘤的狀態(tài)，可以選擇I個，也可以組合選擇多個。腫瘤的有無的評價，可以基于所獲得的檢測結(jié)果，通過以預(yù)定的基準(zhǔn)值作為界限，判斷是否患有腫瘤來進行。腫瘤的惡性程度是表示癌進行到何種程度的指標(biāo)，也可以基于檢測結(jié)果，對病期(Stage)分類再進行評價，或分類為早期癌或晚期癌再進行評價。例如，還可以將檢測結(jié)果作為指標(biāo)，評價為早期癌或晚期癌。腫瘤的轉(zhuǎn)移，可以通過以檢測結(jié)果作為指標(biāo)，根據(jù)在從原發(fā)瘤的位置離開的部位是否出現(xiàn)新生物來評價。復(fù)發(fā)，可以根據(jù)在間歇期或緩解后檢測結(jié)果是否再次超過預(yù)定的基準(zhǔn)值來評價。6.腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒本發(fā)明的抗hDlk-Ι抗體可以以腫瘤的檢測用或診斷用試劑盒的形態(tài)提供。本發(fā)明的試劑盒含有抗體，此外還可以含有標(biāo)記物質(zhì)、或抗體或固定該標(biāo)記物的固定化試劑等。所謂抗體的標(biāo)記物質(zhì)是指用酶、放射性同位素、螢光化合物和化學(xué)發(fā)光化合物等標(biāo)記的物質(zhì)。本發(fā)明的試劑盒除了上述構(gòu)成要素之外，還可以含有用于實施本發(fā)明的檢測的其它試齊U，例如標(biāo)記物為酶標(biāo)記物時，可以含有酶底物(顯色性底物等)、酶底物溶解液、酶反應(yīng)停止液、或試樣用稀釋液等。而且，還可以含有各種緩沖液、無菌水、各種細(xì)胞培養(yǎng)容器、各種反應(yīng)容器(Eppendorf管等)、封閉劑(牛血清白蛋白(BSA)、脫脂乳、山羊血清等血清成分)、清洗劑、表面活性劑、各種板、疊氮化鈉等防腐劑和實驗操作手冊(說明書)等。本發(fā)明的試劑盒可有效用于進行上述本發(fā)明的檢測方法，其有用性極高。以下，通過例舉實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明并不限于此?！矊嵤├?〕<材料和方法>1.細(xì)胞株HEK-293-hDlk 細(xì)胞、7E2_C_hDlk 細(xì)胞和 Huh-7-hDlk 細(xì)胞使用按 WO 2005/052156中所述而制作的細(xì)胞株。另外，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-Fl細(xì)胞從美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC ;目錄號 N0.CRL2142)獲得。SW480-hDlk細(xì)胞是通過在人大腸癌來源的細(xì)胞株SW480 (獲得來源:東京大學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)研究所功能形成)中導(dǎo)入含有全長hDlk-Ι基因的表達(dá)載體pcDNA-hdlk-Flag(參照W02005/052156)，進行抗生素G418 (遺傳霉素(geneticin)，GIBCO BRL)選擇后，建立穩(wěn)定表達(dá)hDlk-Ι的細(xì)胞株而獲得。2.抗hDlk-Ι多克隆抗體的制作在構(gòu)建hDlk-Ι的細(xì)胞外區(qū)域(FA-1)表達(dá)載體時，設(shè)計并合成以下引物。正向(F)引物:5’-cgcgtccgcaaccagaagccc-3’ (序列號 3)反向(R)引物:5’ -ctcgaggtgctccggctgctgcaccggc-3’(序列號 4)此時，在R引物上添加XhoI限制性酶切序列。使用這些引物，以hDlk-Ι的cDNA作為模板，按以下的反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件進行PCR反應(yīng)?！斗磻?yīng)液組成》
模板 DNA:1pL
IOxPCR 緩沖液: SuL 2.5mM dNTP:A\\L
Taq DNA聚合酶: 0.5.uLF引物(ΙΟμΜ ):1pLR引物(ΙΟμΜ ):1pL
滅菌水:_37.5uL
合計:50μ1_,反應(yīng)條件以“熱變性/解離:95°C (60秒)一退火:55°C (60秒)一合成、伸長:72°C (60秒)”為I個循環(huán)，共計35個循環(huán)。將獲得的hDlk-Ι的細(xì)胞外區(qū)域(人FAl)的cDNA克隆于pCRII載體(Invitrogen)中(pCRI1-hFAl)。用測序儀確認(rèn)克隆的人FAl的cDNA。從pCRI1-hFAl 中切出含有人 FAl cDNA 的 EcoRI/XhoI 片段，插入到 pcDNA4/Myc-His 載體(Invitrogen)的 EcoRI/XhoI 位點(pcDNA4_hFAl)。在該表達(dá)載體中在 C 末端側(cè)添加Myc標(biāo)簽和His標(biāo)簽序列，人FAl作為與Myc標(biāo)簽和His標(biāo)記的融合蛋白質(zhì)表達(dá)。以融合蛋白質(zhì)作為抗原，通過常規(guī)方法，對兔進行免疫，制作抗hDlk-Ι多克隆抗體。3.hDlk-Ι基因的EGF樣基序缺失突變體的制作為了用于抗hDlk-Ι單克隆抗體的表位分析，如下制作hDlk-1基因的EGF樣基序
缺失突變體。首先，制作用于通過PCR法擴增該區(qū)域的引物。制作的各引物序列示于下表I。此時，在F引物上添加NotI限制性酶切序列，在R引物中添加XbaI限制性酶切序列。但是，在用于擴增EGF (4-6)和EGF (5_6)的區(qū)域的R引物上不添加XbaI限制性酶切序列。而且，表I中的構(gòu)建體欄中，例如“EGF (1-4)”的記載是指存在于hDlk-Ι的FA-1區(qū)域中的6個EGF樣基序(EGF-1 EGF-6)中由EGF-1到EGF-4的連續(xù)區(qū)域。表I
權(quán)利要求
1.一種在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗人Dlk-1的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體,其中,抗腫瘤活性為腫瘤血管生成抑制活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其中，抗體為單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任意一項所述的抗體，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任意一項所述的抗體，其中，抗體是基因重組抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其中，基因重組抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
7.一種抗人Dlk-1的單克隆抗體，其由保藏號為FERMBP-10707的雜交瘤產(chǎn)生。
8.一種抗人Dlk -1的單克隆抗體，其由保藏號為FERM BP-10900的雜交瘤產(chǎn)生。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任意一項所述的抗體，其與保藏號為FERMBP-10707或FERMBP-10900的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合的部位結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任意一項所述的抗體，其與序列號2所示的人Dlk-1的氨基酸序列中的第26位 第85位的氨基酸構(gòu)成的區(qū)域、或第131位 第244位的氨基酸所構(gòu)成的區(qū)域中的至少一部分結(jié)合。
11.一種來源于權(quán)利要求1 10中任意一項所述的抗體的抗體片段。
12.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1 10中任意一項所述的抗體的雜交瘤。
13.一種保藏號為FERM BP-10707的、產(chǎn)生抗人Dlk-1的單克隆抗體的雜交瘤。
14.一種保藏號為FERM BP-10900的、產(chǎn)生抗人Dlk-1的單克隆抗體的雜交瘤。
15.一種抗體-藥劑復(fù)合體，其含有權(quán)利要求1 10中任意一項所述的抗體和具有抗腫瘤活性和/或細(xì)胞殺傷活性的化合物。
16.一種抗體片段-藥劑復(fù)合體，其含有權(quán)利要求11所述的抗體片段和具有抗腫瘤活性和/或細(xì)胞殺傷活性的化合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的復(fù)合體，其中，抗腫瘤活性為腫瘤血管生成抑制活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求15 17中任意一項所述的復(fù)合體，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。
19.一種藥物組合物，其含有選自于由權(quán)利要求1 10中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求11所述的抗體片段和權(quán)利要求15 18中任意一項所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其用于腫瘤的治療。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，所述腫瘤的治療為抑制腫瘤血管生成。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的組合物，其沒有體重減少的副作用。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其用于腫瘤的診斷。
24.根據(jù)權(quán)利要求19 23中任意一項所述的組合物，其中，腫瘤選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。
25.一種腫瘤治療劑，其含有選自于由權(quán)利要求1 10中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求11所述的抗體片段和權(quán)利要求15 18中任意一項所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的治療劑，其沒有體重減少的副作用。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的治療劑，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。
28.一種腫瘤血管生成抑制劑，其含有選自于由權(quán)利要求1 10中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求11所述的抗體片段和權(quán)利要求15 18中任意一項所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的抑制劑，其沒有體重減少的副作用。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的抑制劑，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。
31.一種腫瘤診斷劑,其含有選自于由權(quán)利要求1 10中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求11所述的抗體片段和權(quán)利要求15 18中任意一項所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的診斷劑，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組中的至少I種。
33.一種腫瘤的治療用、診斷用或檢測用試劑盒，其含有選自于由權(quán)利要求1 10中任意一項所述的抗體、權(quán)利要求11所述的抗體片段和權(quán)利要求15 18中任意一項所述的復(fù)合體構(gòu)成的組中的至少I種。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中，腫瘤為選自于人大腸癌、人乳腺癌、人肝癌和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤構(gòu)成的組 中的至少I種。
全文摘要
本發(fā)明提供與hDlk-1特異性反應(yīng)且在體內(nèi)具有抗腫瘤活性的抗體(抗hDlk-1抗體)、該抗體的片段、產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、該抗體或抗體片段與藥劑的復(fù)合體、含有該抗體等的藥物組合物、腫瘤治療劑、腫瘤血管生成抑制劑、腫瘤診斷劑、腫瘤的檢測方法以及腫瘤的檢測用和/或診斷用試劑盒等。
文檔編號G01N33/577GK103073641SQ201210243678
公開日2013年5月1日 申請日期2007年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者中村康司, 田島理惠 申請人:株式會社立富泰克