用于治療遺傳性病狀的方法和組合物的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年8月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/694, 693的權(quán)益，所述臨 時(shí)申請(qǐng)的公開內(nèi)容特此W全文引用的方式并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開屬于造血干細(xì)胞的基因組工程領(lǐng)域，尤其是用于治療血紅蛋白病。
[0004] 背景
[0005] 基因療法對(duì)于人類醫(yī)學(xué)的新時(shí)代保持巨大的潛力。該些方法將允許治療迄今尚未 被標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)實(shí)踐解決的病狀。特別有前途的一個(gè)領(lǐng)域是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造W使得 該細(xì)胞表達(dá)先前沒有在該細(xì)胞中產(chǎn)生的產(chǎn)物的能力。該種技術(shù)的用途的實(shí)例包括插入編碼 新治療蛋白的基因、插入編碼在細(xì)胞中或個(gè)體中缺乏的蛋白的編碼序列、在含有突變基因 序列的細(xì)胞中插入野生型基因，和插入編碼結(jié)構(gòu)核酸例如微RNA或siRNA的序列。
[0006] 轉(zhuǎn)基因可W通過(guò)多種方式遞送至細(xì)胞，W使得轉(zhuǎn)基因整合至細(xì)胞自身的基因組中 并且保持在其中。近年來(lái)，已開發(fā)了轉(zhuǎn)基因整合策略，其使用位點(diǎn)特異性核酸酶裂解W祀向 插入至所選基因組基因座中（參見例如共同擁有的美國(guó)專利7, 888, 121)。可利用對(duì)祀向基 因具有特異性的核酸酶W使得轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體通過(guò)同源介導(dǎo)的修復(fù)（皿時(shí)插入或在非同源 末端接合（NHEJ)驅(qū)動(dòng)的方法期間通過(guò)末端捕捉插入。祀向基因座包括"安全港"基因座，例 如CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(也稱為AAVS1)基因、白蛋白基因或Rosa基因。參見例 如美國(guó)專利公布號(hào) 20080299580 ;20080159996 ;201000218264 ;20110301073 ;20130177983 和20130177960W及美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/823, 689。與依賴于轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)整合的經(jīng)典的整 合方法相比，核酸酶介導(dǎo)的整合提供改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)、增加的安全性和表達(dá)持久性的前 景，因?yàn)樗试S精確的轉(zhuǎn)基因定位，使得基因沉默或附近致癌基因活化的風(fēng)險(xiǎn)最小。
[0007] 紅血細(xì)胞（RBC)或紅細(xì)胞是血液的主要細(xì)胞組分。實(shí)際上，RBC在人類中占細(xì)胞 的四分之一。人類中的成熟RBC沒有細(xì)胞核和許多其它細(xì)胞器，并且全部是血紅蛋白，血紅 蛋白是存在于RBC中的金屬蛋白，其功能是攜帶氧氣至組織W及攜帶二氧化碳離開組織并 返回到肺部W去除。所述蛋白構(gòu)成RBC干重的約97%并且它使血液的攜氧能力提高約70 倍。血紅蛋白是包含兩條a樣珠蛋白鏈和兩條P樣珠蛋白鏈和4個(gè)血紅素基團(tuán)的異四聚 體。在成人中，a20 2四聚體被稱為血紅蛋白AOlbA)或成人血紅蛋白。通常，a和P珠 蛋白鏈W近似1:1比率合成并且該個(gè)比率在血紅蛋白和RBC穩(wěn)定化方面似乎是關(guān)鍵的。實(shí) 際上，在一類珠蛋白基因不足表達(dá)的一些情況下（參見下文），降低另一類型的珠蛋白的表 達(dá)（例如使用特異性SiRNA)，從而恢復(fù)該種1:1比率，減輕了突變細(xì)胞表型的一些方面（參 見Voon等，（2008)化ematologica93巧）：1288)。在發(fā)育中的胎兒中，產(chǎn)生不同形式的血紅 蛋白（胎兒血紅蛋白化b巧），其相比于血紅蛋白A對(duì)氧具有更高的結(jié)合親和力，W使得氧可 經(jīng)由母體血流遞送至嬰兒系統(tǒng)。胎兒血紅蛋白也含有兩條a珠蛋白鏈，但代替成人P珠 蛋白鏈，其具有兩條胎兒丫珠蛋白鏈（即，胎兒血紅蛋白是a2丫 2)。在妊娠約30周時(shí)， 胎兒中丫珠蛋白的合成開始下降，而0珠蛋白的產(chǎn)生增加。至大約10月齡時(shí)，新生兒的 血紅蛋白幾乎全部是a202,但一些化F持續(xù)到成年期（總血紅蛋白的約1-3%)。從產(chǎn) 生丫至產(chǎn)生0的開關(guān)的調(diào)節(jié)相當(dāng)復(fù)雜，并且主要設(shè)及丫珠蛋白的表達(dá)下調(diào)與0珠蛋白 表達(dá)的同時(shí)上調(diào)。
[000引在編碼血紅蛋白鏈的序列中的遺傳缺陷可造成多種疾病，稱為血紅蛋白病，包括 鑲狀細(xì)胞貧血和地中海貧血。在大多數(shù)患有血紅蛋白病的患者中，仍存在編碼丫珠蛋白的 基因，但由于如上所述在圍產(chǎn)期發(fā)生的正?；蛞种?，表達(dá)相對(duì)較低。
[0009] 據(jù)估計(jì)，在美國(guó)有1/5000的人群患有鑲狀細(xì)胞疾?。⊿CD)，大多是撒哈拉W南非 洲裔人群。鑲狀細(xì)胞雜合性似乎對(duì)于防止追疾存在益處，因此該種特性可能已經(jīng)隨著時(shí)間 推移經(jīng)過(guò)選擇，使得據(jù)估計(jì)在撒哈拉W南非洲，有=分之一的人口具有鑲狀細(xì)胞特性。鑲狀 細(xì)胞疾病是由0珠蛋白基因中的突變?cè)斐?，其中氨基?6的谷氨酸被鄉(xiāng)氨酸取代（在DNA 水平上是GAG至GTG)，其中所產(chǎn)生的血紅蛋白被稱為"血紅蛋白S"或"化S"。在較低氧條 件下，化S的脫氧形式的構(gòu)象轉(zhuǎn)變暴露出蛋白上E與F螺旋之間的疏水補(bǔ)了。血紅蛋白中 0鏈位置6的鄉(xiāng)氨酸的疏水殘基能夠與所述疏水補(bǔ)了締合，造成化S分子聚集并形成纖維 狀沉淀物。該些聚集體又造成RBC的異?；?鑲狀化'，導(dǎo)致細(xì)胞的柔性損失。鑲狀化RBC 不再能夠擠入毛細(xì)血管床中并且可W導(dǎo)致鑲狀細(xì)胞患者中的血管閉塞性危機(jī)。另外，鑲狀 RBC比正常RBC更脆弱，并且易于溶血，最終導(dǎo)致患者中出現(xiàn)貧血。
[0010] 鑲狀細(xì)胞患者的治療和管理是終身主張，設(shè)及抗生素治療、疼痛管理和在急性發(fā) 作期間的輸血。一種方法是使用哲基脈，其通過(guò)增加丫珠蛋白產(chǎn)生而部分地發(fā)揮其作用。 然而，長(zhǎng)期哲基脈療法的長(zhǎng)期副作用仍然未知，并且治療引起不希望的副作用并且在不同 患者之間可能具有可變的功效。盡管鑲狀細(xì)胞治療的功效增加，但患者的預(yù)期壽命仍然僅 為55至59歲并且疾病的相關(guān)發(fā)病率對(duì)患者的生活質(zhì)量具有深遠(yuǎn)的影響。
[0011] 地中海貧血也是與血紅蛋白有關(guān)的疾病并且通常設(shè)及珠蛋白鏈的表達(dá)降低。該可 W通過(guò)基因的調(diào)節(jié)區(qū)域中的突變或由導(dǎo)致表達(dá)降低的珠蛋白編碼序列中的突變發(fā)生。a地 中海貧血與西非和南亞裔人群有關(guān)，并且可能賦予抗追疾性。0地中海貧血與通常來(lái)自希 臘W及上耳其和意大利的沿海地區(qū)的地中海裔人群有關(guān)。地中海貧血的治療通常設(shè)及輸血 和鐵馨合療法。如果可W鑒定適當(dāng)?shù)墓w，則骨髓移植也被用于治療患有嚴(yán)重地中海貧血 的人，但該種程序可能具有顯著風(fēng)險(xiǎn)。
[0012] 已提出的一種用于治療SCD和0地中海貧血的方法是增加丫珠蛋白的表達(dá)， 目的在于用化F在功能上替換異常成人血紅蛋白。如上所述，用哲基脈治療SCD患者被 認(rèn)為是成功的，該在一定程度上是由于其對(duì)于增加的丫珠蛋白表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)影響 化F再激活活性的第一組化合物是細(xì)胞毒性藥物。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中使用5-氮雜胞巧首次顯 示通過(guò)藥理操縱重新合成丫珠蛋白的能力值eSimone(1982)Proc化tlAcadSciUSA 79(14) : 4428-31)。后續(xù)研究證實(shí)5-氮雜胞巧在具有e地中海貧血和鑲狀細(xì)胞疾病的患者 中增加HbF的能力（L巧等，（1982)N.化gl.J.Medicine, 307:1469-1475 ;和L巧等，（1983) Blood62:370-380)。另外，短鏈脂肪酸（例如了酸醋和衍生物）已顯示在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中增 加HbF(Constantoulakis等，（1988)Blood72 化）：1961-1967)。此外，存在一部分的具有 被稱為'遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在癥'（HPFH)的病狀的人類群體，其中在成年期中持 續(xù)存在升高量的化f(HPFH雜合子中的10-40% )(參見Iliein等，（2009)Hum.Mol.Genet 18巧2) :R216-R223)。該是一種罕見的病狀，但在不存在任何相關(guān)0珠蛋白異常的情況下， 它不與任何顯著臨床表現(xiàn)相關(guān)聯(lián)，即使當(dāng)個(gè)體的血紅蛋白的100%是化F時(shí)。當(dāng)具有e地 中海貧血的個(gè)體也具有共同發(fā)作的HPFH時(shí)，化F的表達(dá)可減輕疾病的嚴(yán)重程度。此外，鑲 狀細(xì)胞疾病的自然過(guò)程的嚴(yán)重程度在不同患者之間可能顯著變化，并且該種可變性在某種 程度上可W追溯到如下事實(shí)：一些具有較輕疾病的個(gè)體表達(dá)較高水平的化F。
[0013] 一種提高化F表達(dá)的方法設(shè)及鑒定其產(chǎn)物在丫珠蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)中起作用的基因。 一種此類基因是B化11A，首次鑒定是由于其在淋己細(xì)胞發(fā)育中的作用。B化11A編碼鋒指蛋 白，該蛋白被認(rèn)為是參與丫珠蛋白表達(dá)的階段特異性調(diào)節(jié)。BCL11A表達(dá)于成人紅系前體細(xì) 胞中并且其表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致丫珠蛋白表達(dá)增加。另外，似乎BCL11AmRNA的剪接經(jīng)過(guò)發(fā)育調(diào) 節(jié)。在胚胎細(xì)胞中，似乎主要表達(dá)較短的B化11AmRNA變體，稱為B化11A-S和B化11A-XS， 而在成體細(xì)胞中，主要表達(dá)較長(zhǎng)的B化11A-L和B化11A-XLmRNA變體。參見Sankaran 等，（2008)Science322第1839頁(yè)。BCL11A蛋白似乎與0珠蛋白基因座相互作用W改變 其構(gòu)象W及因此其在不同發(fā)育階段的表達(dá)。另外，另一種調(diào)節(jié)蛋白KLF1似乎參與丫珠蛋 白表達(dá)的調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn)KLF1水平與BCL11A水平成正比，并且兩者都與丫珠蛋白水平成反 比。例如，在具有化F的持續(xù)表達(dá)的馬耳他家族中，該家族攜帶KLF1基因的雜合突變炬org 等，（2010)化tGenet，42(9):801-805)。KLF1基因產(chǎn)物似乎在體內(nèi)直接結(jié)合至B化11A基 因，并且因此可造成其上調(diào)（參見Borg等，同上；Bieker(2010)化tGenet42 (9): 733-734; 化〇11等，（2010)化tGenet42(9):742-744)。因此，如果KLFl刺激B化llA表達(dá)，則所誘導(dǎo) 的B化11A的作用將導(dǎo)致丫珠蛋白和化F產(chǎn)生的抑制。已提出了祀向B化11A基因的抑制 性RNA的用途（參見例如美國(guó)專利公開20110182867)，但該種技術(shù)具有若干潛在缺點(diǎn)，即可 能無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全敲低，該類RNA的遞送可能有問題并且RNA必須連續(xù)存在，從而需要終生多 次治療。
[0014] a地中海貧血也流行于人類群體，特別是在亞洲，并且一些類型的a珠蛋白異 常被認(rèn)為是人類中最常見的遺傳性病癥。在世界上的熱帶和亞熱帶地區(qū)，a珠蛋白病癥 發(fā)現(xiàn)于群體的 80-90% 中（參見Harteveld和Higgs(2010)0巧hanetJournalofRare Diseases5:13)。
[0015] 人類在16號(hào)染色體上攜帶串聯(lián)的2個(gè)拷貝的a珠蛋白基因（a1和a2)，因此在 正常的二倍體細(xì)胞中總共存在4個(gè)拷貝。對(duì)于a珠蛋白mRNA,Q2基因通常是a1基因的 2-3倍。該兩種基因的串聯(lián)構(gòu)造可能與a地中海貧血患者中a珠蛋白基因大量缺失的高 發(fā)病率有關(guān)，其中非功能性a珠蛋白基因的數(shù)目通常與任何a地中海貧血的嚴(yán)重程度直 接相關(guān)（參見化ui等，（2003)Blood101(3):791)。一個(gè)拷貝的缺失似乎相當(dāng)常見（30% 的非裔美國(guó)人和60-80%的居住在沙特阿拉伯、印度和泰國(guó)的人），并且通常在個(gè)體中不明 顯，除非進(jìn)行基因測(cè)試。兩個(gè)拷貝的缺失，無(wú)論是在相同染色體上（順式）或者每個(gè)染色體 一個(gè)（反式），都可造成患病個(gè)人具有輕度貧血。當(dāng)=個(gè)a珠蛋白基因缺失時(shí)，使得個(gè)體僅 具有一個(gè)正常工作的a珠蛋白基因，測(cè)得中度貧血，但更重要的是，關(guān)鍵的a珠蛋白與0 珠蛋白的比率被破壞。通常在僅具有一個(gè)功能性a珠蛋白基因的患者中觀察到包含四個(gè) 0珠蛋白鏈的04四聚體，該是被稱為化H的病狀。所述04四聚體能夠結(jié)合氧，但不會(huì)將 其釋放至外周，從而造成所謂的化H疾病。患有化H疾病的個(gè)體具有半衰期縮短的RBC并 且其容易經(jīng)歷溶血，從而導(dǎo)致貧血增加。失去全部四個(gè)a珠蛋白基因在子宮內(nèi)通常是致命 的。
[0016] 因此，仍需要可用于基因組編輯的另外的方法和組合物，W校正異?；蚧蚋淖?其它基因的表達(dá)，例如W治療血紅蛋白病例如鑲狀細(xì)胞疾病和地中海貧血。
[0017] 發(fā)明概述
[0018] 本文公開用于改變表達(dá)或用于校正一種或多種編碼在遺傳性疾病例如鑲狀細(xì)胞 疾病或地中海貧血中所設(shè)及的蛋白的基因（例如，產(chǎn)生疾病中缺乏、不足或異常的蛋白和/ 或調(diào)節(jié)該些蛋白的蛋白）的方法和組合物。該些蛋白的改變可W導(dǎo)致該些遺傳性疾病的治 療。特別是，使用基因組編輯來(lái)校正異?；?，插入野生型基因或改變內(nèi)源基因的表達(dá)。作 為非限制性實(shí)例，可將編碼0珠蛋白的野生型基因插入細(xì)胞中W產(chǎn)生由有缺陷的0珠蛋 白造成的血紅蛋白病中所缺乏的蛋白和/或治療由有缺陷的0珠蛋白造成的血紅蛋白病。 在一些情況下，可將野生型基因插入安全港基因座中或已知在目標(biāo)組織中高度表達(dá)的基因 座例如紅系細(xì)胞中的0珠蛋白基因座。基因組編輯可類似地通過(guò)將野生型a珠蛋白基因 插入安全港中而用于產(chǎn)生a地中海貧血中缺乏的蛋白（并從而治療a地中海貧血）。另 一種方法設(shè)及使用基因校正，其中祀向有缺陷的內(nèi)源a或0珠蛋白基因并且置換突變序 列?？蛇x地，可改變或敲除丫珠蛋白的抑制中所設(shè)及的調(diào)芐基因（例如，W通過(guò)滅活和/ 或降低抑制蛋白的量來(lái)增加丫珠蛋白的表達(dá)）和/或可改變丫珠蛋白基因上游或0珠 蛋白基因座的其它區(qū)域中的調(diào)節(jié)結(jié)合位點(diǎn)，W使得調(diào)節(jié)子不能在丫珠蛋白基因座處適當(dāng) 地相互作用并且產(chǎn)生化F，從而消除由異常0珠蛋白基因造成的作用（即SCD或0地中海 貧血）。一種方法進(jìn)一步設(shè)及使用干細(xì)胞（例如，造血干細(xì)胞或RBC前體）的修飾，該干細(xì) 胞然后可用于植入患者中，W治療血紅蛋白病。
[0019] 在一個(gè)方面，本文描述結(jié)合于基因組中目標(biāo)區(qū)域（例如，0珠蛋白、a珠蛋白或 安全港基因，或調(diào)芐基因或其DNA祀標(biāo)例如BCL11A、丫珠蛋白或KLF1)中的祀位點(diǎn)的鋒指 蛋白狂FP)，其中該ZFP包含一個(gè)或多個(gè)工程改造的鋒指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中， ZFP是裂解目標(biāo)祀基因組區(qū)域的鋒指核酸酶狂FN)，其中該ZFN包含一個(gè)或多個(gè)工程改造的 鋒指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域。裂解結(jié)構(gòu)域和裂解半結(jié)構(gòu)域可W獲 自例如各種限制核酸內(nèi)切酶和/或歸巢核酸內(nèi)切酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，裂解半結(jié)構(gòu)域是 源自IIS型限制核酸內(nèi)切酶（例如，F(xiàn)okI)。在某些實(shí)施方案中，鋒指結(jié)構(gòu)域識(shí)別珠蛋白或 安全港基因中的祀位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，鋒指結(jié)構(gòu)域包含5或6個(gè)鋒指結(jié)構(gòu)域并識(shí)別珠 蛋白基因中的祀位點(diǎn)（例如，具有5或6個(gè)含識(shí)別螺旋區(qū)域的指的鋒指蛋白示于表1A中）。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，鋒指結(jié)構(gòu)域識(shí)別BCL11A、KLF1、a、P或丫珠蛋白基因或其調(diào)節(jié)元 件中的祀位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，鋒指結(jié)構(gòu)域包含5或6個(gè)鋒指結(jié)構(gòu)域并識(shí)別BCL11A、 KLF1、a、P或丫珠蛋白基因中或其調(diào)節(jié)元件中的祀位點(diǎn)（例如，具有5或6個(gè)含識(shí)別螺 旋區(qū)域的指的鋒指蛋白示于表1A中）。
[0020] 在另一個(gè)方面，本文描述結(jié)合于基因組中目標(biāo)區(qū)域（例如，a或P珠蛋白或安全 港基因，或調(diào)芐基因或其DNA祀標(biāo)例如BCL11A、丫珠蛋白或KLF1)中的祀位點(diǎn)的TALE蛋白 (類轉(zhuǎn)錄激活因子），其中該TALE包含一個(gè)或多個(gè)工程改造的TALE結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí) 施方案中，TALE是裂解目標(biāo)祀基因組區(qū)域的核酸酶（TALEN)，其中該TALEN包含一個(gè)或多個(gè) 工程改造的TAL邸NA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域。裂解結(jié)構(gòu)域和裂解 半結(jié)構(gòu)域可W獲自例如各種限制核酸內(nèi)切酶和/或歸巢核酸內(nèi)切酶。在一個(gè)實(shí)施方案中， 裂解半結(jié)構(gòu)域是源自IIS型限制核酸內(nèi)切酶（例如，F(xiàn)okI)。在某些實(shí)施方案中，TALEDNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別珠蛋白或安全港基因中的祀位點(diǎn)。在其它實(shí)施方案中，TALEDM結(jié)合結(jié)構(gòu) 域識(shí)別BCL11A、KLF1、a、P或丫珠蛋白基因或其調(diào)節(jié)元件（例如，表3中所示例的TALEN 蛋白）中的祀位點(diǎn)。
[0021] 在另一個(gè)方面，本文描述結(jié)合于基因組中目標(biāo)區(qū)域（例如，高度表達(dá)的基因、疾病 相關(guān)基因或安全港基因）中的祀位點(diǎn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中該CRISPR/Cas系統(tǒng)包含 CRIPSR/Cas核酸酶和工程改造的crRNA/tracrRNA(或單導(dǎo)向RNA)。在某些實(shí)施方案中， CRISPR/Cas系統(tǒng)識(shí)別高度表達(dá)的基因、疾病相關(guān)基因或安全港基因中的祀位點(diǎn)。在某些實(shí) 施方案中，CRISPR/Cas系統(tǒng)識(shí)別珠蛋白、白蛋白、CC貼、CXCR4、AAVS1、Rosa或HPRT基因中 的祀標(biāo)。
[0022] 如本文所述的ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)可結(jié)合和/或裂解基因內(nèi)或基因 相鄰的編碼或非編碼區(qū)域中的目標(biāo)區(qū)域，例如前導(dǎo)序列、尾隨序列或內(nèi)含子，或非轉(zhuǎn)錄區(qū)域 內(nèi)，在編碼區(qū)域上游或下游的目標(biāo)區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，ZFN、TALEN和/或CRISPR/tas 系統(tǒng)結(jié)合和/或裂解珠蛋白基因。在其它實(shí)施方案中，ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié) 合和/或裂解安全港基因，例如CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(也稱為AAVS1)基因、白蛋 白基因或Rosa基因。參見例如美國(guó)專利公布號(hào)20080299580 ;20080159996 ;201000218264 ; 20110301073 ;20130177983 和 20130177960W及美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?61/823,689。另外，為了 輔助選擇，可使用HPRT基因座（參見美國(guó)專利公布號(hào)20130122591)。在另一個(gè)方面，本文 描述包含一種或多種如本文所述的鋒指和/或TALE核酸酶或CRISPR/Cas系統(tǒng)的組合物。 在一些實(shí)施方案中，ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合并裂解B化11A、KLF1、a、P或 丫珠蛋白基因或裂解其調(diào)節(jié)元件。在另一個(gè)方面，本文描述包含一種或多種如本文所述的 鋒指、TALE或Cas核酸酶的組合物。
[002引在另一個(gè)方面，本文描述編碼一種或多種如本文所述的ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)的多核巧酸。多核巧酸可能是例如mRNA。在一些方面，mRNA可被化學(xué)修飾（參見 例如Kormann等，（2011)化1:腳6Biotechnology29 似：154-157)。
[0024] 在另一個(gè)方面，本文描述包含可操作地連接至啟動(dòng)子的編碼一種或多種本文所述 的ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)的多核巧酸的ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)表 達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體是病毒載體。
[0025] 在一個(gè)方面，本文描述用于裂解祀DNA的ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)蛋 白。
[0026] 在其它方面，遺傳修飾的RBC前體（造血干細(xì)胞，稱為"服C")提供于骨髓移植物 中并且RBC在體內(nèi)分化并成熟。在一些實(shí)施方案中，在G-CSF誘導(dǎo)的動(dòng)員后分離服C，并且 在其它情況下，細(xì)胞是從人類骨髓或廝帶中分離。在一些方面，通過(guò)經(jīng)設(shè)計(jì)W敲除珠蛋白表 達(dá)調(diào)節(jié)子（例如，B化11A或KLF1)的核酸酶處理來(lái)編輯服C。在其它方面，用工程改造的核 酸酶和供體核酸修飾HSC，W使得插入并表達(dá)野生型基因（例如，珠蛋白基因）和/或校正 內(nèi)源異?；?。在一些情況下，用于插入的野生型基因序列編碼野生型0珠蛋白或野生型 a珠蛋白。在其它情況下，內(nèi)源異常基因是0珠蛋白或a珠蛋白基因。在一些實(shí)施方案 中，在輕度骨髓清除性預(yù)調(diào)節(jié)后，將修飾的HSC施用至患者。在其它方面，在完全骨髓清除 后施用服C，W使得在植入后，100%的造血細(xì)胞是源自修飾的服C。
[0027] 在另一個(gè)方面，本文描述用于裂解RBC前體細(xì)胞中的內(nèi)源基因（例如，其失活導(dǎo)致 丫珠蛋白表達(dá)增加的基因，例如BCLllA或KLFl)的方法，該方法包括：向細(xì)胞中引入一種 或多種編碼一種或多種在一定條件下結(jié)合于一種或多種內(nèi)源基因中的祀位點(diǎn)的ZFN、TALEN 和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)的多核巧酸，W使得表達(dá)所述ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng) 并且裂解所述一種或多種基因。在另一個(gè)方面，本文描述用于裂解細(xì)胞中的BCL11A或KLF1 基因的方法，該方法包括；向細(xì)胞中引入一種或多種編碼一種或多種在一定條件下結(jié)合于 一種或多種B化11A或KLF1基因中的祀位點(diǎn)的ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)的多核 巧酸，W使得表達(dá)所述ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng)并且裂解所述一種或多種BCL11A 或KLF1基因。在某些實(shí)施方案中，鋒指結(jié)構(gòu)域包含5或6個(gè)鋒指結(jié)構(gòu)域并識(shí)別珠蛋白基 因中的祀位點(diǎn)（例如，具有5至6個(gè)含識(shí)別螺旋區(qū)域的指的鋒指蛋白示于表1A中）。在其 它實(shí)施方案中，TALEN識(shí)別0珠蛋白、a珠蛋白、丫珠蛋白、KLF或BCL11A序列中的祀位 點(diǎn)（示例于表3中）。在其它實(shí)施方案中，CRIPSR/Cas系統(tǒng)識(shí)別0珠蛋白、a珠蛋白、丫 珠蛋白、KLF或BCL11A序列中的祀位點(diǎn)，其中單導(dǎo)向RNA被工程改造W識(shí)別目標(biāo)祀基因中 的所需祀位點(diǎn)。裂解基因可能失活（敲除），例如敲除一種或多種基因，其產(chǎn)物可抑制基因 (例如，珠蛋白基因）的表達(dá)，或破壞該些蛋白的DNA上的調(diào)節(jié)祀位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中， 失活基因或其祀序列是參與抑制胎兒血紅蛋白表達(dá)的那些。細(xì)胞（例如，干細(xì)胞）在分化 時(shí)含有胎兒血紅蛋白并且可提供至有需要的患者。在一些實(shí)施方案中，珠蛋白基因被敲除。 例如，當(dāng)0珠蛋白不良表達(dá)時(shí)，a珠蛋白基因可被敲除W恢復(fù)a珠蛋白與P珠蛋白的比 率，或者可伴隨著野生型0珠蛋白的插入而敲除編碼化S的0珠蛋白基因。細(xì)胞（例如， 干細(xì)胞）在分化時(shí)將含有化A血紅蛋白并且可提供至有需要的患者。
[002引在另一個(gè)方面，本文描述用于將序列插入細(xì)胞（例如干細(xì)胞）中的內(nèi)源基因（例 如，0珠蛋白、a珠蛋白和/或安全港基因）中的方法，該方法包括使用一種或多種核酸酶 來(lái)裂解內(nèi)源基因并且將序列插入裂解位點(diǎn)中。在某些實(shí)施方案中，例如使用如本文所述的 ZFN或TALEN對(duì)或CRIPSR/Cas系統(tǒng)（或編碼所述ZFN、TALEN和/或CRIPSR/Cas系統(tǒng)的載 體）和在用ZFN、TALEN和/或CRIPSR/tas系統(tǒng)祀向裂解后插入基因中的"供體"序列（也 稱為"轉(zhuǎn)基因"）置換任何祀基因中的基因組序列。供體序列可存