一種真核重組表達(dá)載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種真核重組表達(dá)載體及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然或普通重組的生物活性蛋白在體內(nèi)半衰期非常短，以普通重組IL-2為例， 其在體內(nèi)半衰期僅為6. 9分鐘，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床研究中需要反復(fù)給藥；又如小分子抗體 Fab (由完整的輕鏈和Fd構(gòu)成）、Fv (由VH和VL構(gòu)成）、ScFv (單鏈抗體，VH和VL之間由 一連接肽連接而成）或單域抗體（僅由VH組成）等，由于血楽半衰期短，穩(wěn)定性不高，不能 產(chǎn)生抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)（ADCC效應(yīng)）等問(wèn)題，大大限制了蛋白類藥物的臨 床應(yīng)用。
[0003]目前常用化學(xué)修飾和構(gòu)建融合蛋白的方法來(lái)延長(zhǎng)蛋白類藥物的半衰期?？贵w的Fc 端負(fù)責(zé)抗體的效應(yīng)功能，如激活補(bǔ)體、結(jié)合Fc受體、穿越胎盤(pán)等，IgG的Fc結(jié)構(gòu)域可形成多 聚合分子，將生物活性蛋白與IgG的絞鏈區(qū)及CH2、CH3區(qū)結(jié)合形成Fc融合蛋白，能使重組 蛋白具有更強(qiáng)的抗原結(jié)合力，可以增加蛋白類藥物在血液中的半衰期，利于蛋白作為治療 藥物在臨床中的實(shí)際應(yīng)用。
[0004] 有報(bào)道稱，IFNa2b與人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因（IFNa2b_Fc Y )在畢赤 酵母中以二聚體形式分泌表達(dá)后，進(jìn)行大鼠皮下注射，循環(huán)血液中半衰期達(dá)65h，血液中存 留時(shí)間120h以上，比商品重組干擾素（IFNa2b)的體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)約8倍，血液存留時(shí)間延 長(zhǎng)10倍，顯示了其良好的臨床應(yīng)用前景。
[0005] 然而，不同F(xiàn)c片段的融合蛋白對(duì)蛋白藥物的生物活性可能有一定影響，t匕 如，IFNa2b與人IgG免疫球蛋白Fc片段的融合基因（IFNa2b-Fc Y )表達(dá)的融合蛋白 IFNa2b-FcY的抗病毒活性較單純的IFNa2b抗病毒活性低，即不同F(xiàn)cy片段的融合蛋白對(duì) IFNa2b抗病毒活性有一定影響，其中，IFNa2b-Fc Y 2所受影響最小，相對(duì)于單純的IFNa2b， IFNa2b-Fc Y 2的抗病毒活性降低了 2. 3倍。
[0006] 因此，有必要提供一種能延長(zhǎng)蛋白類藥物在體內(nèi)的半衰期、又對(duì)蛋白質(zhì)生物活性 影響小的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種真核重組表達(dá)載體，該真核重組表達(dá)載體含 有鼠IgG2b-Fc基因，能表達(dá)含有鼠IgG2b-Fc標(biāo)簽的融合蛋白，由于IgG2b-Fc段的存在，所 述融合蛋白不僅具有較長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期，穩(wěn)定性更高，更具有生物活性蛋白質(zhì)完整的功能； 本發(fā)明還提供了一種真核重組表達(dá)載體的制備方法和應(yīng)用。
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供了一種真核重組表達(dá)載體，所述真核重組表達(dá)載體為在真 核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入鼠IgG2b-Fc基因，所述真核表達(dá)載體為pcDNA3. 1質(zhì)粒、P3X 質(zhì)?；騪lexm質(zhì)粒。
[0009] 優(yōu)選地，所述鼠IgG2b-Fc基因的堿基序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 優(yōu)選地，所述真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)為pcDNA3. 1質(zhì)粒的Not I和Xba I酶 切位點(diǎn)。
[0011] 目前，一般將有生物活性蛋白的基因與Fc段基因通過(guò)重疊PCR連接好后，再構(gòu) 建到表達(dá)載體中，比較費(fèi)時(shí)，費(fèi)力；本發(fā)明提供的真核重組表達(dá)載體含有鼠IgG2b-Fc基 因，可以直接將具生物活性的蛋白基因構(gòu)建到該表達(dá)載體中，可快速、高效的表達(dá)含鼠鼠 IgG2b-Fc端的融合蛋白；表達(dá)Fc融合蛋白中，生物活性蛋白與IgG的絞鏈區(qū)及CH2、CH3區(qū) 結(jié)合，對(duì)于小分子抗體、抗原、細(xì)胞因子等蛋白類藥物來(lái)說(shuō)，融合蛋白因鼠IgG2b-Fc的二硫 鍵作用形成二聚體，可提高蛋白類藥物的穩(wěn)定性和免疫原性，增加其在血液中的半衰期，利 于蛋白類藥物在臨床中的實(shí)際應(yīng)用。
[0012] 其次，該表達(dá)載體表達(dá)的IgG2b_Fc片段來(lái)自小鼠，無(wú)免疫原性或免疫原性很低， 可直接免疫小鼠用于鼠單克隆抗體或多克隆抗體的制備；而且，由于Fc融合蛋白可用 Protein A或Protein G進(jìn)行純化，該真核載體表達(dá)的融合蛋白的純化方法簡(jiǎn)單、且純度高， 該鼠IgG2b-Fc融合蛋白還可用抗小鼠IgG抗體的二抗進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方便。
[0013] 此外，根據(jù)插入本發(fā)明提供的真核重組表達(dá)載體中的基因的不同，該插入基因表 達(dá)的蛋白與其配體的特異性相互作用也不同，加上鼠IgG2b-Fc的生物學(xué)效應(yīng)，融合蛋白可 以特異的靶向某些特定目標(biāo)，并發(fā)揮ADCC、固定補(bǔ)體及免疫調(diào)節(jié)等作用，本發(fā)明提供的真核 重組表達(dá)載體中的IgG2b-Fc標(biāo)簽不影響插入基因的表達(dá)，以及表達(dá)后融合蛋白的生物活 性。
[0014] 小鼠IgG共有4個(gè)亞類分別為是IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3, IgG可通過(guò)經(jīng)典途 徑活化補(bǔ)體，然而，不同補(bǔ)體對(duì)不同IgG亞類的親和力不同，比如FcrRI (CD64)對(duì)鼠的IgG2a 和IgG3親和力高，一般來(lái)說(shuō)，小鼠IgG固定補(bǔ)體的能力依次為IgG2b > IgG2a > IgG3,其 中，小鼠的IgGl無(wú)固定補(bǔ)體的能力；本發(fā)明采用IgG2b構(gòu)建了可以表達(dá)IgG2b-Fc的真核重 組表達(dá)載體，有利于融合蛋白激活補(bǔ)體活化途徑。
[0015] 第二方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的真核重組表達(dá)載體的制備方法， 包括如下步驟：
[0016] (1)、提取鼠脾臟的總RNA，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;
[0017] (2)、設(shè)計(jì)鼠IgG2b Fc的上游引物和下游引物，并以步驟（1)所得cDNA為模板，擴(kuò) 增鼠IgG2b Fc目的基因片段；
[0018] (3)、取p⑶NA3. 1質(zhì)粒，將步驟（2)擴(kuò)增得到的鼠IgG2b Fc目的基因片段和所述 PCDNA3. 1質(zhì)粒利用相同的內(nèi)切酶分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，純化回收后進(jìn)行連接，得到所述真 核重組表達(dá)載體，所述真核重組表達(dá)載體為含有鼠IgG2b-Fc基因的pcDNA3. 1表達(dá)載體。
[0019] 優(yōu)選地，所述鼠IgG2b Fc的上游引物的堿基序列如SEQ ID N0:2所示，所述鼠 IgG2b Fc的下游引物的堿基序列如SEQ ID N0:3所示。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中，雙酶切反應(yīng)所采用的內(nèi)切酶為Not I和Xba I內(nèi)切酶。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟（3)中，所述鼠IgG2b-Fc基因的堿基序列如SEQ ID N0:1所示。
[0022] 第三方面，本發(fā)明提供了一種含有如第一方面所述的真核重組表達(dá)載體的宿主細(xì) 胞，所述宿主細(xì)胞為CH0或293細(xì)胞。
[0023] 第四方面，本發(fā)明提供了如第一方面所