專利名稱：可促進腫瘤細胞分化的cDNA序列及其真核表達載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有促進腫瘤細胞分化功能的cDNA序列及其真核表達載體，所述的cDNA是從維甲酸處理的人食管癌細胞系中分離得到的。
人體細胞一般都要經(jīng)過增殖、分化、衰老和凋亡(apoptosis)幾個時期，當細胞由于某種原因不能及時轉(zhuǎn)入分化階段而持續(xù)增殖時就會形成惡性腫瘤。長期以來細胞分化和惡性腫瘤始終是病理學者、臨床醫(yī)生和實驗?zāi)[瘤學者共同關(guān)注的中心問題之一，而隨著基因療法的出現(xiàn)和發(fā)展，對惡性腫瘤進行基因治療也成為一項重要的研究課題。已有不少資料表明，惡性腫瘤在體內(nèi)或體外條件下有可能部分地或完全地轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的分化細胞。近年來有許多實驗室探索在體外條件下使癌細胞發(fā)生逆轉(zhuǎn)(即轉(zhuǎn)變?yōu)榉只毎?的條件和機制，并相繼發(fā)現(xiàn)和分離到幾種具有促進腫瘤分化功能的分化基因(又稱抑癌基因)，例如成視網(wǎng)膜細胞瘤的RB基因(S.H.Friend et al.，Nature，323(1986)，p643-646；W.-H.Lee et al.，Science，235(1987)，p1394-1399；Y.-K.T.Fung et al.，Science，236(1987)，p1657-1661)；Wilms瘤的鋅指基因(zinc-finger gene)(M.Gessler et al.，Nature，343(1990)，p774-778)。這些抑癌基因的發(fā)現(xiàn)為實現(xiàn)基因治療腫瘤提供了理論上和實驗上的依據(jù)。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有促進腫瘤細胞分化功能的cDNA序列，其對多種腫瘤細胞有明顯的生長抑制作用。
本發(fā)明的另一個目的在于提供合有所述的cDNA序列的真核基因表達載體。
本發(fā)明的又一目的在于所述的cDNA序列在制備基因治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。
為完成上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明涉及一種具有促進腫瘤分化功能的cDNA序列(下文稱為序列1)，其全長為3805bp，具有如下文序列表中序列標識號1所示的核苷酸序列。所述的cDNA序列是通過用全反式維甲酸誘導人食管癌細胞系EC8712使其發(fā)生分化，從其cDNA文庫中分離得到。
本發(fā)明還涉及一種含有所述的cDNA序列的真核表達載體。
本發(fā)明還涉及所述的cDNA序列在制備基因治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的序列1是一種能夠促進腫瘤細胞分化進而凋亡的cDNA序列，體外實驗表明轉(zhuǎn)染序列1后的腫瘤細胞生長受到抑制，形態(tài)發(fā)生明顯改變，并且逐漸脫落死亡。而初步的動物實驗顯示出所述的序列1在體內(nèi)也有抑癌作用。因此，本發(fā)明的序列1基因在用于制備腫瘤的基因治療的制劑方面有著潛在的廣泛用途。附圖的簡要說明

圖1為序列1的核苷酸測序策略及其限制性內(nèi)切酶酶切圖譜的示意圖。
圖2為本發(fā)明實施例中采用的真核表達載體質(zhì)粒pCDV1的基因圖譜。
圖3為本發(fā)明實驗例2中篩選到的由序列1轉(zhuǎn)染的EC109細胞克隆(5倍光鏡下)。
圖4為本發(fā)明實驗例2中篩選到的另一個由序列1轉(zhuǎn)染的EC109細胞克隆(5倍光鏡下)。
圖5為本發(fā)明實驗例2中采用的EC109細胞(5倍光鏡下)。
已有報告指出維甲酸及其衍生物對癌細胞具有十分廣泛和強力的生物學作用(S.Strickland et al.，Cell，1978，15(2)393-403；T.R.Breitman et al.，Blood，1981，571000-1004)，在體外它可抑制HL-60細胞，小細胞肺癌細胞的c-myc基因表達(J.Films etal.Cancer Res.1985，45822-825；G.p.Kalemkerian et al.1994，Cell Growth &Differentiation555-60)，其對人食管癌細胞系EC109也有抑制生長作用(Q.Q.Pan et al.1984，Acta.Acad.Med.Sin.6100-103)?；诰S甲酸的促進腫瘤細胞分化的功能，本發(fā)明人設(shè)計了一種利用維甲酸促使腫瘤細胞體外分化，建立分化前后的cDNA文庫并通過遞減雜交技術(shù)從人食管癌細胞系中分離分化基因的策略，通過大量的工作，終于篩選到一種具有促進腫瘤細胞分化功能的cDNA序列，即序列1。
具體地，本發(fā)明涉及一種具有促進腫瘤分化功能的cDNA序列，即序列1，用雙脫氧法對其進行單、雙鏈序列測定，得知其全長為3805bp，具有如下文序列表中序列標識號1所示的核苷酸序列。序列1的核苷酸測序策略及限制性內(nèi)切酶酶切圖譜如圖1所示。
計算機分析表明序列1沒有合適的編碼蛋白質(zhì)的閱讀框架，從1994年版的EMBL和Gene Bank數(shù)據(jù)庫中查出序列1有兩個不相連的區(qū)域與人和小鼠的c-myc癌基因第二和第三外顯子有較高的互補同源性，兩個同源區(qū)域共1540bp，約占基因總長的40％。第一同源區(qū)從第1224bp至1954bp，第二同源區(qū)從第2985bp至3805bp。
本發(fā)明的序列1是通過如下方法得到的用全反式維甲酸處理人食管癌細胞系EC8712(由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所構(gòu)建)，構(gòu)建維甲酸處理前和處理五天后的EC8712細胞的兩個cDNA文庫，經(jīng)過兩個文庫的遞減雜交，從維甲酸處理后的cDNA文庫中得到所述的序列1。詳細方法見馮駱等人的文章(中國科學B輯，1991，101059-1067)。
本發(fā)明實質(zhì)上還涉及一種含有所述的序列1的真核表達載體，本發(fā)明實施例中采用的是含有序列1的質(zhì)粒pCDV1。pCDV1的基因圖譜見圖2。體外實驗表明，以含有序列1的真核表達載體轉(zhuǎn)染EC8712細胞、HL-60細胞和人肺腺癌細胞系，所述的序列1對三種細胞均有明顯的抑制細胞生長及其惡性表型的作用，并同時降低了這些細胞系中c-myc癌基因的表達。而用小鼠為實驗動物進行的初步體內(nèi)實驗也表明，注射有本發(fā)明的序列1的小鼠其癌癥發(fā)病率明顯低于未注射序列1的小鼠。因此，本發(fā)明的序列1在用于制備基因治療腫瘤的制劑方面有著潛在的廣泛用途。
含有本發(fā)明的序列1的質(zhì)粒已于1995年1月29E在中國典型培養(yǎng)物中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC M 95005，該質(zhì)粒名稱為RATS1。
以下結(jié)合附圖和實施例進一步描述本發(fā)明。實施例1用全反式維甲酸(retinoic acid，RA)處理人食管癌細胞系EC8712參見馮駱等人的方法(中國科學B輯，第10期，1991年10月，1059-1067頁)，該篇文章中所述的pRA538即為含有本發(fā)明的序列1的質(zhì)粒pCDV1。
EC8712細胞系是中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所構(gòu)建的人食管癌細胞系，病理診斷為鱗狀細胞癌。
將EC8712細胞傳代，培養(yǎng)液為M199(GIBCO)，內(nèi)含20％小牛血清、1％青鏈霉素，用終濃度為10-5mol/l的全反式維甲酸處理EC8712細胞，每天換液，保持RA在培養(yǎng)液中的濃度。實施例2 EC8712細胞的cDNA文庫的構(gòu)建及遞減雜交參見馮駱等人的方法(中國科學B輯，第10期，1991年10月，1059-1067頁)。該篇文章中所述的pRA538即為含有本發(fā)明的序列1的質(zhì)粒pCDV1。
從未經(jīng)RA處理和經(jīng)RA處理5天后的EC8712細胞中提取RNA，采用Okayama和Berg的克隆系統(tǒng)(H.Okayama & P.Berg，Mol.Cell.Biol.，2(1982)，161-170；H.Okayama & P.Berg，Mol.Cell.Biol.，3(1983)，280-289)構(gòu)建細胞分化前后的兩個cDNA文庫，并經(jīng)遞減雜交法從后一文庫中篩選具有促進腫瘤細胞分化功能的cDNA克窿，得到一個cDNA克隆，即所述的序列1。實施例3 序列1的核苷酸序列測定按照圖1所示的測序策略對實施例2中的序列1進行核苷酸序列測定，其中分別進行雙鏈測序及單鏈測序。測得的DNA序列如下文序列表中序列標識號為1的序列。
雙鏈測序是利用序列1中已知的限制性內(nèi)切酶位點將序列1切成大小不等的片段，將這些片段亞克隆至質(zhì)粒pUC18和pUC19中，用pUC/M13通用引物以雙脫氧中止法對此亞克隆進行測序。
單鏈測序是用限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI從實施例2中得到的含有序列1的cDNA克隆中切下3.8kb的cDNA插入序列，再將其亞克隆至M13mp18和M13mp19中利用已知的序列合成引物測序，測序試劑盒為Pharmacia公司的T7 Sequencing Kit，測序方法是按照廠家的說明進行。實驗例1 序列1的同源性分析用Beckman公司的Micro Genie分析軟件，HITACHI公司的DNAsis分析軟件對序列1進行編輯和分析，其中DNAsis軟件中的EMBL和Gene Bank數(shù)據(jù)庫為1994年版。同源比較的結(jié)果是，所述的序列1有兩個區(qū)域與小鼠及人的c-myc原癌基因第二、第三外顯子有相當高的互補同源性，兩個同源區(qū)域共1540bp，約占基因總長的40％。第一同源區(qū)從第1224bp至1954bp，第二同源區(qū)從第2985bp至3805bp。實驗例2 序列1的生物學功能的鑒定采用Lipofectin(GIBCO BRL，美國)方法將含序列1的真核表達載體pCDV1轉(zhuǎn)染EC109細胞系(人食管癌細胞系，由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所構(gòu)建)，轉(zhuǎn)染方法參照產(chǎn)品說明進行。
材料來源質(zhì)粒pDORneo，英國皇家癌癥研究基金會Morgenstern和Land博士惠贈；脂質(zhì)體Lipofectin及新霉素G418，購自美國BRL公司；培養(yǎng)基M199為GIBCO-BRL產(chǎn)品。
實驗組pCDV1-序列1與pDOR-neo共轉(zhuǎn)染，DNA用量分別為15μg和3μg，Lipofectin 40μg；對照組只轉(zhuǎn)染pDOR-neo DNA 3μg，Lipofectin 40μg；空白對照組不轉(zhuǎn)染任何DNA及生物制劑。轉(zhuǎn)染12小時后換含有20％胎牛血清的M199培養(yǎng)液，在含5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)48小時，然后加入終濃度為500μg/ml的G418篩選，當G418抗性克隆出現(xiàn)后改為用100μg/ml的G418維持。
轉(zhuǎn)染序列1后的G418抗性克隆中有兩類其細胞生長明顯受到抑制，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，如圖3和圖4所示，圖5為未轉(zhuǎn)染序列1的EC109細胞。其中圖3所示的細胞克隆其細胞體積較小，生長狀態(tài)很差，細胞很快脫落死亡，形成的克隆很小；圖4所示的細胞克隆其細胞體積變大，胞漿豐富且出現(xiàn)許多空泡，細胞邊界不清，能形成克隆，但生長狀態(tài)不好，在培養(yǎng)過程中細胞逐漸脫落死亡。由此證明本發(fā)明的序列1對腫瘤細胞有明顯的抑制生長的作用，并誘導其發(fā)生終末分化與凋亡。
序列表序列標識號1序列長度3805bp鏈數(shù)單鏈分 子 型cDNA特征有兩個區(qū)域與人和小鼠的c-myc原癌基因的第二、第三外顯子有較高的互補同源性，其中第一同源區(qū)從1224bp-1954bp，第二同源區(qū)從2985bp-3805bp來源人性質(zhì)具有促進腫瘤細胞分化功能的cDNAGGATCCTCTC GGGGAAACTG AGTTCCAGTG TCATGGGTGA ACAACAGAAG AGACTAGCTA 60ATTCTTGTAT ATCCCAGACC AAGCTGAAAG CTCCTCCCAC TTCACCCCTC ATCGTGATTG 120TTATCTATAA ATTTGATTGC ACAATGTTGC AGACCCCTGG GACTCCAGAT TGGCTGGGAG 180AGCCTTCCTG TGTTATGGTC AAGATCAGCC TGACTTTCTG GAAGGAAGCT GGCCGATGTC 240CTGTTTTCAG ACCATTCCCT GGCTTGGTAA AGCTGAGAAG TGCCCAGATA GGGAGCTGTG 300ATACTTCGAT TCCATCCCCA CAGCCAAATC TGAATCTCTA AACTTGTTTC CTGATCATTT 360GGAACAGGAG TTGTTTTCCT AATGAGGAAT GCTTTCCTCT ATTCTTTGGG CTTGCCTGGA 420CTGAGTGATT CAACCTAACA CCTTCCCAGG TCTCAAGTGA GTCACCCCAG GGCTGCACTC 480CAGCCTAGGC TCACAAAGGG GAAAAAGAGG GAACTATTTA AGAGCACCCC CTGCTCCCCC 540CTTTTGCTAA TCCTTTGAAC TACTCAAAGT ATTTCAAACT ACTACTGGGG TTTGTGTTTT 600CTTTTGAATG TAGGATAGAG GGTGTAACAG TTTGAAGCTG AGGGTGAGTC TAAAAGAGCC 660AAAAATAAGA TCAAAAACTA AATGTTAAAC GCTTCAATAG ATCATGGGGG GGGGGTGTCA 720AAGATAGTAA TTACTTATTG GTTTATGAAT GATGGTGAAT TAAAGTCCCA AAGACACTCC 780AGGATGCTAG AGACCTTCTC TGAGCAAATG GGGTCATTTA GGACATTTAG GGTACCTTTC 840TCCCTGGACT TTACCTACAT GTTTCAGTTT CTGGTTTGGA TTGTGGCTTT TCAGAGGCTT 900ATAATTAATA AGATACCTGT TCCAAAAGGC TTTCTCATGG GCCATTGATG AGCGTGTGTC 960ATGAGTGTGA GAAAGTGCTT GGGAGGAAGG CGAGCTTGCA ATTTCTAAAA TAATGACTCA1020TGTAAAACAA GGTTTTATTT TATGATCTGA CCAGTAGCAC TTCTAAACTG GCTTCTTCCC1080AGGAGCAAGC AGGGATCTGA TTTTAAAAAC TAAGTGGGTA AGGTAGGAGT GAGCTATGTG 1140CCTCTGAGTA CACACAACAC CCTCCACCCC AACCCCCCAA TCCACAAACA AGGAGGGGAA 1200CTGAAGTCTA CCAGTTCTTG AGTAGTCAAG CTTACAGTCC CAAAGCCCCA GCCAAGGTTG 1260TGAGGTTAGG CTTTGAGCAT GCATTTTAAT TCCAGCGCAT CAGTTCTGTC AGAAGGAACC 1320GTTCTCCTTA CTCTCACGAG AGATTCCAGC TCCTCCTCGA GTTAGGTCAG TTTATGCACC 1380AGAGTTTCGA AGCTGTTCGA GTTTGTGTTT CAACTGTTCT CGTCGTTTCC TCAATAAGTC 1440CTTTTCAGAG GTGAGCTTGT GCTCGTCTGC TTGAATGGAC AGGATGTAGG CGGTGGCTTT 1500TTTGAGGATC ACTACCTTGG GGGCCTTTTC GTTGTTTTCC AATTCAGGGA TCTGGTCACG 1560CAGGGCAAAA AAGCTGCGCT TCAGCTCGTT CCTCCTCTGA CGTTCCAAGA CGTTGTGTGT 1620CCGCCTCTTG TCGTTTCCTC CGTGTCTGAG GACCTGGGGC TGGAGCACTT GGGGTTGTTG 1680CTGATCTGCT TCAGGACCCT GCCACTGTCC AACTTGGCCC TCTTGGCAGC TGGATAGTCC 1740TTCCTTGTGG AGGGGGGTGC GGCGTAGTTG TGCTGGTGAG TGGAGACGTG GCACCTCTTG 1800AGGACCAGTG GGCTGTGCGG AGGTTTGCTG TGGCCTCGGG ATGGAGATGA GCCCGACTCC 1860GACCTCTTGG CAGGGGTTTG CCTCTTCTCC ACAGACACCA CATCAATTTC TTCCTCATCT 1920TCTTGCTCTT CTTCTGTAAG GGAGGAAGTG GAAGATCACA GTTAGCCACG CCTCCTGAAT 1980CCCGGAGCCT ATACATAGGA TTTGACCGAT GCTATCCAAA TACCAAGTTG GAAAGGGAAG 2040AAAGTAAGAA TCAGATCCAG ACACCATCTT CCCTTCTCCC AGAAAGGCAG ACAGGGTTAG 2100GGCACAGGTG AGAAATTACC ATGTACCAGG ATATGGTATC CTTGCCAATT CTTACCTAAG 2160ATTTAATGAG GCTTCAGACA CACCCAAAGC AAAGCACATT TCCCAAGCAC CTCCTATTTT 2220TAAGGGACTT TACCGAGAAC CTTTCAGGTC CCGTGAGGGA TAGCTGCAAA TCTCTTGCTA 2280TGACTTTAGC AACTCCCTAT TTTACTGGAA GCACAATTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2340GTCTTGCAGC TTTGCCAAAC GTCCTGGTGT TGGGGGAGTG TTGGGACGGG GGGAGAAGTC 2400CAAATTGAAC AGAATTTGCT TTGAAGTGTT CAAAAGAGGA CGAAAAAACA AAGCAAAACA 2460AAACACCCAA AAGAGCCCAG CTCTTCAATT CTTTAGGAAC TTTCACTAGT GCCTGGCTCT 2520AAGGCTATAA AGGCTATCCC AGCTTCTGTC ATTGCTTCTC TTGGGTCTTA GACAA CGTA 2580TCCATTAAAT TCAAATATTC TTCTGGCAGT CAAGAAAAGA AGCAGGTAAT TCACCCCCCT 2640CCAGATCAGT TCCTTTATCC TCATTCACAC CCTTCCCAGG GTAATTAAAA TGCTTAGGAG 2700GGGTAAAGGG AGTGGATGGA GCTGAAAGAT AAGCCAGAAG ATTTAAAAAC CCAAATGAAA 2760TTCCTGAGGG GTGGGAAGGG TGGGGGGTGG GGGTGACAAC CAGGGCGGTC TGGGGGGGGG 2820GGGGAGGGGA GGGAGGGATA GCTGAAGCAC GGGAATCCAG GGATGAAGAG CTCTTAGACA 2880GAAGGGAAAG AAAGGGGGAG CCCCGGAGGC CAATTGAATT AATGCCAATG AGTGGTGGAG 2940AAGGAGGTCC ATCCAACCTC TCGCTTCCTA CCCTGCTGTG AATGGGGTAG CTTACCAGAG 3000TCGCTGCTGG TGGTGGGCGG TGTCTCCTCA TGCAGCACTA GGGGCTCAGG GCTGGCCCGT 3060GGGGAGGACT CGGAGGACAG CAGCGAGTCC GAGGAAGGAG AGAAGGCCGT GGAATCGGAC 3120GAGGTACAGG ATTTGGGCGA GCTGCTGTCG TTGAGCGGGT AGGGAAAGAC CACTGAGGGG 3180TCAATGCACT CGGACGCGGC GGCGGTGAGG TCCTGCAGGT ACAGGCTGGA GGTGGAGCAG 3240ACGCTGTGCC CGCGGGCGGG GCTCAGGCTG GTGCTGTCTT TGCGCGCAGC CTGGTAGGAG 3300GCCAGCTTCT CCGAGACCAG CTTGGCAGCG GCTGAGAAAC CGCTCCACAT ACAGTCCTGG 3360ATGATGATGT TCTTGATGAA GGTCTCGTCG TCAGGATVGC AGATGAAGCT CTTGTTCACC 3420ATGTCTCCTC CAAGTAACTC GGTCATCATC TCCAGCTGAT GATCGGCGGT GGAGAAGTTG 3480CCACCGCCGC CGTCATCGTC TTCCCTTGGG GAGAAGGACG TAGCGACCGC AACATAGGAT 3540GGAGAGCAGA GCCCGGAGCG GCGGCTCGGG GACAGGGGCG GGGTGGGAAG CAGCTCGAAT 3600TTCTTCCAGA TATCCTCACT GGGCGCGGGC GGCTGCAGCT CGCTCTGCTG TTGCTGGTGA 3660TAGAAATTCT CTTCCTCGTC GCAGATGAAA TAGGGCTGTA CGGAGTCGTA GTCGAGGTCA 3720TAGTTCCTGT TGGTGAAGTT CACGTTGAGG GGCATCGTCG TGGCTGTCTG CTGGAGGGGG 3780CACAGCAAGG GAAGCAAGTC TAGAG380權(quán)利要求
1.一種具有促進腫瘤細胞分化功能的cDNA序列，其特征是所述的cDNA序列為GGATCCTCTC GGGGAAACTG AGTTCCAGTG TCATGGGTGA ACAACAGAAG AGACTAGCTA 60ATTCTTGTAT ATCCCAGACC AAGCTGAAAG CTCCTCCCAC TTCACCCCTC ATCGTGATTG 120TTATCTATAA ATTTGATTGC ACAATGTTGC AGACCCCTGG GACTCCAGAT TGGCTGGGAG 180AGCCTTCCTG TGTTATGGTC AAGATCAGCC TGACTTTCTG GAAGGAAGCT GGCCGATGTC 240CTGTTTTCAG ACCATTCCCT GGCTTGGTAA AGCTGAGAAG TGCCCAGATA GGGAGCTGTG 300ATACTTCGAT TCCATCCCCA CAGCCAAATC TGAATCTCTA AACTTGTTTC CTGATCATTT 360GGAACAGGAG TTGTTTTCCT AATGAGGAAT GCTTTCCTCT ATTCTTTGGG CTTGCCTGGA 420CTGAGTGATT CAACCTAACA CCTTCCCAGG TCTCAAGTGA GTCACCCCAG GGCTGCACTC 480CAGCCTAGGC TCACAAAGGG GAAAAAGAGG GAACTATTTA AGAGCACCCC CTGCTCCCCC 540CTTTTGCTAA TCCTTTGAAC TACTCAAAGT ATTTCAAACT ACTACTGGGG TTTGTGTTTT 600CTTTTGAATG TAGGATAGAG GGTGTAACAG TTTGAAGCTG AGGGTGAGTC TAAAAGAGCC 660AAAAATAAGA TCAAAAACTA AATGTTAAAC GCTTCAATAG ATCATGGGGG GGGGGTGTCA 720AAGATAGTAA TTACTTATTG GTTTATGAAT GATGGTGAAT TAAAGTCCCA AAGACACTCC 780AGGATGCTAG AGACCTTCTC TGAGCAAATG GGGTCATTTA GGACATTTAG GGTACCTTTC 840TCCCTGGACT TTACCTACAT GTTTCAGTTT CTGGTTTGGA TTGTGGCTTT TCAGAGGCTT 900ATAATTAATA AGATACCTGT TCCAAAAGGC TTTCTCATGG GCCATTGATG AGCGTGTGTC 960ATGAGTGTGA GAAAGTGCTT GGGAGGAAGG CGAGCTTGCA ATTTCTAAAA TAATGACTCA 1020TGTAAAACAA GGTTTTATTT TATGATCTGA CCAGTAGCAC TTCTAAACTG GCTTCTTCCC 1080AGGAGCAAGC AGGGATCTGA TTTTAAAAAC TAAGTGGGTA AGGTAGGAGT GAGCTATGTG 1140CCTCTGAGTA CACACAACAC CCTCCACCCC AACCCCCCAA TCCACAAACA AGGAGGGGAA 1200CTGAAGTCTA CCAGTTCTTG AGTAGTGAAG CTTACAGTCC CAAAGCCCCA GCCAAGGTTG 1260TGAGGTTAGG CTTTGAGCAT GCATTTTAAT TCCAGCGGAT CAGTTCTGTC AGAAGGAACC 1320GTTCTCCTTA CTCTCACGAG AGATTCCAGC TCCTCCTCGA GTTAGGTCAG TTTATGCACC 1380AGAGTTTCGA AGCTGTTCGA GTTTGTGTTT CAACTGTTCT CGTCGTTTCC TCAATAAGTC 1440CTTTTCAGAG GTGAGCTTGT GCTCGTCTGC TTGAATGGAC AGGATGTAGG CGGTGGCTTT 1500TTTGAGGATC ACTACCTTGG GGGCCTTTTC GTTGTTTTCC AATTCAGGGA TCTGGTCACG 1560CAGGGCAAAA AAGCTGCGCT TCAGCTCGTT CCTCCTCTGA CGTTCCAAGA CGTCGTGTGT 1620CCGCCTCTTG TCGTTTCCTC CGTGTCTGAG GACCTGGGGC TGGAGCACTT GCGGTTGTTG 1680CTGATCTGCT TCAGGACCCT GCCACTGTCC AACTTGGCCC TCTTGGCAGC TGGATAGTCC 1740TTCCTTGTGG AGGGGGGTGC GGCGTAGTTG TGCTGGTGAG TGGAGACGTG GCACCTCTTG 1800AGGACCAGTG GGCTGTGCGG AGGTTTGCTG TGGCCTCGGG ATGGAGATGA GCCCGACTCC 1860GACCTCTTGG CAGGGGTTTG CCTCTTCTCC ACAGACACCA CATCAATTTC TTCCTCATCT 1920TCTTGCTCTT CTTCTGTAAG GGAGGAAGTG GAAGATCACA GTTAGCCACG CCTCCTGAAT 1980CCCGGACGCT ATACATAGGA TTTGACCGAT GCTATCCAAA TACCAAGTTG GAAAGGGAAG 2040AAAGTAAGAA TCAGATCCAG ACACCATCTT CCCTTCTCCC AGAAAGGCAG ACAGGGTTAG 2100GGCACAGGTG AGAAATTACC ATGTACCAGG ATATGGTATC CTTGCCAATT CTTACCTAAG 2160ATTTAATGAG GCTTCAGACA CACCCAAAGC AAAGCACATT TCCCAAGCAC CTCCTATTTT 2220TAAGGGACTT TACCGAGAAC CTTTCAGGTC CCGTGAGGGA TAGCTGCAAA TCTCTTGCTA 2280TGACTTTAGC AACTCCCTAT TTTACTGGAA GCACAATTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2340GTCTTGCAGC TTTGCCAAAC GTCCTGGTGT TGGGGGAGTG TTGGGACGGG GGGAGAAGTC 2400CAAATTGAAC AGAATTTGCT TTGAAGTGTT CAAAAGAGGA CGAAAAAACA AAGCAAAACA 2460AAACACCCAA AAGAGCCCAG CTCTTCAATT CTTTAGGAAC TTTCACTAGT GCCTGGCTCT 2520AAGGCTATAA AGGCTATCCC AGCTTCTGTC ATTGCTTCTC TTGGGTCTTA GACAAACGTA 2580TCCAATAAAT TCAAATATTC TTCTGGCAGT CAAGAAAAGA AGCAGGTAAT TCACCCCCCT 2640CCAGATCAGT TCCTTTATCC TCATTCACAC CCTTCCCAGG GTAATTAAAA TGCTTAGGAG 2700GGGTAAAGGG AGTGGATGGA GCTGAAAGAT AAGCCAGAAG ATTTAAAAAC CCAAATGAAA 2760TTCCTGAGGG GTGGGAAGGG TGGGGGGTGG GGGTGACAAC CAGGGCGGTC TGGGGGGGGG 2820GGGGAGGGGA GGGAGGGATA GCTGAAGCAC GGGAATCCAG GGATGAAGAG CTCTTAGACA 2880GAAGGGAAAG AAAGGGGGAG CCCCGGAGGC CAATTGAATT AATGCCAATG AGTGGTGGAG 2940AAGGAGGTCC ATCCAACCTC TCGCTTCCTA CCCTGCTGTG AATGGGGTAG CTTACCAGAG 3000TCGCTGCTGG TGGTGGGCGG TGTCTCCTCA TGCAGCACTA GGGGCTCAGG GCTGGCCCGT 3060GGGGAGGACT CGGAGGACAG CAGCGAGTCC GAGGAAGGAG AGAAGGCCGT GGAATCGGAC 3120GAGGTACAGG ATTTGGGCGA GCAGCTGTCG TTGAGCGGGT AGGGAAAGAC CACTGAGGGG 3180TCAATGCACT CGGACGCGGC GGCGGTGAGG TCCTGCAGGT ACAGGCTGGA GGTGGAGCAG 3240ACGCTGTGCC CGCGGGCGGG GCTCAGGCTG GTGCTGTCTT TGCGCGCAGC CTGGTAGGAG 3300GCCAGCTTCT CCGAGACCAG CTTGGCAGCG GCTGAGAAAC CGCTCCACAT ACAGTCCTGG 3360ATGATGATGT TCTTGATGAA GGCTTCGTCG TCAGGATCGC AGATGAAGCT CTTGTTCACC 3420ATGTCTCCTC CAAGTAACTC GGTCATCATC TCCAGCTGAT GATCGGCGGT GGAGAAGTTG 3480CCACCGCCGC CGTCATCGTC TTCCCTTGGG GAGAAGGACG TAGCGACCGC AACATAGGAT 3540GGAGAGCAGA GCCCGGAGCG GCGGCTCGGG GACAGGGGCG GGGTGGGAAG CAGCTCGAAT 3600TTCTTCCAGA TATCCTCACT GGGCGCGGGC GGCTGCAGCT CGCTCTGCTG TTGCTGGTGA 3660TAGAAATTCT CTTCCTCGTC GCAGATGAAA TAGGGCTGTA CGGAGTCGTA GTCGAGGTCA 3720TAGTTCCTGT TGGTGAAGTT CACGTTGAGG GGCATCGTCG TGGCTGTCTG CTGGAGGGGG 3780CACAGCAAGG GAAGCAAGTC TAGAG3805
2.如權(quán)利要求1所述的cDNA序列，其特征是所述的序列是從全反式維甲酸誘導的人食管癌細胞系EC8712中分離得到。
3.一種含有如權(quán)利要求1所述的cDNA序列的真核表達載體。
4.如權(quán)利要求5所述的真核表達載體，其中所述的真核表達載體是含有所述的cDNA序列的質(zhì)粒RATS1，所述的質(zhì)粒已在中國典型培養(yǎng)物中心保藏，保藏號為CCTCC M 95005。
5.一種如權(quán)利要求1所述的cDNA序列在制備基因治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述的腫瘤的種類可以是鱗狀細胞癌、白血病和腺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有促進腫瘤細胞分化功能的cDNA序列、含有該序列的真核表達載體以及該序列在制備基因治療腫瘤的制劑中的應(yīng)用。所述的cDNA序列是從由全反式維甲酸處理的人食管癌細胞系EC8712中分離得到。
文檔編號A61K48/00GK1128798SQ9510129
公開日1996年8月14日 申請日期1995年2月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月7日
發(fā)明者吳旻, 馮駱, 王志華, 王秀琴 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院, 中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所