專利名稱：：基因AtPAP15在提高大豆植株有機(jī)磷吸收利用方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種紫色酸性磷酸酶基因Jt/^尸75在提高大豆植株有機(jī)磷吸收利用方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大豆(677"Ve鵬》是我國(guó)重要的糧食和油料作物。在幾種主、要糧食作物中，大豆蛋白質(zhì)含量最高，是水稻的4.6倍、小麥的近3倍，所以大豆是人類理想的植物蛋白來(lái)源(王文真等，1998)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，大豆根系具有生物固氮能力，能夠培肥地力、改良土壤結(jié)構(gòu)、肥地養(yǎng)地。因此，發(fā)展大豆生產(chǎn)對(duì)改善我國(guó)人民的食物結(jié)構(gòu)，滿足市場(chǎng)對(duì)植物蛋白、油脂的需求，發(fā)展畜牧業(yè)、食品業(yè)，及保護(hù)生態(tài)環(huán)境都具有十分重要的意義。但大豆生產(chǎn)往往會(huì)受到許多生物和非生物脅迫的影響，產(chǎn)量很不穩(wěn)定。尤其是在我國(guó)華南地區(qū)酸性紅壤上，缺磷和鋁毒是限制大豆生產(chǎn)的主要障礙因子(Liaoetal，2006)。磷是植物能量代謝中的重要物質(zhì)，也是核酸和生物膜的重要組成成分(Guoetal，2008)。因此，磷是植物正常生長(zhǎng)和發(fā)育的必需營(yíng)養(yǎng)元素之一。然而，大部分土壤中磷的有效性較低，不能滿足作物生長(zhǎng)的需求。增施磷肥可以促進(jìn)作物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量。但增施的磷肥中只有1020。％的磷被當(dāng)季作物吸收利用(Holford，1997),其余大部分被土壤中的有機(jī)物或鐵鋁的氧化膠膜所固定轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰妆恢参镂绽玫臒o(wú)機(jī)磷或有機(jī)磷(Raghothama，1999)。土壤中有5080%的磷是以有機(jī)磷的形式存在(Turneretal，2002)，其中，難以被作物利用的植酸磷(多為鹽的形式)大約占土壤有機(jī)磷的60%(Iyamuremyeetal，1996)。然而，無(wú)機(jī)磷酸根離子是植物直接吸收磷的主要形式，這些有機(jī)磷只有在磷酸酶的作用下礦化分解，釋放出無(wú)機(jī)磷后才能被吸收利用(Gilbertetal，1999)。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法改良作物合成分泌植酸酶的能力，是有效地提高作物吸收利用土壤有機(jī)磷、解決限制大豆生產(chǎn)中缺磷這一主要障礙因子的潛在途徑(孔凡利等，2006)。植物酸性磷酸酶基因和來(lái)源于真菌的植酸酶基因或人工合成的植酸酶基因都有增加土壤中磷吸收的潛力(Xiaoetal，2006)。其中，植酸酶基因研究的主要目的還是利用植物生產(chǎn)植酸酶作為動(dòng)物飼料添加劑，改善動(dòng)物對(duì)飼料中植酸磷的利用。盡管有很多關(guān)于轉(zhuǎn)植酸酶基因植物的報(bào)道，但這些研究多是使植酸酶在子葉和種子中表達(dá)，來(lái)幫助動(dòng)物消化吸收利用詞料中的植酸磷(Ponsteinetal，2002)。有關(guān)利用轉(zhuǎn)植酸酶基因植物分泌植酸酶到根際中來(lái)利用介質(zhì)中植酸磷的報(bào)道并不多見(jiàn)(Richardsonetal，2001a;Mudgeetal，2003;Georgeetal，2004)，且多是利用真菌的植酸酶基因，利用來(lái)源于植物的植酸酶基因提高磷吸收的研究鮮有報(bào)道(Xiaoetal，2007)。酸性磷酸酶同樣參與了土壤有機(jī)磷的水解，釋放出可溶性磷供植物吸收。而利用來(lái)源于植物的酸性磷酸酶基因提高植物吸收和利用植酸磷能力的報(bào)道更加少見(jiàn)(Xiaoetal，2006)，轉(zhuǎn)基因大豆在這方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。并且，考慮到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)條例以及市場(chǎng)的接受度，研究能提高植物吸收和利用植酸磷能力的來(lái)源于植物本身的基因更加重要和迫切。紫色酸性磷酸酶作為一種多功能的酶，在正常磷和缺磷條件下均對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育起著重要的作用(Zhuetal，2005)。到目前為止，在擬南芥上己有29個(gè)紫色酸性磷酸酶基因被鑒定(Lietal，2002)。其中，Hegeman和Grabau(2001)發(fā)現(xiàn)大豆的一個(gè)植酸酶基因GmPhy與擬南芥的力^^尸/5有74.1°/。的相似性，預(yù)示著J^M尸75具有植酸酶活性。Zhang等(2008)通過(guò)體內(nèi)和體外的酶活性評(píng)價(jià)進(jìn)一步證明J^^W5具有較強(qiáng)的植酸酶活性，能促進(jìn)肌醇六磷酸鹽的水解產(chǎn)生肌醇和水溶性磷酸鹽，并且在根部的表達(dá)量最高。此外，有研究表明擬南芥不能利用植酸鹽中的磷主要是由于缺乏細(xì)胞外植酸酶活性(Richardsonetal，2001b)。上述研究尚停留在理論研究Jt/W^5具有較強(qiáng)的植酸酶活性階段，目前并無(wú)關(guān)于」t用尸75在大豆中表達(dá)并提高大豆植株對(duì)有機(jī)磷的活化、吸收和利用的具體技術(shù)方案的相關(guān)技術(shù)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供基因J^^F75在提高大豆植株有機(jī)磷吸收利用方面的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述基因」t/^尸75在大豆植株中的表達(dá)方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供了基因Z^^尸75在提高大豆植株有機(jī)磷吸收利用效率方面的應(yīng)用。所述應(yīng)用是在大豆中超量表達(dá)編碼紫色酸性磷酸酶的基因"尸H所述紫色酸性磷酸酶基因v^/M/^5是從TAIR(TheArabidopsisInformationResource)網(wǎng)站上獲得的全長(zhǎng)cDNA序列(Locus:At3g07130)。該基因全長(zhǎng)cDNA為1676bp，編碼532個(gè)氨基酸，包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。通過(guò)PCR方法，擴(kuò)增出J^M/^5基因的編碼區(qū)，并融合來(lái)自于胡蘿卜的信號(hào)肽(Limgetal.，2005)，由強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)，連接到超量表達(dá)載體pTF101.1上。再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在大豆品種粵春03-3中，超量表達(dá)這個(gè)基因，得到超量表達(dá)植株。在轉(zhuǎn)基因L和T3代植株中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性植株的吸磷量和生物量都顯著高于陰性植株。實(shí)現(xiàn)所述應(yīng)用的表達(dá)方法包括以下步驟(1)以力^^尸75的基因組片段作為應(yīng)用基因，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出Jt/M尸75基因的編碼區(qū)，并融合來(lái)自于胡蘿卜的信號(hào)肽(Lungetal.，2005)，由強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)，連接到超量表達(dá)載體pTF101.1上；(2)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在大豆中超量表達(dá)所述基因，得到超量表達(dá)大豆植株。步驟(1)所述引物為左端引物(5'-3，):ATGACGTTTCTACTACTTCTAC;8右端引物(5'-3，):TTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAATGGTTAACAAGGCGGT。所述大豆品種選用粵春03-3。采用根癌農(nóng)桿菌EHA101介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化方法，在大豆品種粵春03-3中，超量表達(dá)^t/^/^5基因，得到超量表達(dá)J^M/V5的大豆植株。遺傳轉(zhuǎn)化包括以下步驟(1)種子消毒和種子萌發(fā)；(2)根癌農(nóng)桿菌EHA101菌液制備；(3)外植體制備及轉(zhuǎn)化程序；(4)侵染與共培養(yǎng)；(5)幼芽的誘導(dǎo)、伸長(zhǎng)(6)幼芽生根，得到轉(zhuǎn)基因單株T。代植株。選擇超表達(dá)的植株，進(jìn)行繁種，得到轉(zhuǎn)基因后代植株。本發(fā)明不僅優(yōu)化了受體大豆品種，而且在遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，對(duì)種子滅菌時(shí)間、抑菌劑種類及配比也進(jìn)行了優(yōu)化，例如上述步驟(1)所述種子消毒包括以下步驟(1)將大豆種子單層排列在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于干燥器內(nèi)，打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子，干燥器內(nèi)同時(shí)放置一個(gè)燒杯，向燒杯中加入次氯酸鈉溶液，并緩緩加入HC1溶液，蓋上干燥器蓋子，靜置過(guò)夜；(2)蓋上培養(yǎng)皿并將其放到層流凈化罩中后將培養(yǎng)皿打開(kāi)，除去過(guò)多的氯氣。所述HC1溶液濃度為12N，加入量按照次氯酸鈉與HC1溶液的體積比為100mL:4.2mL。所述靜置過(guò)夜時(shí)間為13.5小時(shí)。上述步驟(5)所述幼芽誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)包括以下步驟(1)外植體共培養(yǎng)后，用加有g(shù)lufosinate作為篩選劑，特美汀和頭孢霉素作為抑菌劑的液體幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SI)浸洗，之后，將外植體放在SI固體培養(yǎng)基上。14天后，在形成中的節(jié)的部位齊平地切去子葉下胚軸。將新鮮的切口表面插入至新的SI固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)14天。(2)將分化的外植體轉(zhuǎn)移到新鮮的加有g(shù)lufosinate作為篩選劑，特美汀和頭孢霉素作為抑菌劑的SE培養(yǎng)基上。每隔2周換一次新鮮的SE培養(yǎng)基。所述抑菌劑為100mg/L特美汀和200mg/L頭孢霉素。本發(fā)明構(gòu)建了力t/M尸25過(guò)量表達(dá)載體，并在Jt/^尸75前加入了來(lái)源于胡蘿卜的信號(hào)肽，成功引導(dǎo)^^^/75誘導(dǎo)產(chǎn)生的紫色酸性磷酸酶在細(xì)胞壁分泌，在大豆中超量表達(dá)了編碼紫色酸性磷酸酶的基因，轉(zhuǎn)Zt/^/^5基因植株顯著提高了對(duì)有機(jī)磷的活化、吸收和利用，研究結(jié)果對(duì)培育磷高效大豆新品種具有重要的意義，在生產(chǎn)上具有較大的應(yīng)用前景。本發(fā)明的有益效果概括如下(1)本發(fā)明提供了一種擬南芥紫色酸性磷酸酶基因力^^/^5的應(yīng)用。在大豆品種粵春03-3中超量表達(dá)編碼紫色酸性磷酸酶的基因J^M尸75后，在植酸磷作為唯一磷源的砂培條件下，轉(zhuǎn)基因大豆植株根部酸性磷酸酶活性比其對(duì)應(yīng)的野生型對(duì)照大豆提高了42.2181.44%;根系分泌的植酸酶活性比其對(duì)應(yīng)的野生型對(duì)照大豆提高了50.11159.32%;轉(zhuǎn)基因大豆植株磷吸收量比其對(duì)應(yīng)的野生型對(duì)照大豆提高了18.1990.08%;轉(zhuǎn)基因大豆植株生物量比其對(duì)應(yīng)的野生型對(duì)照大豆提高了56.45117.78%。(2)通過(guò)與來(lái)自于胡蘿卜的信號(hào)肽(Lungetal.，2005)融合，可以引導(dǎo)j^^尸75誘導(dǎo)產(chǎn)生的酸性磷酸酶在根部分泌，并藉此分解根外環(huán)境的有機(jī)磷而釋放可被植物直接吸收利用的無(wú)機(jī)磷，從而提高大豆的生長(zhǎng)。這是一項(xiàng)能有助于減少對(duì)環(huán)境構(gòu)成烕脅的磷肥的使用、并對(duì)國(guó)家未來(lái)可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展提供有利支持的新技術(shù)。(3)本發(fā)明首次在大豆中超量表達(dá)一個(gè)影響有機(jī)磷吸收利用效率的基因力^^尸75，為培育大豆磷高效品種提供了新的思路，也為其它作物利用轉(zhuǎn)基因方法提高養(yǎng)分效率提供了技術(shù)支持。(4)本發(fā)明中應(yīng)用的基因可以為大豆等豆科作物以及其它作物的養(yǎng)分高效研究提供理論支持。圖l超表達(dá)轉(zhuǎn)化載體的結(jié)構(gòu)示意圖具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明在實(shí)施例中描述了分離Jf/^尸75基因，遺傳轉(zhuǎn)化，以及酸性磷酸酶活性、植酸酶活性、吸磷量和生物量的測(cè)定方法和所述基因在大豆中的表達(dá)模式，但并不因此將本發(fā)明精神和范圍限定于具體的實(shí)施例中。實(shí)施例1超量表達(dá)轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建從TAIR(TheArabidopsisInformationResource)上獲得編碼紫色酸性磷酸酶基因Jt"尸75的全長(zhǎng)cDNA序列(Locus:At3g07130)。該基因全長(zhǎng)cDNA為1676bp，編碼532個(gè)氨基酸，包括6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。根據(jù)基因J^4W5的已知全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以擬南芥cDNA為模板，擴(kuò)增得到包括該基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的1599bp片段，并融合來(lái)自于胡蘿卜的信號(hào)肽(Lungetal.，2005)，由強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)，連接到超量表達(dá)載體pTFlOl.1(美國(guó)依阿華州立大學(xué)轉(zhuǎn)基因中心王凱博士惠贈(zèng)，Pazetal，2004)上，然后再用設(shè)計(jì)的引物對(duì)得到的克隆進(jìn)行測(cè)序，確定基因按正確的方向連接到pTFlOl.l載體上。pTFlOl.1載體包含除草劑的篩選基因，見(jiàn)附圖1，其中1表示左邊界，2表示NOS終止子，3表示Bar基因，4表示35S啟動(dòng)子，5表示35S啟動(dòng)子，6表示胡蘿卜信號(hào)肽，7表示J^^。75基因，8表示NOS終止子，9表示右邊界。由附圖1可見(jiàn)Jz^4尸75基因被35S啟動(dòng)子超表達(dá)。左端引物(5'-3'):ATGACGTTTCTACTACTTCTAC右端引物(5'-3，):TTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAATGGTTAACAAGGCGGT實(shí)施例2超量表達(dá)AtPAP15的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)包含編碼紫色酸性磷酸酶的」t/^尸75基因片段連接到載體pTF101.1上后，采用轉(zhuǎn)基因的方法，得到轉(zhuǎn)基因的大豆植株，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因方法具體步驟如下將得到的正確克隆的質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到大豆品種粵春03-3中，經(jīng)過(guò)種子萌發(fā)、子葉節(jié)侵染、共培養(yǎng)、幼芽誘導(dǎo)和幼芽伸長(zhǎng)等過(guò)程，具有除草劑抗性的幼芽伸長(zhǎng)、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。所述農(nóng)桿菌(EHA101)介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系主要參考Paz等人報(bào)道的方法(參見(jiàn)AssessmentofconditionsaffectingAgrobacterium-mediatedsoybeantmnsformationusingthecotyledonarynodeexplaMs，2004，Euphytica，136:167-179)。本試驗(yàn)過(guò)程中，在種子滅菌時(shí)間，抑菌劑種類及配比，受體大豆品種等方面進(jìn)行了優(yōu)化。本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述(1)試劑本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的試劑和溶液及縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-節(jié)基腺嘌呤);ZR(Trans-ZeatinRiboside,玉米素核苷)；NM(Napthaleneaceticacid，萘乙酸);IAA(Indole-3-aceticacid,卩引哚乙酸);GA3(Gibberellicacid，赤霉素)；AS(Acetosringone，乙酉先丁香酮);DTT(DL-Dithiothreitol，二硫蘇糖醇);Glufosinate(Glufosinate—ammonium,除草劑)；DMS0(DimethylSulfoxide,二甲基亞砜)；B5max(B5大量元素成分溶液)；B5mix(B5微:元素成分溶液)；B5vit(B5維生素成分溶液)；MSmax(MS大]元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)(2)溶液配方1)B5培養(yǎng)基大量元素母液(按照20倍濃縮液(20X)配制)硝酸鉀(KN03)磷酸二氫鈉(NaH2P042H20)硫酸銨((NH4)2S04)硫酸鎂(MgS047H20)氯化鈣(CaCl22H20)50.OO克3.00克2.68克5.OO克3.OO克將上述試劑逐一溶解，然后用蒸餾水定容至1000毫升。2)B5培養(yǎng)基微量元素母液(按照200倍濃縮液(200X)配制碘化鉀(KI)硼酸(H3B03)硫酸錳(MnS044H20)硫酸鋅(ZnS047H20)鉬酸鈉(Na2Mo042H20)硫酸銅(CuS045H20)氯化鈷(CoCl2.6H20)0.15克0.60克2.00克0.40克0.05克0.005克0.005克將上述試劑在2025。C下溶解并用蒸餾水定容至1000毫升^3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)將3.73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA2H20)和2.78克FeS(V7H20分別溶解，混合并用蒸餾水定容至1000毫升，至7(TC溫浴2小時(shí)，4。C保存?zhèn)溆谩?)B5維生素貯存液(按照100X濃縮液配制)煙酸(Nicotinicacid)維生素B1(ThiamineHC1)維生素B6(PyridoxineHC1)肌醇(Inositol)0.Ol克0.10克0.Ol克l.OO克加蒸餾水定容至1000毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(MSmax母液)(按照20X濃縮液配制)硝酸銨(NH4N03)33.0克硝酸鉀(認(rèn)03)38.0克磷酸二氫鉀(KH2P04)3.4克硫酸鎂(MgS047H20)7.4克氯化鈣(CaCl22H20)8.8克將上述試劑在2025'C溫度下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(MSmin母液)(按照200X濃縮液配制)硫酸錳(MnS044H20)4.46克硫酸鋅(ZnS04*7H20)1.72克硼酸(貼03)碘化鉀(KI)鉬酸鈉(Na2Mo042H20)硫酸銅(CuS045H20)1.24克0.166克0.05克0.005克15氯化鈷(CoCl2'6H20)0.005克將上述試劑在2025t:溫度下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。7)主要抗生素配方100mg/mL氨芐青霉素貯備液1克氨芐青霉素+10mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，-2(TC保存;50mg/mL卡那霉素jJt備液0.5克卡那霉素+10mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，-2(TC保存；50mg/mL氯霉素貯備液0.5克氯霉素十10mL80%乙醇，過(guò)濾滅菌，-2(TC保存；100mg/mL壯觀霉素貯備液1克壯觀霉素+10mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，-2CTC保存；200mg/mL特美汀貯備液1.6克特美汀+8mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，4"保存；250mg/mL頭孢霉素貯備液0.5克頭孢霉素+2mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，-20。C保存。8)主要激素、氨基酸和篩選劑配方1mg/mLGAs貯備液0.0125克GA3+0,25mLINNaOH+12.25mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，4"C保存；1mg/mL6-BA貯備液0.0125克6-BA+0.25mLINNa0H+12.25mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，4"C保存；1mg/mL卩引哚乙酸IAAti備液:0.0125克IAA+0.25mLINNaOH+12.25mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，4"C保存；160.5mg/mLNAA貯備液0.005克NAA+0.2mLNaOH+9,8mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，4'C保存；1mg/mL玉米素核苷貯備液10毫克玉米素+10mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，一20。C保存；10mg/mL天門冬酰胺貯備液0.5克天門冬酰胺+50mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，4'C保存；10mg/mL谷氨酰胺貯備液0.5克谷氨酰胺+50mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，4"C保存；1mg/mL除草劑貯備液0.025克Glufosinate-f25mL雙蒸水，過(guò)濾滅菌，4"C保存。(3)用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)種子萌發(fā)培養(yǎng)基B5max母液(取已經(jīng)制備好的20X濃縮液，下同)50毫升B5mix母液(取已經(jīng)制備好的200X濃縮液，下同)5毫升Fe2+EDTA貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)IO毫升維生素貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同)IO毫升蔗糖20克Phytagel3克加蒸餾水至1000毫升，1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到5.8，高壓滅菌，121。C下滅菌20分鐘，下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的滅菌方法相同。2)共培養(yǎng)基B5max母液(20X)5毫升B5mix母液(200X)0.5毫升Fe2+EDTA貯存液(100X)l毫升蔗糖30克MES3.9克BBLAgar5克加蒸餾水至985毫升，1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到5.4，高壓滅菌培養(yǎng)基降溫至50'C時(shí)加入已過(guò)濾滅菌的10毫升維生素貯存液(100X)，0.25毫升GAs(l毫克/毫升)，1.67毫升6-BA(1毫克/毫升)，400毫克半胱氨酸胺，154.'2毫克二硫蘇糖醇和40毫克AS，混勻后分裝倒入培養(yǎng)皿中。3)幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B5max母液(20X)50毫升B5mix母液(200X)5毫升Fe2+EDTA忙存液(100X)IO毫升蔗糖30克MES0.59克Phytagel3克加蒸餾水至985毫升，1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到5.7，高壓滅菌。培養(yǎng)基降溫至5(TC時(shí)加入已過(guò)濾滅菌的IO毫升維生素貯存液(100X)，1.67毫升6-BA貯存液(l毫克/毫升)，0.5毫升特美汀C:存液(200毫克/毫升)，0.8毫升頭孢霉素貯存液(250毫克/毫升)和5.0毫升除草劑貯存液(l毫克/毫升)，混勻后分裝倒入駕養(yǎng)皿中。4)幼芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基MSmax母液(20X)50毫升MSmix母液(200X)5毫升Fe2+EDTAlt存液(100X)IO毫升蔗糖30克MES0.59克Phytagel3克加蒸餾水至975毫升，1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到5.7，高壓滅菌。培養(yǎng)基降溫至5(TC時(shí)加入已過(guò)濾滅菌的10毫升維生素貯存液aoox)，5毫升天門冬酰胺貯存液ao毫克/毫升)，5毫升谷氨酰胺貯存液(10毫克/毫升)，0.1毫升IAA貯存液(l毫克/毫升)，0.5毫升GA3貯存液(l毫克/毫升)，l毫升玉米素核苷貯存液(1毫克/毫升)，0.5毫升特美汀貯存液(200毫克/毫升)，0.8毫升頭孢霉素貯存液(250毫克/毫升)和2.5毫升除草劑貯存液(l毫克/毫升)，混勻后分裝倒入培養(yǎng)皿中。5)生根培養(yǎng)基B5max母液(20X)25毫升B5mix母液(200X)2.5毫升Fe2+EDTAfc存液(100X)5毫升B5維生素貯存液(100X)IO毫升NAA貯存液(0.5毫克/毫升)0.4毫升蔗糖10克Phytagel6克加蒸餾水至1000毫升，用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到5.8。高壓滅菌后分裝倒入培養(yǎng)瓶中。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化步驟試驗(yàn)主要參考美國(guó)依阿華州立大學(xué)轉(zhuǎn)基因中心的轉(zhuǎn)化程序(Pazetal，2004)。本試驗(yàn)過(guò)程中，在種子滅菌時(shí)間，抑菌劑種類及配比，受體大豆品種等方面進(jìn)行了優(yōu)化。1)種子消毒種子采用干燥表面消毒。將成熟的大豆種子單層排列在培養(yǎng)皿中，將裝有34個(gè)培養(yǎng)皿的干燥器放到通風(fēng)櫥中，并將所有的培養(yǎng)皿打開(kāi)，蓋子緊挨著培養(yǎng)皿，以保證在中間有足夠的空間放置一個(gè)250mL的燒杯。在250mL燒杯中加入100mL的次氯酸鈉，然后沿著杯壁緩緩加入4.2mL12NHC1，立即蓋上干燥器的蓋子，靜置過(guò)夜，約靜置13.5小時(shí)。在氯氣體中暴露整夜后，蓋上培養(yǎng)皿并將其放到層流凈化罩中，再將培養(yǎng)皿打開(kāi)大約30min以便除去過(guò)多的氯氣。2)種子萌發(fā)將1012顆消毒后的種子種臍朝下放置在裝有萌發(fā)培養(yǎng)基(GM)的120X25mm培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天(24。C，18hr光照，光強(qiáng)140pmoles/m7sec)。3)菌液制從新鮮的YEP培養(yǎng)基上挑取含pTF102或pTF101.1-^t/M/V5的根癌農(nóng)桿菌菌株EHAIOI的數(shù)個(gè)單克隆放入2mL添加了100mg/L壯觀霉素、25mg/L氯霉素和50mg/L卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中。在搖床上(250rpm，28°C)培養(yǎng)菌落，生長(zhǎng)至飽和(大約12小時(shí))。取0.3mL飽和菌液加至裝有已加相應(yīng)抗生素的200mLYEP培養(yǎng)基的1L三角瓶中。培養(yǎng)菌落，過(guò)夜(250rpm，28°C)，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期(OD咖二1.01.2)，離心(3，500rpm，10min，室溫)，收集菌落。用液體的共培養(yǎng)基(CM)懸浮農(nóng)桿菌沉淀。使用時(shí)OD,為1.0。4)外植體制備及轉(zhuǎn)化程序種子在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，檢僉萌發(fā)培養(yǎng)盒，舍棄污染的。用解剖刀刀片從根系上切下發(fā)芽的種子，切口在離子葉節(jié)區(qū)域大約0.5cm的下胚軸區(qū)域。沿著子葉下胚軸垂直剖開(kāi)種子，并去除子葉上胚軸(幼芽)和軸上的莖/芽。在子葉和子葉下胚軸—子葉節(jié)區(qū)域垂直于軸切出78個(gè)切口(約O.5mm深，34mm長(zhǎng))。切好的外植體放入培養(yǎng)皿中，備用。5)侵染與共培養(yǎng)將30mL農(nóng)桿菌菌液倒入一個(gè)25X100mm的培養(yǎng)皿中。每個(gè)農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)皿準(zhǔn)備50個(gè)外植體。確保整個(gè)外植體都被菌液懸浮。侵染30min，期間經(jīng)常攪動(dòng)菌液，以使外植體充分接觸新鮮菌液。之后，將外植體轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基上，每皿7個(gè)外植體，切口向下，水平放置。用parafilm封口膜封住培養(yǎng)皿，并將它們轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中(24°C)，暗培養(yǎng)3天。6)幼芽的誘導(dǎo)在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，用液體幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(S工)浸洗外植體，之后，將外植體放在加有3.5mg/Lglufosinate作為篩選劑，100mg/L特美汀和200mg/L頭孢霉素作為抑菌劑的SI培養(yǎng)基上(每皿7個(gè)外植體)。外植體的子葉下胚軸部分須插入培養(yǎng)基中，而再生組織則須與水平面成3045°角斜插在表面。培養(yǎng)皿用透氣膠帶封口，5個(gè)培養(yǎng)皿一疊，培養(yǎng)(24°C，18/6hr的光照周期)。外植體組織在SI培養(yǎng)基上生長(zhǎng)14天。在第一個(gè)星期末，重新排列每疊的培養(yǎng)皿以使頂部和底部調(diào)換。14天后，在形成中的節(jié)的部位齊平地切去子葉下胚軸。將新鮮的切口表面插入至新的SI培養(yǎng)基中，而分化區(qū)域則與培養(yǎng)基表面齊平。然后讓組織在相同的生長(zhǎng)條件下，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)14天。7)幼芽的伸長(zhǎng)將分化的外植體轉(zhuǎn)移到幼芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(SE)上，丟棄其余的未分化的外植體。從外植體上切去子葉，并在正在發(fā)育的節(jié)的基部切一個(gè)新切口。將外植體轉(zhuǎn)移到新鮮的加有2.5mg/Lglufosinate作為篩選劑，100mg/L特美汀和200mg/L頭孢霉素作為抑菌劑的SE培養(yǎng)基上，篩選劑和抑菌劑的加入量參照常規(guī)技術(shù)。在生長(zhǎng)箱中培養(yǎng)28周。每隔2周換一次新鮮的SE培養(yǎng)基。每一次換培養(yǎng)基時(shí)在外植體基部切一個(gè)新鮮的水平切口。8)生根在選擇壓力下，幼芽生長(zhǎng)到至少3cm長(zhǎng)時(shí)，把它們從組織上切下來(lái)。然后將其轉(zhuǎn)移到裝有生根培養(yǎng)基(RM)的玻璃瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。兩周后，當(dāng)莖長(zhǎng)出多于2條根時(shí)，將植株輕輕地從培養(yǎng)基中取出，用自來(lái)水沖洗根部以去除培養(yǎng)基。將苗移植到一個(gè)裝有基質(zhì)的盆(直徑15cm)中。苗在培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)4周(24°C，18/6hr光照強(qiáng)度)。每周澆Hoagland營(yíng)養(yǎng)液一次。然后將苗轉(zhuǎn)移到溫室培養(yǎng)至結(jié)莢。轉(zhuǎn)化大豆品種粵春03-3，得到轉(zhuǎn)基因單株To代植株。用southern雜交檢測(cè)大豆基因組中目的基因的整合，用RT-PCR檢測(cè)目的基因在植物體內(nèi)的表達(dá)量，Western雜交檢測(cè)目的基因在蛋白水平上的表達(dá)。得到超表達(dá)的植株，并且進(jìn)行繁種，得到T1和T2代轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)施例3超表達(dá)^z^力'尸75的轉(zhuǎn)基因植株的功能鑒定測(cè)定L代和T3代轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)酸性磷酸酶活性，生物量和磷吸收量，發(fā)現(xiàn)L代和T3代轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株相比，表現(xiàn)出期望的表型變化，即植株體內(nèi)酸性磷酸酶活性顯著高于對(duì)照，生物量和磷吸收量也高于對(duì)照。證明了這個(gè)基因可以通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化來(lái)提高大豆植株對(duì)介質(zhì)中有機(jī)磷吸收利用效率。1、酸性磷酸酶活性測(cè)定參照Tabatabai和Bremner(1969)酸性磷酸酶的活性測(cè)定方法，將p-NPP溶于45腿ol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)中配成4腿ol/L底物溶液，每2mL底物溶液加入約0.01mL酶液，37。C保溫15min，再加入1mLNaOH(1mol/L)溶液，混勻終止反應(yīng)，在405nm處測(cè)定光吸收值。以不加酶液的底物溶液中加入1mLNaOH(1mol/L)溶液作對(duì)照。2、蛋白濃度的測(cè)定取一定量的上清液加入2.5mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液，搖勻放置2min后，在595nm下以蛋白濃度為0的溶液作空白調(diào)零，測(cè)光吸收值。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品的可溶性蛋白含量。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作如下取6支試管，分別加入1000pg/mL的牛血清蛋白溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，l.OmL，并用雙蒸水補(bǔ)足到1.0mL，充分搖勻后再吸取50pL加入另外6支試管，加2.5mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液，以蛋白濃度作為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、植酸酶活性測(cè)定取200叱根系分泌物，加入200叱含有1mmol/L植酸鈉的45mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)，37。C反應(yīng)1個(gè)小時(shí)，再加入400叱的10%TCA溶液，混勻終止反應(yīng)，然后加入200顯色劑(鉬銻抗混合液抗壞血酸按3:200w/v配比)，用蒸餾水定容到2mL，顯色30min后在波長(zhǎng)700nm處比色測(cè)定反應(yīng)釋放出的磷的光吸收值。同時(shí)以不加根系分泌物的底物溶液反應(yīng)1小時(shí)后加入10XTCA溶液作為對(duì)照。4、植株全磷含量測(cè)定地上部、根部樣品用樣品磨粉碎，采用干灰化，鉬藍(lán)比色法測(cè)定植株全磷含量(Murphy和Riley，1963)，測(cè)量波長(zhǎng)為700nm。表1本發(fā)明克隆的^t/^尸75基因轉(zhuǎn)基因L和T3代單株的表現(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>T3代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株l1.73±0.1881.44T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株21.35±0.1642.21T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株31.39±0.0946.10轉(zhuǎn)基因陰性植株根系分泌的植酸酶活性0.37±0.06T3代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株l0.95±0.17159.32T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株20.55±0.1150.11T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株30.61±0.1066.32轉(zhuǎn)基因陰性植株整株磷吸收量2.36±0.20T3代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株l4.48±0,3090.08T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株22.78±0.1318.19T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株33.83±0.5262.62轉(zhuǎn)基因陰性植株整株生物量0.96±0.07T3代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株l2.08±0.28117.77T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株21.50±0.1656.45T2代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株31.51±0.0457.84注圖中數(shù)據(jù)是三次重復(fù)的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)誤。權(quán)利要求1、基因AtPAP15在提高大豆植株有機(jī)磷吸收利用方面的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是在大豆中超量表達(dá)編碼紫色酸性磷酸酶的基因Jt/^/75實(shí)現(xiàn)。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是所述超量表達(dá)是通過(guò)PCR方法，以JW^^5的基因組片段作為應(yīng)用基因，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出j^^^5基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，并加入來(lái)自胡蘿卜的信號(hào)肽，由強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)，連接到超量表達(dá)載體pTF10Ll上，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述引物為左端引物(5'-3'):ATGACGTTTCTACTACTTCTAC;右端引物(5'-3'):TTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAATGGTTAACAAGGCGGT。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是遺傳轉(zhuǎn)化包括以下步驟(1)種子消毒和種子萌發(fā)；(2)根癌農(nóng)桿菌EHA101菌液制備；(3)外植體制備及轉(zhuǎn)化程序；(4)侵染與共培養(yǎng)；(5)幼芽的誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)；(6)幼芽生根，得到轉(zhuǎn)基因單株To代植株。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是步驟(1)所述種子消毒包括以下步驟(1)將大豆種子單層排列在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于干燥器內(nèi)，打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋子，干燥器內(nèi)同時(shí)放置一個(gè)燒杯，向燒杯中加入次氯酸鈉溶液，并緩緩加入HC1溶液，蓋上干燥器蓋子，靜置過(guò)夜；(2)蓋上培養(yǎng)皿蓋子并將培養(yǎng)皿放到層流凈化罩中后將培養(yǎng)皿打開(kāi)，除去過(guò)多的氯氣。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是步驟(1)所述HC1溶液濃度為12N，加入量按照次氯酸鈉與HC1溶液的體積比為100mL:4.2mL。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是步驟(1)所述靜置過(guò)夜時(shí)間為13.5小時(shí)。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是步驟(5)所述幼芽誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)包括以下步驟(1)外植體共培養(yǎng)后，用加有篩選劑和抑菌劑的液體幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基浸洗；將外植體放在固體培養(yǎng)基上；14天后，在形成中的節(jié)的部位齊平地切去子葉下胚軸；將新鮮的切口表面插入新的固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)14天；(2)將分化的外植體轉(zhuǎn)移到新鮮的幼芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基加有篩選劑和抑菌劑；每隔2周換一次新鮮的培養(yǎng)基。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑菌劑為100mg/L特美汀和200mg/L頭孢霉素的混合物，所述篩選劑為Glufosinate。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了基因AtPAP15及其在提高大豆植株有機(jī)磷吸收利用方面的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)PCR方法，擴(kuò)增出AtPAP15基因(At3g07130)的全長(zhǎng)cDNA區(qū)，并加入來(lái)自胡蘿卜的信號(hào)肽，由強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)，連接到超量表達(dá)載體pTF101.1上，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，使其在轉(zhuǎn)基因大豆中超量表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因大豆T₂代和T₃代植株中發(fā)現(xiàn)，AtPAP15的過(guò)量表達(dá)提高了大豆獲取砂培中植酸磷的能力和體內(nèi)有機(jī)磷的再利用能力，進(jìn)而增加了轉(zhuǎn)基因大豆的生物量和磷吸收量。文檔編號(hào)C12N15/82GK101475960SQ20091003646公開(kāi)日2009年7月8日申請(qǐng)日期2009年1月6日優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日發(fā)明者嚴(yán)小龍,紅廖,王秀榮申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)