專利名稱：：一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，同時(shí)還涉及一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法，還涉及一種外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的用途。特別適用于構(gòu)建真核蛋白質(zhì)的四膜蟲rDNA表達(dá)載體，并于四膜蟲中高效表達(dá)。還涉及到其在蛋白質(zhì)相互作用研究上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：無論是作為食品、食品添加劑、工業(yè)原料、藥品還是其他，蛋白質(zhì)都跟我們的日常生活息息相關(guān)，其應(yīng)用是十分廣泛的。如具有廣泛用途的淀粉酶，存在于人體內(nèi)起著各種生理功能的含量很少以至微量的肽、蛋白質(zhì)、糖肽，作為抗生素的抗菌肽等，然而由于天然存在的某些蛋白質(zhì)產(chǎn)量、純度低或是活性不高，難以滿足需求；此外為了更深入地了解一些新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)分子的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能的研究，也需要得到大量蛋白產(chǎn)品才能得以實(shí)現(xiàn)。目前生產(chǎn)蛋白質(zhì)的技術(shù)主要有從動(dòng)物和植物中提??；化學(xué)合成；用蛋白質(zhì)重組技術(shù)表達(dá)，并用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)。從動(dòng)物和植物中提取的優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)的活性高、穩(wěn)定，專一性強(qiáng)，技術(shù)難度相對(duì)較小，但動(dòng)植物組織中抗菌肽含量有限，而且提取方法繁瑣卻產(chǎn)量和回收率都很低，并且成本昂貴?；瘜W(xué)合成蛋白質(zhì)成本太高，對(duì)環(huán)境的污染很大，而且產(chǎn)業(yè)化困難。因此由于成本的原因，用提取和化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)往往很難在實(shí)際生產(chǎn)上應(yīng)用。蛋白質(zhì)重組技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)的發(fā)展，使得科學(xué)家能夠利用這些技術(shù)提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，克服提取和化學(xué)合成技術(shù)上遇到的難題。因此蛋白質(zhì)重組技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)是蛋白生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。由于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成本高，不適用大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)，到目前為此，用于表達(dá)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)。而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然具有外源基因表達(dá)產(chǎn)物的水平高等優(yōu)點(diǎn)，但是因其缺乏真核轉(zhuǎn)錄后加工及翻譯后加工等功能，其表達(dá)的產(chǎn)物往往活性不高或是無活性等(特別是用其表達(dá)真核蛋白時(shí))，使其應(yīng)用受到限制(孫柏欣，劉長(zhǎng)遠(yuǎn)，陳彥，趙華，趙彤華，李柏宏.基因表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展.2008年第2期，205-209;謝磊，孫建波，張世清等.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)及其研究進(jìn)展[J].華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，1(K2):16-20)；酵母表達(dá)系統(tǒng)因?yàn)榻湍妇钦婧松铮c動(dòng)物細(xì)胞一樣具有轉(zhuǎn)錄、翻譯后的多種加工過程，能夠表達(dá)出多種具有活性的外源蛋白而備受關(guān)注。但也存在著明顯的局限，如以釀酒酵母為主體的表達(dá)系統(tǒng)中缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子、分泌效率差、質(zhì)粒不穩(wěn)定、難以達(dá)到很高發(fā)酵密度、只能分泌少量蛋白、其翻譯后加工與高等真核生物有所不同等(鄭光宇.真核生物表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].喀什師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25(6)33-36;李艷，王正祥.酵母作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展，2001，21(2):10-14.)0總之，各種表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)。隨著基因重組技術(shù)的發(fā)展，選擇表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于目的產(chǎn)物制備是相當(dāng)重要的，因?yàn)楸磉_(dá)系統(tǒng)決定了細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)物的性質(zhì)以及可能產(chǎn)生的雜蛋白，純化重組蛋白質(zhì)和普通蛋白質(zhì)的不同就在于要選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，重組蛋白質(zhì)在分離純化的過程中，必須維持一定的濃度和生物活性形式，以及防止被降解。研發(fā)新型外源蛋白的高效表達(dá)系統(tǒng)一直是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。四膜蟲(Tetrahymena)隸屬于原生動(dòng)物亞門、纖毛亞門、寡膜綱、膜口目、四膜科屬，是單細(xì)胞真核生物；過去50年中，以四膜蟲為實(shí)驗(yàn)對(duì)象取得的一系列突破性的成果包括核酶的發(fā)現(xiàn)(獲1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))、端粒與端粒酶的發(fā)現(xiàn)(獲2009年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))、組蛋白和微管蛋白翻譯后修飾功能、發(fā)育中大核DNA重整中的RNAi模型等等，說明四膜蟲雖然是單細(xì)胞生物，但其具備真核生物基本生命特征。四膜蟲蛋白表達(dá)系統(tǒng)中二硫鍵的正確配對(duì)和蛋白修飾作用克服了大腸桿菌表達(dá)的蛋白一般不會(huì)形成正確的二硫鍵和缺少翻譯后的修飾的缺點(diǎn)，同時(shí)四膜蟲中表達(dá)蛋白只有簡(jiǎn)單的N-糖基化，不存在如酵母中豐富的甘露糖殘基修飾，植物中豐富的木糖殘基修飾等非哺乳動(dòng)物中的修飾類型，這些生物學(xué)特性使其能夠作為理想的真核表達(dá)系統(tǒng)(潘惟鈞，樊啟昶.四膜蟲——分子生物學(xué)研究的理想材料.生物學(xué)通報(bào)，1990年第2期13-16.)。自然界中，四膜蟲主要以水中的細(xì)菌和其它有機(jī)質(zhì)為食，目前還沒有發(fā)現(xiàn)它能引起人體疾病或危害人類健康，以四膜蟲為表達(dá)系統(tǒng)安全可靠。實(shí)驗(yàn)室中，四膜蟲營養(yǎng)生長(zhǎng)快速小時(shí)一代)，且作為第一種進(jìn)行無菌純培養(yǎng)并且實(shí)現(xiàn)細(xì)胞同步化的真核細(xì)胞，相比其它模式生物或細(xì)胞系(如秀麗線蟲、魚類和哺乳動(dòng)物體細(xì)胞)，其培養(yǎng)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，操作精確度高和可控性強(qiáng)，而且可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞密度最高可到IO7個(gè)/毫升。利用四膜蟲發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)重組蛋白國外已有報(bào)道，在四膜蟲中可表達(dá)疫苗，單克隆抗體等蛋白。如Guberman等人進(jìn)行了在四膜蟲中大規(guī)模生產(chǎn)憐月旨醇Al的研究(A.Guberman,M.Hartmann,A.Tiedtke,J.Florin-Christensen,M.Florin-Christensen.AmethodforthepreparationofTetrahymenathermophilaphospholipaseAlsuitableforlarge-scaleproduction.JournalofAppliedMicrobiology1999，86，226-230)。2005年底嗜熱四膜蟲大核基因組測(cè)序計(jì)劃(TetrahymenathermophilaMacronuclearGenomeSequencingProject)已經(jīng)完成、相應(yīng)的預(yù)測(cè)基因數(shù)據(jù)庫(TetrahymenaGenomeDatabase,TGD)也已公布、另有近5萬條基因表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetag,EST)的數(shù)據(jù)支持。比較基因組學(xué)的研究表明，擁有MOOO多個(gè)大核基因的嗜熱四膜蟲較酵母與人類具有更高程度的功能保守性，是開展真核生物基因功能研究的良好材料，即有利于表達(dá)包括水產(chǎn)動(dòng)物抗菌肽基因在內(nèi)的真核生物蛋白。2007-2008年，對(duì)嗜熱四膜蟲構(gòu)建了世界上第一個(gè)纖毛蟲全基因組基因表達(dá)芯片分析平臺(tái)，完成了嗜熱四膜蟲在3種典型生理或發(fā)育狀態(tài)下共20個(gè)時(shí)期的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)的采集和分析，以此為基礎(chǔ)建立的四膜蟲基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫CTetrahymenaGeneExpressionDatabase)和網(wǎng)站(http=ZVtgecLit1Lac.cn/)已成為四膜蟲基因組學(xué)研究的重要資源。四膜蟲全基因組基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析也為我們找到安全、可控的高效四膜蟲啟動(dòng)子提供了基礎(chǔ)。在四膜蟲中已經(jīng)建立起一系列成熟的基因重組和細(xì)胞轉(zhuǎn)染的分子遺傳學(xué)操作方法和技術(shù)，使得在嗜熱四膜蟲中進(jìn)行基因敲除/插入、基因表達(dá)抑制和基因過表達(dá)等十分方便快捷。其中通過真核生物最高效啟動(dòng)子(四膜蟲金屬硫蛋白基因MTTl的啟動(dòng)子大于300倍的誘導(dǎo)表達(dá))和四膜蟲特有的高拷貝載體(四膜蟲rDNA載體9，000-10，000個(gè)/細(xì)胞)可實(shí)現(xiàn)異源基因的過表達(dá)和可控誘導(dǎo)表達(dá)。國外已報(bào)道有多種外源基因在嗜熱四膜蟲體內(nèi)成功表達(dá)，其中包括多子小瓜蟲的I-抗原基因、惡性瘧原蟲的子環(huán)孢子蛋白基因，人的DNaseI等(ffeideT,BockauU,RaveA,HerrmannL,HartmannMW.ArecombinasesystemfacilitatescloningofexpressioncassettesintheciliateTetrahymenathermophila.BMCMicrobiol.2007Mar1；7:12)。熱激蛋白(HeatStressProteins,HSPs)，又稱熱休克蛋白(HeatShockProteins,HSPs)或應(yīng)激蛋白(StressProteins，SP)，是動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞在一些應(yīng)激原，如環(huán)境高溫、缺氧、重金屬中毒、氧化應(yīng)激、感染、饑餓、創(chuàng)傷、代謝毒物等條件誘導(dǎo)下，激活HSP基因，高效表達(dá)的一組進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)。根據(jù)其相對(duì)分子質(zhì)量，可將HSP分成6個(gè)家族，其中熱休克蛋白70(Hsp70)是在大多數(shù)生物中含量最多，細(xì)胞應(yīng)激后生成最顯著，具有高度的保守性，因此在HSP中最受關(guān)注、研究最為深入。從功能上看，HSP70家族可分為組成型和熱誘導(dǎo)型2種，它們主要參與新生肽的成熟與分揀(maturingandsorting)以及分泌蛋白向細(xì)胞器或胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)等細(xì)胞活動(dòng)，在脅迫條件下HSP70能防止蛋白降解，有利于變性蛋白的復(fù)性。高溫是誘導(dǎo)HSP70表達(dá)的主要因素。熱誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)是通過熱激轉(zhuǎn)錄因子(heatshockfactors,HSFs)禾口某些相應(yīng)的熱激元件(heatshockelements,HSEs)起作用的(張俠，尹海波，熊冬金，張慧，趙彥修.植物熱激蛋白70，植物生理學(xué)通訊，2004，40(4)，500-504)。在正常細(xì)胞中不表達(dá)或表達(dá)量很少，應(yīng)激條件下表達(dá)迅速增高。正常情況下HSP70mRNA很不穩(wěn)定，半衰期只有1530min，而熱應(yīng)激下可長(zhǎng)達(dá)4h(ThomasJ,Mcgarry,etal.ThepreferentialtransactionofdrosophilaHSP7OmRNArepuiressepuencesintheuntranslatedleader[J]·Cell，1985,42:311.)。熱應(yīng)激條件下細(xì)胞內(nèi)其它mRNA雖不被降解，但翻譯停止。HSP70mRNA則大量翻譯，其5非翻譯區(qū)有兩個(gè)保守序列，熱應(yīng)激條件下可能與某些因子結(jié)合而促進(jìn)其與核糖體結(jié)合，從而使HSP70mRNA優(yōu)先翻譯，若將這一區(qū)域連在其它基因上在熱休克條件下該基因也能獲得高表達(dá)?？梢姛釕?yīng)激下HSP70mRNA是通過增強(qiáng)穩(wěn)定性和優(yōu)先翻譯來保證機(jī)體需要。因此，用HSP70啟動(dòng)子作為調(diào)控外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子，既有利于啟動(dòng)外源基因的表達(dá)，也易于通過應(yīng)激對(duì)外源基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控(程繼忠，皇甫永穆，馮作化，等.人結(jié)核桿菌熱休克蛋白70啟動(dòng)子對(duì)外源基因在分枝桿菌中表達(dá)的影響[J]·中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1997;17(6)=410-415；BukauB,HorwichAL.TheHsp70andHsp60chaperonemachines.Cell.1998.92(3):351-366;〕SorensenJ.G.,KristensenT.N.andLoeschekeV.Theevolutionaryandecologicalroleofheatshockproteins.EcologicalLetters，2003，6:1025-1037；馮立芳，繆煒。不同緯度螅狀獨(dú)縮蟲耐熱能力及Hsp70mRNA表達(dá)水平的比較。動(dòng)物學(xué)報(bào)。2008，54(:525-530)。在原核生物嗜熱四膜蟲中，在37°〇、391、411熱激條件下，hsp70-l、hsp70_2、hsp70_3、hsp70-4、hsp70-5這5個(gè)基因的表達(dá)水平高于正常生長(zhǎng)時(shí)期的30°C。除hsp70_4外，其余4個(gè)hsp70基因的表達(dá)水平并不隨著溫度的升高而增加，在41°C時(shí)它們的表達(dá)水平要低于39°C。在37°C、39°C、41°C這3個(gè)不同熱激條件下，hsp70-2對(duì)熱激響應(yīng)最敏感，其表達(dá)水平在5個(gè)hsp70基因中是最高的。因此可選用嗜熱四膜蟲的hsp70-2啟動(dòng)子構(gòu)建高效表達(dá)且易于通過熱激對(duì)外源基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控的四膜蟲表達(dá)載體(馮立芳，暢悅，袁冬霞，繆煒·動(dòng)物學(xué)研究.2011，32(3):1-10)。綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是1962年下村修和約翰森從維多利亞多管水母(Aequoreavictoria)中分離出來的，是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，GFP能發(fā)射綠色熒光。后來查爾菲向人們展示了綠色熒光蛋白作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽的作用，而錢永健解釋了其機(jī)制并使科學(xué)家很容易地使用綠色熒光蛋白，他還將顏色標(biāo)簽擴(kuò)展至除綠色之外的顏色，以便可以用各種顏色標(biāo)識(shí)不同的蛋白和細(xì)胞，這使綠色熒光蛋白技術(shù)的應(yīng)用更加簡(jiǎn)單(崔志芳，鄒玉紅，季愛云.綠色熒光蛋白研究的三個(gè)里程碑——2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)簡(jiǎn)介.自然雜志，2008,30(6):3328)。GFP所發(fā)射的綠色熒光性質(zhì)穩(wěn)定，無種屬限制。其獨(dú)特之處在于它產(chǎn)生熒光無需底物或輔因子，發(fā)色團(tuán)是其蛋白質(zhì)一級(jí)序列固有的(TrejcK，SixmaTK,KittsPA,etal.StructuralbasisfordualexcitationandphotOisOmerizatiOnoftheAequoreavictoriagreenfluorescentprotein[J].Proc.NatLAcad·Sci·USA，1997,94:2306-2311)。綠色熒光蛋白對(duì)生物體無毒無害，分子量小，方便構(gòu)建載體，同時(shí)在多種非水母的生物體中均可穩(wěn)定表達(dá)并易于檢測(cè)，所以，作為一種生物分子標(biāo)記(如載體的篩選標(biāo)記等)，具有廣泛的應(yīng)用前景。GFP作為良好的細(xì)胞、發(fā)育、分子生物學(xué)的活體標(biāo)記，用于監(jiān)測(cè)各種體系中的基因表達(dá)、蛋白定位以及多種細(xì)胞活動(dòng)。利用GFP進(jìn)行示蹤的研究范圍相當(dāng)廣泛.從細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)研究如細(xì)胞骨架和細(xì)胞分化、細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)和囊泡跟蹤，到一些熱門的前沿和學(xué)科和
技術(shù)領(lǐng)域：
，如器官移植、基因治療、神經(jīng)生物學(xué)等等。因此，構(gòu)建能高效穩(wěn)定表達(dá)、轉(zhuǎn)染生物體的操作技術(shù)簡(jiǎn)單、成功率高的含HSP70啟動(dòng)子、并能方便外源基因插入和篩選的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體用于外源蛋白的表達(dá)，特別是針對(duì)具有生物活性的真核來源的蛋白質(zhì)的表達(dá)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供了一種一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體，該載體具有大腸桿菌宿主正常復(fù)制所需的復(fù)制起始點(diǎn)及Amp抗性篩選標(biāo)記；載體的可替代盒式結(jié)構(gòu)HGFP中的含綠色熒光篩選標(biāo)記篩選，可替代盒式結(jié)構(gòu)HGFP兩側(cè)引入了兩個(gè)反向的識(shí)別序列長(zhǎng)達(dá)18bp的稀有內(nèi)切酶——?dú)w位酶HceI作為克隆位點(diǎn)，使得載體的應(yīng)用幾乎不受酶切位點(diǎn)的限制，且酶切后的載體不做去磷酸化處理，也可有效地防止載體自連，一步連接即可完成外源基因的四膜蟲表達(dá)載體的構(gòu)建，一個(gè)PCR反應(yīng)即可確定外源基因的插入方向；這一系列載體的rDNA骨架及HSP70-2啟動(dòng)子能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化和高效表達(dá)。這一系列表達(dá)載體可在同一載體上完成基因克隆、測(cè)序和高效表達(dá)三種功能并能方便地篩選重組子，從而簡(jiǎn)化了分子生物學(xué)操作步驟，節(jié)約了時(shí)間，減輕工作量，且成功率，可靠性都比較高，使用廣泛。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體的構(gòu)建方法。這一系列載體的構(gòu)建過程中均通過PCR及酶切連接的方法構(gòu)建中間載體TH-HGFP或TH-HIS-HGFP或TH-GST-HGFP或TH-FLAG-HGFP，這些載體含兩端帶有反向互補(bǔ)的I-keI酶切位點(diǎn)的綠色熒光篩選標(biāo)記HGFP，然后將各中間載體的NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段或NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段或NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段或NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段通過NotI酶切位點(diǎn)引入到載體PD5H8，最后獲得一系列一步法引入外源基因、綠色熒光蛋白篩選和高效表達(dá)外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因克隆表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP。從而簡(jiǎn)化了分子生物學(xué)操作步驟。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供了一種一系列一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體在表達(dá)外源蛋白GFP中的用途。外源基因gfp的四膜蟲表達(dá)載體電轉(zhuǎn)到四膜蟲后，在巴龍霉素藥物篩選作用下，表達(dá)載體能替換掉四膜蟲體內(nèi)原有的大部分rDNA，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化，并在熱激條件下，HSP70-2強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)高效表達(dá)該基因的非融合蛋白或HIS融合蛋白或GST融合蛋白或FLAG融合蛋白。因此一種一步法弓|入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體可被用于克隆、高效表達(dá)外源基因，特別是表達(dá)真核蛋白，如抗體，病毒表面抗原，跨膜蛋白，酶，抗菌肽等藥物等，這些蛋白質(zhì)在治療藥物開發(fā)；診斷；人類和動(dòng)物疫苗的開發(fā)；藥物設(shè)計(jì)，工業(yè)酶生產(chǎn)等方面具有廣泛的應(yīng)用；還可根據(jù)需要任意選擇不帶標(biāo)簽、帶GST標(biāo)簽、帶HIS標(biāo)簽或帶FLAG標(biāo)簽的表達(dá)載體，可應(yīng)用于蛋白質(zhì)的表達(dá)純化及研究蛋白質(zhì)相互作用等方面。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所述的一系列四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，PD5H8-GST-HGFP,pD5H8-FLAG_HGFP均是一種HSP70-2基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。四膜蟲的HSP70-2基因啟動(dòng)子是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，能高效啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。以39°C熱激處理?xiàng)l件下的四膜蟲cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法比較嗜熱四膜蟲HSP70-2基因與目前已報(bào)道嗜熱四膜蟲HSP70-1基因(BarchettaS，LaTerzaA，BallariniP,PucciarelliS,MiceliC.CombinationoftworegulatoryelementsintheTetrahymenathermophilaHSP70-lgenecontrolsheatshockactivation.EukaryotCell.2008，7(2):379-386.)，發(fā)現(xiàn)HSP70-2基因的相對(duì)表達(dá)量更高，相應(yīng)的HSP70-2基因的啟動(dòng)子效率也更高〔馮立芳，暢悅，袁冬霞，繆煒.動(dòng)物學(xué)研究.2011(已接收)〕?；诖?，本發(fā)明所述的一系列四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有的四膜蟲HSP70-2基因啟動(dòng)子是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的高效表達(dá)。本發(fā)明所述的一系列四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，PD5H8-GST-HGFP,pD5H8-FLAG-HGFP上含有的盒式結(jié)構(gòu)HGFP是個(gè)可替換的盒式結(jié)構(gòu)。該盒式結(jié)構(gòu)HGFP兩側(cè)各含有一個(gè)稀有HceI酶切位點(diǎn)，并且該兩個(gè)HceI酶切位點(diǎn)的序列是反向的。首先將擬研究對(duì)象外源基因Y(可在四膜蟲體內(nèi)表達(dá)的任何無毒外源基因)經(jīng)PCR擴(kuò)增，在其起始密碼子ATG前加上I-keI酶切位點(diǎn)，在其終止密碼子TGA前(不保留終止密碼子TGA)加上反向的HceI酶切位點(diǎn)。接著經(jīng)HceI酶切將質(zhì)粒pD5H8_HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP或pD5H8-FLAG_HGFP上的盒式結(jié)構(gòu)HGFP替換為擬研究對(duì)象——外源基因Y，得到所需的質(zhì)粒PD5H8-Y或pD5H8-HIS-Y或pD5H8-GST_Y或PD5H8-FLAG-Y(具體操作過程可參考本發(fā)明中所述表達(dá)載體pD5H8_GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP的構(gòu)建方法)。并且盒式結(jié)構(gòu)HGFP中含有綠色熒光篩選標(biāo)記，因而可以通過該篩選標(biāo)記來篩選重組子。最后用電穿孔法轉(zhuǎn)染所構(gòu)質(zhì)粒PD5H8-Y或pD5H8-HIS-Y或pD5H8-GST_Y或pD5H8-FLAG_Y到四膜蟲體內(nèi)，便使四膜蟲成為一個(gè)表達(dá)外源基因Y的表達(dá)系統(tǒng)。以gfp為例，將載體pD5H8-GFP(或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8-GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP)通過電穿孔法轉(zhuǎn)染到四膜蟲體內(nèi)后，在巴龍霉素藥物篩選作用下，使得外源基因gfp在四膜蟲體內(nèi)拷貝數(shù)大量倍增。以Y-th-gfp-63F(IOuM)，Y-th-gfp-64R為引物，分別對(duì)PD5H8-GFP(或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP)的四膜蟲表達(dá)株做WholeCellPCR驗(yàn)證a.收集150_200ul細(xì)胞與1.5ml的離心管中，以最大的轉(zhuǎn)速離心6-10分鐘或更長(zhǎng)，倒掉上清。b.加80-100ulIXBufferK(2mMMg2+)到細(xì)胞中，用吸管吹散將其懸浮起來，并轉(zhuǎn)移到0.5ml的離心管中，使用PCR儀在55°C孵育1小時(shí)，99°C變性20分鐘。c.將上述裂解物置于冰上，做PCR，每25ul的體系中20ul上述裂解物，0.5ul10XPCRBuffer,1.4ulMgCl2(25mM)(Final3mM),0.5uldNTP(IOuM),IulY-th-gfp-63F(IOuM),IulY_th-gfp_64R(IOuM)，0.2ulTaq，0.4ulH20。PCR條件94°C2min，94°C，30sec，50°Clmin，68°Clmin,25-35cycles,68°CIOmin0均能擴(kuò)增得到約750bp的gfpPCR產(chǎn)物則說明相應(yīng)的四膜蟲轉(zhuǎn)染成功，四膜蟲含有質(zhì)粒pD5H8-GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP(詳情見28)。實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化。構(gòu)建含HSP702啟動(dòng)子和HGFP的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pD5H8_HGFP或PD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP或pD5H8-FLAG_HGFP，及含HSP702啟動(dòng)子的四膜蟲GFP表達(dá)載體PD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP的具體實(shí)驗(yàn)技術(shù)參考J.薩姆布魯克與D.W.拉塞爾著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(黃培堂等譯，2002年8月第三版，北京科學(xué)出版社)。本發(fā)明中所用限制性內(nèi)切酶購買自Τ0Υ0Β0公司及大連寶生物工程有限公司、膠回收試劑盒購買自Axygen公司、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購買自BioFlux公司、pGEM-T載體購買自Promega公司、DNA聚合酶購買自大連寶生物工程有限公司、T4連接酶購買自NewEnglandBiolabs公司、熱敏磷酸酶購買自NewEnglandBiolabs公司、轉(zhuǎn)化用大腸桿菌E.coliDH5α購買自天根生化公司、DNA分子量標(biāo)記Marker均購買自天根生化公司及大連寶生物工程有限公司、瓊脂糖購買自Biowest公司、TBT購買自AcrosOrganic公司、所有離心管、吸頭均購買自Axygen公司、所用引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，所有測(cè)序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司及北京華大基因研究中心完成。本發(fā)明所用嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)株系信息參考Eisen等(EisenJA,CoyneRS,WuM,ffuD,ThiagarajanΜ,WortmanJR,BadgerJH,RenQ,AmedeoP,JonesKM,TallonLJ,DelcherAL,SalzbergSL,SilvaJC,HaasBJ,MajorosWH,FarzadM,CarltonJM,SmithRKJr,GargJ,PearlmanRE,KarrerKM,SunL,ManningG,EldeNC,TurkewitzAP,AsaiDJ,WilkesDE,WangY,CaiH,CollinsK,StewartBA,LeeSR,WilamowskaK,WeinbergZ,RuzzoWL,WlogaD,GaertigJ,FrankelJ,TsaoCC,GorovskyMA,KeelingPJ,WallerRF,PatronNJ,CherryJM,StoverNA,KriegerCJ,delToroC,RyderHF,WilliamsonSC,BarbeauRA,HamiltonEP,OriasE.MacronucleargenomesequenceoftheciliateTetrahymenathermophila,amodeleukaryote.PlosBiol.2006,4(9)e286.)，質(zhì)粒pD5H8信息參考Gaertig等(GaertigJ,GorovskyMA.EfficientmasstransformationofTetrahymenathermophilabyelectroporationofconjugants.ProcNatlAcadSciUSA.1992,89(19):9196-9200.)。本發(fā)明中含HSP70-2啟動(dòng)子及綠色熒光篩選標(biāo)記HGFP的一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PD5H8-HGFP或pD5H8_HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP或PD5H8-FLAG-HGFP的構(gòu)建方法及四膜蟲的GFP表達(dá)載體pD5H8_GFP或pD5H8_HIS-GFP或PD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP的構(gòu)建過程，一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟A.利用引物Y-TGFP-I-SceI-41F5'GCCAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTGGAAAATAAAAAGCTGGATCC3'Y-TGFP-I-SceI-42R5‘GAGCTCTAGGGATAACAGGGTAATAGATAAATTTTATATCAACTCGAGTCAGAAT3‘以質(zhì)粒THX-HGFP為模板擴(kuò)增獲得兩端帶HceI識(shí)別序列接頭的HGFP片段，并用I-keI處理，獲得帶HceI粘性末端的片段HceI-HGFP-I-SceI。B.利用引物Y-th-gfp-61F5‘CCGGTCATTACCCTGTTATCCCTATGACTCGAGTTGATATAAAATTTATAAATAT3‘Y-th-gfp-62R5'GGCCAGATTACCCTGTTATCCCTACATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'以質(zhì)粒HSP702-GFP(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，申請(qǐng)?zhí)?專利號(hào)200910062093，發(fā)明名稱含HSP70啟動(dòng)子和GFP的四膜蟲轉(zhuǎn)基因載體及制備方法和應(yīng)用，申請(qǐng)時(shí)間2009年5月15日)為模板反擴(kuò)載體，并用HceI處理，獲得帶HceI粘性末端的載體片段I_SceI-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-I-SceI。C.連接A步驟UceI處理的UceI-HGFP-I-SceI片段與B步驟UceI處理的載體片段HceI-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-I-SceI得到重組質(zhì)粒TH-HGFP。D.利用M13正反向引物，以TH-HGFP為模板，PCR擴(kuò)增獲得含NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI序列的PCR片段，然后NotI處理得到帶NotI接頭的NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段。E.將質(zhì)粒pD5H8(羅徹斯特大學(xué)的MartinA.Gorovsky教授贈(zèng)送，質(zhì)粒pD5H8信息同前參考文獻(xiàn):GaertigJ,GorovskyMA.EfficientmasstransformationofTetrahymenathermophilabyelectroporationofconjugants.ProcNatlAcadSciUSA.1992,89(19):9196-9200)經(jīng)NotI單酶切后，回收單酶切片段，并用熱敏磷酸酶進(jìn)行去磷酸化處理，得到去磷酸化的PD5H8載體。F.將步驟D中帶NotI接頭的NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段與步驟E中去磷酸化的pD5H8載體連接，得到所述表達(dá)載體PD5H8-HGFP。G.利用引物Y-th-2gfp(his)_69F5'CCCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTG3'Y-th-2gfp(his)_70R5'CCCAAGCTTATGATGATGATGATGGTGCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'以質(zhì)粒TH-HGFP為模板反擴(kuò)載體，并用HindIII處理，得到帶MndIII接頭的HindIII-HIS-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-HindIII片段。H.將步驟G中帶HindIII接頭的HindIII-HIS-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13‘UTR-HGFP-HindIII片段用連接酶處理，使其自連得到重組質(zhì)粒TH-HIS-HGFP。I.利用M13正反向引物，以TH-HIS-HGFP為模板，PCR擴(kuò)增獲得含NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI序列的PCR片段，然后NotI處理得到帶NotI接頭的NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段。J.將步驟I中帶NotI接頭的NotI-HSP70-25‘UTR-HIS-HGFP-HSP70-13‘UTR-NotI片段與步驟E中去磷酸化的pD5H8載體連接，得到所述表達(dá)載體PD5H8-HIS-HGFP。K.利用引物Y-th-2gfp-(GST)7IF5'CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC3'Y-th-2gfp-(GST)72R5'GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'以質(zhì)粒TH-HGFP為模板反擴(kuò)載體，并用HindIII和BglII雙酶切處理，得到帶用HindIII和BglII接頭的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII。L.利用引物Y-GST-73F5'GGAAGATCTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTA3‘Y-GST-74R5'CCCAAGCTTACGCGGAACCAGATCCGAT3'以質(zhì)粒pET23a_GST(湖北大學(xué)馬立新教授贈(zèng)送)為模板擴(kuò)增獲得GST片段，并用HindIII和BglII雙酶切處理，得到帶HindIII和BglII接頭的GST片段。M.連接步驟L中帶HindIII和BglII接頭的GST片段與步驟K中帶用HindIII和BglII接頭的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII片段得到重組質(zhì)粒TH-GST-HGFP。N.利用M13正反向引物，以TH-GST-HGFP為模板，PCR擴(kuò)增獲得含NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI序列的片段，然后NotI處理該P(yáng)CR片度得到帶NotI接頭的NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段。0.將步驟M中帶NotI接頭的NotI-HSP70-25‘UTR-GST-HGFP-HSP70-13‘UTR-NotI片段與步驟E中去磷酸化的pD5H8載體連接，得到所述表達(dá)載體PD5H8-GST-HGFP。P.利用引物Y-FLAG-87F5'GGAAGATCTATGGACTACAAAGACCATGACGGTGA3‘Y-FLAG-88R5'CCCAAGCTTCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGA3‘以質(zhì)粒ρ⑶NA3.I-FLAG(湖北大學(xué)馬立新教授贈(zèng)送)為模板擴(kuò)增獲得FLAG片段，并用HindIII和BglII雙酶切處理。Q.連接步驟P中帶HindIII和BglII接頭的FLAG片段與步驟K中帶用HindIII和BglII接頭的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII片段得到重組質(zhì)粒TH-FLAG-HGFP。R.利用M13正反向引物，以TH-FLAG-HGFP為模板，PCR擴(kuò)增獲得含NotI_HSP70_25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI序列的片段，然后NotI處理該P(yáng)CR片段得到帶NotI接頭的NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段。S.將步驟R中帶NotI接頭的NotI-HSP70-25‘UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13‘UTR-NotI片段與步驟E中去磷酸化的pD5H8載體連接，得到所述表達(dá)載體PD5H8-FLAG-HGFP。T.利用引物Y-th-gfp-63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3'Y-th-gfp-64R5'CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT3'以質(zhì)粒HSP702-GFP(同前)為模板，擴(kuò)增獲得兩端帶HceI識(shí)別序列接頭的GFP片段，并用HceI處理，獲得帶HceI粘性末端的片段HceI-GFP-I-SceI。U.將載體pD5H8-HGFP或pD5H8-HIS_HGFP或pD5H8-GST_HGFP或pD5H8-FLAG_HGFP經(jīng)I-SceI雙酶切后，回收長(zhǎng)度分別約為15200bp,15200bp,15700bp,15200bp的大片段。V.將步驟P中帶HceI接頭的HceI-GFP-I-SceI片段與步驟Q中用I-SceI處理后的pD5H8-HGFP或pD5H8_HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP載體連接得到GFP的四膜蟲表達(dá)載體PD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP。本發(fā)明提供了一系列含HSP70-2啟動(dòng)子和HGFP的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PD5H8-HGFP,pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，pD5H8-FLAG_HGFP，這些載體將四膜蟲熱休克蛋白70啟動(dòng)子、含綠色熒光篩選標(biāo)記的盒式結(jié)構(gòu)HGFP、四膜蟲熱休克蛋白70終止子連接進(jìn)嗜熱四膜蟲的rDNA載體pD5H8中，連入的三部分序列分別為SEQIDNO.1,SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。用gfp替換掉原有表達(dá)載體pD5H8_HGFP或pD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP載體中盒式結(jié)構(gòu)HGFP獲得gfp的四膜蟲表達(dá)載體PD5H8-GFP或pD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP，這些表達(dá)載體將四膜蟲熱休克蛋白70啟動(dòng)子、編碼綠色熒光蛋白ORF序列、四膜蟲熱休克蛋白70終止子連接進(jìn)嗜熱四膜蟲的rDNA載體pD5H8中，連入的三部分序列分別為SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8所示的核苷酸序列。這一系列g(shù)fp的四膜蟲表達(dá)載體轉(zhuǎn)染四膜蟲后，經(jīng)熱激誘導(dǎo)各能表達(dá)得到一種分離的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)的核苷酸序列分別為SEQIDN0.5中1127-1858核苷酸序列，SEQIDN0.6中1109-1882核苷酸序列，SEQIDN0.7中1115-2538核苷酸序列，SEQIDN0.8中1115-1939核苷酸序列(四膜蟲中密碼子TAAjTAG非終止子，均編碼氨基酸谷氨酰胺)，所有序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序確認(rèn)，具體位置信息描述如下A.一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PD5H8-HGFP中HSP70-2啟動(dòng)子+盒式結(jié)構(gòu)HGFP+HSP70-1終止子的結(jié)構(gòu)HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR全長(zhǎng)3U9bp，其序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點(diǎn)為1-8和3122-3129；I-SceI酶切位點(diǎn)為1109-1126和2617-2634；HSP70-2基因啟動(dòng)子(HSP70-25'UTR):9-1105；盒式結(jié)構(gòu)HGFP中g(shù)fp基因起始密碼子(ATG):1637-1639；終止密碼子(TGA)2351-2353；HSP70-1基因終止信號(hào)(HSP70-13'UTR):2644-3121B.一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pD5H8-HIS-HGFP中HSP70-2啟動(dòng)子+盒式結(jié)構(gòu)HGFP+HSP70-1終止子的結(jié)構(gòu)HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR全長(zhǎng)315!3bp，其序列為SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點(diǎn)為1-8和3146-3153；I-SceI酶切位點(diǎn)為1133-1150和2640-2659；HSP70-2基因啟動(dòng)子(HSP70-25'UTR):9-1105;His標(biāo)簽1109-1126；HindIII酶切位點(diǎn):1127-1132；盒式結(jié)構(gòu)HGFP中g(shù)fp基因起始密碼子(ATG):1661-1663；終止密碼子(TGA)2375-2377；HSP70-1基因終止信號(hào)(HSP70-13'UTR):2668-3145C.一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pD5H8-GST-HGFP中HSP70-2啟動(dòng)子+盒式結(jié)構(gòu)HGFP+HSP70-1終止子的結(jié)構(gòu)HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR全長(zhǎng)3709bp，其序列為SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點(diǎn)為1-8和3699-3709；I-SceI酶切位點(diǎn)為:1789-1807和3197-3214；HSP70-2基因啟動(dòng)子(HSP70-25'UTR):9-1105;BglII酶切位點(diǎn)1109-1114；Gst標(biāo)簽1115-1783；HindIII酶切位點(diǎn):1784-1789；盒式結(jié)構(gòu)HGFP中g(shù)fp基因起始密碼子(ATG):2217-2219；終止密碼子(TGA)2930-2933；HSP70-1基因終止信號(hào)(HSP70-13'UTR):3224-3701。D.一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pD5H8-FLAG-HGFP中HSP70-2啟動(dòng)子+盒式結(jié)構(gòu)HGFP+HSP70-1終止子的結(jié)構(gòu)HSP70-25‘UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR全長(zhǎng)3109bp，其序列為SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點(diǎn)為1-8和31020-3109；I-SceI酶切位點(diǎn)為1190-1207和2597-2614；HSP70-2基因啟動(dòng)子(HSP70-25'UTR):9-1105;BglII酶切位點(diǎn)1109-1114；FLAG標(biāo)簽1115-1183；HindIII酶切位點(diǎn):1184-1189；盒式結(jié)構(gòu)HGFP中g(shù)fp基因起始密碼子(ATG):1617-1619；終止密碼子(TGA)2331-2333；HSP70-1基因終止信號(hào)(HSP70-13'UTR):2624-3101Ε.一種分離的蛋白質(zhì)GFP的四膜蟲表達(dá)載體pD5H8-GFP中HSP70-2啟動(dòng)子+GFP的0RRF+HSP70-1終止子的結(jié)構(gòu)HSP70-25'UTR-GFP-HSP70-13'UTR全長(zhǎng)2353bp，其序列為SEQIDN0.5所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點(diǎn)為1-8和2346-2353；I-SceI酶切位點(diǎn)為:1109-1126和1841-1858；HSP70-2基因啟動(dòng)子(HSP70-25'UTR):9-1105;gfp基因起始密碼子(ATG):1127-1129；終止密碼子(TGA):1859-1861；HSP70-1基因終止信號(hào)(HSP70-13'UTR):1868-2345。F.一種分離的蛋白質(zhì)GFP的四膜蟲表達(dá)載體pD5H8-HIS-GFP中HSP70-2啟動(dòng)子+GFP的0RRF+HSP70-1終止子的結(jié)構(gòu)HSP70-25'UTR-HIS-GFP-HSP70-13'UTR全長(zhǎng)2377bp，其序列為SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點(diǎn)為1-8和2370-2377；I-SceI酶切位點(diǎn)為1133-1150和1865-1882；HSP70-2基因啟動(dòng)子(HSP70-25'UTR):9-1105;His標(biāo)簽1109-1126；HindIII酶切位點(diǎn):1127-1132；gfp基因起始密碼子(ATG):1151-1153；終止密碼子(TGA):1883-1885；HSP70-1基因終止信號(hào)(HSP70-13'UTR):1892-2377。G.一種分離的蛋白質(zhì)GFP的四膜蟲表達(dá)載體pD5H8-GST-GFP中HSP70-2啟動(dòng)子+GFP的0RRF+HSP70-1終止子的結(jié)構(gòu)HSP70-25'UTR-GST-GFP-HSP70-13'UTR全長(zhǎng)3034bp，其序列為SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點(diǎn)為1-8和3027-3034；I-SceI酶切位點(diǎn)為1790-1807和2522-2539；HSP70-2基因啟動(dòng)子(HSP70-25'UTR):9-1105;BglII酶切位點(diǎn)1109-1114；Gst標(biāo)簽1115-1783；HindIII酶切位點(diǎn):1784-1789；gfp基因起始密碼子(ATG)=1808-1810；終止密碼子(TGA)=2540-2542；HSP70-1基因終止信號(hào)(HSP70-13'UTR):2549-3026。H.一種分離的蛋白質(zhì)GFP的四膜蟲表達(dá)載體pD5H8-FLAG-GFP中HSP70-2啟動(dòng)子+GFP的0RRF+HSP70-1終止子的結(jié)構(gòu)HSP70-25'UTR-FLAG-GFP-HSP70-13'UTR全長(zhǎng)M34bp，其序列為SEQIDNO.8所示的核苷酸序列，具體位置信息描述如下NotI酶切位點(diǎn)為1-8和2427-2434；I-SceI酶切位點(diǎn)為:1190-1207和1922-1939；HSP70-2基因啟動(dòng)子(HSP70-25'UTR):9-1105;BglII酶切位點(diǎn)1109-1114；FLAG標(biāo)簽1115-1183；HindIII酶切位點(diǎn):1184-1189；gfp基因起始密碼子(ATG)=1208-1210；終止密碼子(TGA)=1940-1942；HSP70-1基因終止信號(hào)(HSP70-13'UTR):1949-2426。將本發(fā)明的表達(dá)載體pD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染到四膜蟲體內(nèi)，39°C熱激誘導(dǎo)1小時(shí)后，可通過westernblotting及熒光顯微鏡觀察綠色熒光檢測(cè)其表達(dá)情況。本發(fā)明中所用不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)B2086與CU^8株系信息參考JacekGaertig,Hamilton,Orias與ColeES等(JacekGaertigandMartinaA.Gorovaky.EfficientmasstransformationofTetrahymenathermophilabyelectroporationofconjugants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,19920ctober,Vol.89,9196-9200；(HamiltonEP,OriasE.Geneticcrosses:settingupcrosses,testingprogeny,andisolatingphenotypicassortants.MethodCellBiolTetrahymenathermophila.Academicpress.2000,vol62:219-228；ColeESetal.AmutationalanalysisofconjugationinTetrahymenathermophila.2.Phenotypesaffectingmiddleandlatedevelopmentthirdprezygoticnucleardivision,pronuclearexchange,pronuclearfusion,andpostzygoticdevelopment.DevBiol.1997Sep15；189(2):233-45.)；SPP培養(yǎng)基配方參考Orias等(OriasE,HamiltonEP,OriasJD.Tetrahymenaasalaboratoryorganism:usefulstrains,cellculture,andcelllinemaintenance.MethodCellBiol:Tetrahymenathermophila.Academicpress.2000.vol62:194.)；電穿孔技術(shù)方法參考GaertigJ等(GaertigJ,GorovskyMA.GenetransferbyelectroporationinTetrahymena.MethodsMolBiol.1995；47:331-48；JGaertig,LGu,BHai,andMAGorovsky.Highfrequencyvector-mediatedtransformationandgenereplacementinTetrahymena.NucleicAcidsRes.1994December11；22(24):5391-5398.)；四膜蟲細(xì)胞的固定、計(jì)數(shù)方法參考章宗涉、黃祥飛編著的《淡水浮游生物研究方法》(北京科學(xué)出版社。1991:334-339。)。利用一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PD5H8-HGFP或PD5H8-HIS-HGFP或pD5H8-GST_HGFP或pD5H8-FLAG_HGFP構(gòu)建的外源蛋白GFP表達(dá)載體PD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP在四膜蟲中表達(dá)外源蛋白GFP中的應(yīng)用，其步驟是(1)外源蛋白GFP的表達(dá)載體pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP，經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染到四膜蟲體內(nèi)。A.將不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲(^Tetrahymenathermophila)B2086與⑶428(兩株四膜蟲均由羅徹斯特大學(xué)的MartinA.Gorovsky教授贈(zèng)送)株系分別接種至50mlSPP培養(yǎng)基于250ml的錐形瓶?jī)?nèi)，30°C適中振蕩，細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為3_5X105/ml。B.800_1500g離心^iiin收集細(xì)胞，用50ml饑餓Buffer清洗、重離心，并重懸細(xì)胞于50ml饑餓Buffer，30°C孵育。C.48小時(shí)后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整密度至3X105/ml。D.將各自50ml細(xì)胞置于同一個(gè)2L錐形瓶?jī)?nèi)，30°C以100-180rpm速度振蕩(以避免細(xì)胞配對(duì))。在電轉(zhuǎn)前IOh停止振蕩，停止后Ih細(xì)胞開始配對(duì)。E.細(xì)胞配對(duì)開始4h后，檢查配對(duì)效率。如果需要高效的轉(zhuǎn)化率，則需要80%以上的配對(duì)率。F.將轉(zhuǎn)化用的DNA重懸于125ul的電轉(zhuǎn)Buffer。若DNA保存在H2O或TE里，則加入相應(yīng)的電轉(zhuǎn)Buffer至總體積為125ul。G.在停止振蕩(或者是混合細(xì)胞)10-10.5h后，于800g離心5min，去上清，將細(xì)胞重懸于100ml電轉(zhuǎn)液，離心(同上Hmin。H.重懸細(xì)胞至Iml電轉(zhuǎn)Buffer(約3X107ml)，立即使用細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)。CET效率在低溫下會(huì)降低，因此細(xì)胞與轉(zhuǎn)化用的DNA不應(yīng)放在冰上。I.將富集的125μ1四膜蟲與50μg相同體積的30°C溫育的質(zhì)粒(pD5H8_GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP)分別混勻，并迅速轉(zhuǎn)移到30°C溫育的0.2cm電擊杯(Bio-Rad公司產(chǎn)品)中，用Bio-Rad電穿孔儀進(jìn)行電擊，電擊參數(shù)為300V，25μF，50Ω，電擊后的電擊杯于室溫Q0-25°C，以下相同)靜置lmin。(2)轉(zhuǎn)染后四膜蟲的培養(yǎng)及篩選A.將電擊后的四膜蟲轉(zhuǎn)移到96mlSPP培養(yǎng)基中，于30°C恒溫箱靜置1小時(shí)，然后均勻分裝到96孔一次性培養(yǎng)皿。B.電擊1216小時(shí)后向96孔培養(yǎng)皿內(nèi)加巴龍霉素(Sigma公司產(chǎn)品)，使每孔內(nèi)的巴龍霉素濃度達(dá)到100μg/ml。C.電擊后第3天，將長(zhǎng)勢(shì)良好的四膜蟲轉(zhuǎn)移至新的96孔一次性培養(yǎng)皿中，并將巴龍霉素濃度提高至200μg/ml。此后每?jī)商煸黾拥陌妄埫顾貪舛忍荻葹?00μg/ml，直至1000μg/ml。D.從1000μg/ml巴龍霉素濃度下長(zhǎng)勢(shì)良好的四膜蟲培養(yǎng)液中挑取單個(gè)四膜蟲細(xì)胞到96孔一次性培養(yǎng)皿中。E.單細(xì)胞挑選3天后，從96孔一次性培養(yǎng)皿內(nèi)選取長(zhǎng)勢(shì)良好的四膜蟲轉(zhuǎn)移到含有200μISPP培養(yǎng)基的96孔一次性培養(yǎng)皿中30°C恒溫培養(yǎng)，保持培養(yǎng)基內(nèi)巴龍霉素濃度為1000μg/ml。(3)WholeCellPCR鑒定轉(zhuǎn)染四膜蟲A.M孔一次性培養(yǎng)皿培養(yǎng)用巴龍霉素篩選至1000μg/ml的轉(zhuǎn)染四膜蟲單克隆至對(duì)數(shù)期。B.WholeCellPCR驗(yàn)證、篩選陽性克隆a.收集150_200ul轉(zhuǎn)染四膜蟲細(xì)胞與1.5ml的離心管中，以最大的轉(zhuǎn)速離心6-10分鐘或更長(zhǎng)，倒掉上清。b.加SO-IOOulIXBufferK(2mMMg2+)到細(xì)胞中，用吸管吹散將其懸浮起來，并轉(zhuǎn)移到0.5ml的離心管中，使用PCR儀在55°C孵育1小時(shí)，99°C變性20分鐘。C.將上述裂解物置于冰上，做PCR，每25ul的體系中20ul上述裂解物，0.5ul10XPCRBuffer,1.4ulMgCl2(25mM)(Final3mM)，0.5uldNTP(IOuM)，IulY_th-gfp_63F(IOuM)，IulY_th-gfp_64R(IOuM)，0.2ulTaq，0.4ulH2O0PCR條件94°C2min，94°C30sec，50°Clmin，68°Clmin,25-35cycles,68°CIOmin0C.以Y-th-gfp-63F，Y_th-gfp-64R為引物，能擴(kuò)增得到約750bp的gfpPCR產(chǎn)物則說明相應(yīng)的培養(yǎng)皿孔內(nèi)篩選到的四膜蟲轉(zhuǎn)染成功，對(duì)應(yīng)四膜蟲含有質(zhì)粒PD5H8-GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP(鑒定結(jié)果如圖28)。(4)免疫印記檢測(cè)轉(zhuǎn)染的四膜蟲中的GFP蛋白的表達(dá)A.將轉(zhuǎn)染成功的四膜蟲轉(zhuǎn)接至裝有50mlSPP培養(yǎng)基的錐形瓶中于30°C培養(yǎng)，巴龍霉素濃度為1000μg/ml。待四膜蟲密度長(zhǎng)至3XIO5個(gè)/ml，39°C熱激，處理1小時(shí)。B.40C，1800rpm離心3min，收集細(xì)胞。C.加入PBS，重懸細(xì)胞，1800rpm離心5min，棄上清。D.加入PBS，稀釋細(xì)胞至5XIO7個(gè)/ml，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，超聲破細(xì)胞。破細(xì)胞參數(shù)frequency:22%,Time:60S,Pause:lsecond，lsecond破至菌體懸液由渾濁變?yōu)槌吻?。E.按比例加入5X蛋白電泳緩沖液，在沸水中煮:3min，離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。F.蛋白質(zhì)電泳完成，將分離膠從玻璃板上取下，于電轉(zhuǎn)液中平衡半小時(shí)，與凝膠同樣大小的NC膜和3mm濾紙按海綿墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿墊的結(jié)構(gòu)裝入轉(zhuǎn)印夾。轉(zhuǎn)印時(shí)凝膠接負(fù)極，NC膜接正極。電轉(zhuǎn)移條件恒壓90V，電轉(zhuǎn)池。G.轉(zhuǎn)印結(jié)束，將NC膜至于PBST中洗滌三次，每次5min。H.將NC膜至于封閉液中封閉l_2h，然后用PBST中洗滌三次，每次5min。I.將NC膜與適當(dāng)稀釋的第一抗體(GFP抗體)，在37°C反應(yīng)lh，然后用PBST中洗滌三次，每次5min。J.將NC膜與適當(dāng)稀釋的第二抗體，在37°C反應(yīng)lh，然后用PBST中洗滌6次，每次5min。K.將NC膜至于顯色液中顯色5min，用UVP冷光CXD爆光檢測(cè)。免疫印記檢測(cè)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的四膜蟲中的GFP蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖四所示。能檢查到27KD的蛋白說明對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染四膜蟲中有GFP表達(dá)。(5)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8-GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP四膜蟲中的GFP蛋白的表達(dá)A.M孔一次性培養(yǎng)皿培養(yǎng)(30°C)WholeCellPCR鑒定正確的轉(zhuǎn)染四膜蟲單克隆至對(duì)數(shù)后，一份39°C熱激，處理1小時(shí)，另一份不做處理。B.各取未熱激處理和39°C熱激處理后的Iml四膜蟲富集至50μ1，離心條件為1500rpm、30°C、2min，然后用ZEISS顯微鏡在藍(lán)色激發(fā)光下(濾光片F(xiàn)ITC)對(duì)誘導(dǎo)的四膜蟲進(jìn)行熒光觀察，并用ZEISS顯微鏡配套的數(shù)碼成像系統(tǒng)拍照記錄，如圖30所示。未熱激處理的轉(zhuǎn)染四膜蟲無法觀察到綠色熒光，熱激處理后四膜蟲能觀察到綠色熒光，則說明對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染四膜蟲中有GFP的表達(dá)。綜上所述，所述一系列表達(dá)載體PD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有四膜蟲HSP70-2基因啟動(dòng)子序列、綠色熒光篩選標(biāo)記HGFP、與四膜蟲rDNA序列高度相似的pD5H8載體序列；所述一系列g(shù)fρ表達(dá)載體pD5H8_GFP，pD5H8-HIS-GFP，pD5H8-GST-GFP，pD5H8-FLAG-GFP上含有四膜蟲HSP70-2基因啟動(dòng)子序列、編碼綠色熒光蛋白ORF序列、與四膜蟲rDNA序列高度相似的pD5H8載體序列，他們分別具有如下特征(1)這一系列表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有可替換的盒式結(jié)構(gòu)HGFP，通過替換為不同的外源基因，以實(shí)現(xiàn)四膜蟲作為一個(gè)外源基因表達(dá)系統(tǒng)；(2)這一系列表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有的可替換的盒式結(jié)構(gòu)HGFP，是通過稀有HceI酶切位點(diǎn)來被替換的，外源基因的選擇幾乎不受限制性內(nèi)切酶的限制，且一步即可替換完成。(3)外源基因的插入到這一系列表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，PD5H8-GST-HGFP,pD5H8-FLAG_HGFP上方向均分別只需一個(gè)PCR反應(yīng)即可驗(yàn)證。(4)這一系列表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有的可替換的盒式結(jié)構(gòu)HGFP兩側(cè)的HceI酶切位點(diǎn)是反向的，替換不同的外源基因時(shí)，可有效地防止載體自連。(5)這一系列表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有可替換的盒式結(jié)構(gòu)HGFP含有綠色熒光篩選標(biāo)記，故可以通過綠色熒光篩選標(biāo)記來篩選外源基因的重組子，重組子的鑒定方便。(6)在巴龍霉素藥物篩選作用下，這一系列表達(dá)載體pD5H8-HGFP，PD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST_HGFP，pD5H8-FLAG_HGFP能使正確克隆至其中的外源基因于四膜蟲中大量擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化。如gfp的四膜蟲表達(dá)載體PD5H8-GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8-GST_GFP或pD5H8-FLAG_GFP轉(zhuǎn)染四膜蟲后，在巴龍霉素藥物篩選作用下，可替換掉四膜蟲體內(nèi)原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜蟲體內(nèi)大量倍增(見圖28)。(7)這一系列表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，PD5H8-FLAG-HGFP上含有高效表達(dá)啟動(dòng)子四膜蟲HSP70-2基因啟動(dòng)子，是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，在四膜蟲中，能高效啟動(dòng)正確克隆至下游的外源基因的表達(dá)。與現(xiàn)已報(bào)道的四膜蟲HSP70-1基因相比，在熱激條件下，效率高1.9倍，實(shí)現(xiàn)下游基因的大量表達(dá)。如gfp的四膜蟲表達(dá)載體pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP轉(zhuǎn)染四膜蟲后，通過免疫印記均檢測(cè)到了gfp蛋白的表達(dá)。(8)這一系列表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP不僅能使正確克隆至其中的外源基因于四膜蟲中大量表達(dá)，而且所表達(dá)的蛋白還具有生物活性。如gfp的四膜蟲表達(dá)載體PD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或PD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP轉(zhuǎn)染四膜蟲后，熒光顯微鏡還能觀察到39°C熱激處理后四膜蟲能發(fā)出綠色熒光，說明該gfp蛋白具有生物活性。所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體含有可替代的綠色熒光篩選標(biāo)記HGFP。所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體的盒式結(jié)構(gòu)HGFP兩側(cè)含有反向的HceI稀有酶切位點(diǎn)，一步引入外源基因時(shí)用于克隆的外源片段的正反向引物接頭中含有相應(yīng)的反向互補(bǔ)HceI酶切位點(diǎn)。利用本發(fā)明所述的一系列表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8_HIS-HGFP，PD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG_HGFP構(gòu)建的外源蛋白的四膜蟲表達(dá)載體經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染到四膜蟲體內(nèi)后用于蛋白質(zhì)表達(dá)具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)四膜蟲廣泛分布于全球各地的淡水環(huán)境中，以攝取水中的細(xì)菌與其他有機(jī)質(zhì)維生，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)造成人體疾病或?qū)θ祟惤】翟斐晌：ΑＲ运哪はx為表達(dá)系統(tǒng)，安全性可罪。(2)嗜熱四膜蟲作為真核生物，較酵母等模式生物和人類具有更高程度的功能保守性，因此一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體可被用于克隆表達(dá)外源基因，特別是表達(dá)真核蛋白，如抗體，病毒表面抗原，跨膜蛋白，酶，抗菌肽等藥物等，這些蛋白質(zhì)在治療藥物開發(fā)；診斷；人類和動(dòng)物疫苗的開發(fā)；藥物設(shè)計(jì)，工業(yè)酶生產(chǎn)等方面具有廣泛的應(yīng)用。(3)作為單細(xì)胞生物，四膜蟲與其它細(xì)胞系(如哺乳動(dòng)物體細(xì)胞)相比，四膜蟲作為第一種實(shí)現(xiàn)細(xì)胞同步化的真核生物可以進(jìn)行無菌純培養(yǎng)，培養(yǎng)更簡(jiǎn)單、快速和經(jīng)濟(jì)，操作精確度和可控制性強(qiáng)；同時(shí)四膜蟲生活周期短且具備真核生物基本生命過程，并且不具有類似于酵母的復(fù)雜胞壁結(jié)構(gòu)，卻含有可觀的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)。四膜蟲中表達(dá)蛋白只有簡(jiǎn)單的N-糖基化，不存在如酵母中豐富的甘露糖殘基修飾，植物中豐富的木糖殘基修飾等非哺乳動(dòng)物中的修飾類型，其獨(dú)特的生物學(xué)使其能夠作為理想的表達(dá)系統(tǒng)。(4)只需將外源蛋白的四膜蟲表達(dá)載體經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染到四膜蟲體內(nèi)即可。(5)可根據(jù)需要任意選擇不帶標(biāo)簽，帶GST標(biāo)簽或帶HIS標(biāo)簽的表達(dá)載體，可用于蛋白質(zhì)的表達(dá)純化，蛋白質(zhì)的功能或相互作用的研究等。(6)一系列表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP,pD5H8-GST_HGFP上含有高效表達(dá)啟動(dòng)子。加之巴龍霉素藥物篩選作用下，表達(dá)載體可替換掉四膜蟲體內(nèi)原有的大部分rDNA，使外源基因在四膜蟲體內(nèi)大量倍增(見圖28)，因此外源基因能得到高效的表達(dá)。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。圖1為一種THX-HGFP質(zhì)粒2為一種HSP702-GFP質(zhì)粒3為一種質(zhì)粒TH-HGFP構(gòu)建示意4為一種質(zhì)粒pD5H8-HGFP構(gòu)建示意5為一種質(zhì)粒TH-HIS-HGFP構(gòu)建示意6為一種質(zhì)粒pD5H8-HIS-HGFP構(gòu)建示意7為一種質(zhì)粒TH-GST-HGFP構(gòu)建示意8為一種質(zhì)粒pD5H8-GST-HGFP構(gòu)建示意9為一種質(zhì)粒TH-FLAG-HGFP構(gòu)建示意10為一種質(zhì)粒pD5H8-FLAG-HGFP構(gòu)建示意11為一種質(zhì)粒pD5H8-GFP構(gòu)建示意12為一種質(zhì)粒pD5H8-HIS-GFP構(gòu)建示意13為一種質(zhì)粒pD5H8-GST-GFP構(gòu)建示意14為一種質(zhì)粒pD5H8-FLAG-GFP構(gòu)建示意15為一種質(zhì)粒PD5H8的NotI酶切結(jié)果示意圖。泳道1為pD5H8質(zhì)粒對(duì)照；泳道2為λ-EcoT14IdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp,421bp；泳道3-5為pD5H8的NotI單酶切后的條帶，大小約為13.81Λ。圖16為一種質(zhì)粒pD5H8-HGFP的電泳示意圖。泳道1-5為質(zhì)粒pD5H8-HGFP，大小約為16.9kb；泳道6為λ-EcoT14IdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp0圖17為一種質(zhì)粒pD5H8_HIS-HGFP電泳示意圖。泳道1-3為質(zhì)粒pD5H8-HIS-HGFP，大小為16.9kb；泳道4為λ-HindIIIdigestDNAmaker,其條帶大小依次為23130bp，941^3ρ，6557bp，4361bp，2322bp,2027bp。圖18為一種質(zhì)粒pD5H8-GST_HGFP電泳示意圖。泳道1-8為質(zhì)粒pD5H8-GST-HGFP，大小約為17.51Λ；泳道9為λ-EcoTHIdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp，7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bpo圖19為一種質(zhì)粒pD5H8-FLAG_HGFP電泳示意圖。泳道1-4為質(zhì)粒pD5H8-FLAG-HGFP，大小為16.9kb；泳道5為λ-EcoTHIdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp0圖20為一種質(zhì)粒pD5H8_HGFP的HceI酶切結(jié)果示意圖。泳道1為對(duì)照質(zhì)粒pD5H8-HGFP；泳道2為λ-EcoT14IdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp；泳道3-6為質(zhì)粒pD5H8-HGFP被HceI雙酶切后所得兩個(gè)片段，大小分別約為15.2kb,1.51Λ，其中小片段為HGFP片段。圖21為一種質(zhì)粒pD5H8-HIS-HGFP的HceI酶切結(jié)果示意圖。泳道1為對(duì)照質(zhì)粒pD5H8-HIS-HGFP；泳道2為λ-EcoT14IdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp；泳道3-6為質(zhì)粒pD5H8-HIS-HGFP被HceI雙酶切后所得兩個(gè)片段，大小分別約為15.2kb,1.51Λ，其中小片段為HGFP片段。圖22為一種質(zhì)粒pD5H8-GST-HGFP的HceI酶切結(jié)果示意圖。泳道1為對(duì)照質(zhì)粒pD5H8-GST-HGFP；泳道2為λ-EcoT14IdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp,7743bp,6223bp,4254bp,3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp；泳道3-6為質(zhì)粒pD5H8-GST-HGFP被HceI雙酶切后所得兩個(gè)片段，大小分別約為15.7kb,1.51Λ，其中小片段為HGFP片段。圖23為一種質(zhì)粒pD5H8-FLAG-HGFP的HceI酶切結(jié)果示意圖。泳道1-2為質(zhì)粒pD5H8-FLAG-HGFP被HceI雙酶切后所得兩個(gè)片段，大小分別約為15.2kb，1.5kb，其中小片段為HGFP片段。泳道3為對(duì)照質(zhì)粒pD5H8-FLAG_HGFP；泳道4為λ-EcoT14IdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp，7743bp，622!3bp，42Mbp，3472bp,2690bp,1882bp,1489bp，925bp。圖M為一種質(zhì)粒pD5H8_GFP的PCR驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。泳道1-6為以質(zhì)粒pD5H8-GFP為模板，以Y_th-gfp-63F，TH-GFP-R為引物所擴(kuò)得的約850bp的片段，表明對(duì)應(yīng)質(zhì)粒pD5H8-GFP為GFP正向插入的正確質(zhì)粒；泳道7為λ-EcoT14IdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp，7743bp，622!3bp，42Mbp，3472bp，2690bp，1882bp,1489bp，925bp。圖25為一種質(zhì)粒pD5H8_HIS-GFP的PCR驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。泳道1為X-EcoT14IdigestDNAmaker+λ-HindIIIdigestDNAmaker,其條帶大小依次為23130bp,19329bp,9416bp,7743bp,6557bp,6223bp,4361bp,4254bp,3472bp，2690bp，2322bp，2027bp，1882bp,1489bp,925bp,564bp,421bp；泳道2-5為以質(zhì)粒PD5H8-HIS-GFP為模板，以Y_th-gfp-63F，TH-GFP-R為引物所擴(kuò)得的約850bp的片段，表明對(duì)應(yīng)質(zhì)粒pD5H8-HIS-GFP為GFP正向插入的正確質(zhì)粒。圖沈?yàn)橐环N質(zhì)粒pD5H8-GST-GFP的PCR驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。泳道1為λ-EcoT14IdigestDNAmaker,其條帶大小依次為19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp,489bp,925bp,421bp；泳道2-5為以質(zhì)粒PD5H8-GST-GFP為模板，以Y_th-gfp-63F，TH-GFP-R為引物所擴(kuò)得的約850bp的片段，表明對(duì)應(yīng)質(zhì)粒pD5H8-GST-GFP為GFP正向插入的正確質(zhì)粒。圖27為一種質(zhì)粒pD5H8-FLAG-HGFP的PCR驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。泳道1為λ-EcoTHIdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp，1489bp，925bp，421bp；泳道2-6為以質(zhì)粒PD5H8-FLAG-HGFP為模板，以Y_th-gfp-63F，TH-GFP-R為引物所擴(kuò)得的約850bp的片段，表明對(duì)應(yīng)質(zhì)粒PD5H8-FLAG-HGFP為GFP正向插入的正確質(zhì)粒。圖沘為一種轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP)的四膜蟲WholeCellPCR鑒定結(jié)果示意圖。泳道1-3轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GFP的四膜蟲的WholeCellPCR鑒定結(jié)果；泳道4為λ-EcoT14IdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp，7743bp，622!3bp，42Mbp，3472bp,2690bp,1882bp,1489bp,925bp,421bp；泳道5_7為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-HIS_GFP的四膜蟲的WholeCellPCR鑒定結(jié)果；泳道5_7為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-HIS_GFP的四膜蟲的WholeCellPCR鑒定結(jié)果；泳道8-10為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GST_GFP的四膜蟲的WholeCellPCR鑒定結(jié)果。泳道11為λ-EcoTHIdigestDNAmaker，其條帶大小依次為19329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp，1882bp,1489bp,925bp,421bp；泳道12-14為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲的WholeCellPCR鑒定結(jié)果。結(jié)果表明以Y_th-gfp-63F，Y-th-gfp-64R為引物，分別對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8-FLAG-GFP)的四膜蟲做WholeCellPCR鑒定，均能擴(kuò)增得到約750bp的GFP片段，則說明相應(yīng)的四膜蟲轉(zhuǎn)染成功，四膜蟲對(duì)應(yīng)含有質(zhì)粒PD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或PD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP(詳情見28)。實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化。圖四為一種免疫印記檢測(cè)檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GFP(或pD5H8_HIS-GFP或PD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP)的四膜蟲中GFP蛋白的表達(dá)結(jié)果示意圖。圖中結(jié)果表明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GFP的四膜蟲表達(dá)的GFP蛋白用一抗GFP，能檢測(cè)到明顯的約27KD目的條帶，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PD5H8的四膜蟲表達(dá)的蛋白用一抗GFP，并不能檢測(cè)到目的條帶；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PD5H8-HIS-GFP的四膜蟲表達(dá)的GFP蛋白用一抗GFP或HIS，均能檢測(cè)到明顯的約27KD目的條帶，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8的四膜蟲表達(dá)的蛋白用一抗GFP或HIS,并不能檢測(cè)到目的條帶；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PD5H8-GST-GFP的四膜蟲表達(dá)的GFP蛋白用一抗GFP或GST，均能檢測(cè)到明顯的約52KD目的條帶，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8的四膜蟲表達(dá)的蛋白用一抗GFP或GST，并不能檢測(cè)到目的條帶；轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲表達(dá)的GFP蛋白用一抗GFP或FLAG，均能檢測(cè)到明顯的27KD目的條帶，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8的四膜蟲表達(dá)的蛋白用一抗GFP或FLAG，并不能檢測(cè)到目的條帶。說明本發(fā)明中的載體PD5H8-GFP，PD5H8-HIS-GFP，pD5H8_GST_GFP，pD5H8_FLAG_GFP均能在四膜蟲體內(nèi)順利表達(dá)出綠色熒光蛋白。圖30為一種不同處理的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8(或pD5H8_GFP或pD5H8_HIS-GFP或PD5H8-GST-GFP或pD5H8-FLAG_GFP)的四膜蟲，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖。其中Al為39°C處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GFP的四膜蟲1小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖；A2為未處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GFP的四膜蟲，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖。Bl為39°C處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-HIS-GFP的四膜蟲1小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖；B2為未處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-HIS-GFP的四膜蟲，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖。Cl為39°C處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GST-GFP的四膜蟲1小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖；C2為未處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GST-GFP的四膜蟲，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖。Dl為39°C處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲1小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖；D2為未處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖。El為39°C處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8的四膜蟲1小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖；E2為為未處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PD5H8的四膜蟲，在熒光顯微鏡下觀察到的示意圖?？梢钥吹?，本發(fā)明中的載體pD5H8-GFP(或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP)能在四膜蟲體內(nèi)順利表達(dá)出具有活性的綠色熒光蛋白，這就利用用四膜蟲表達(dá)外源蛋白打下了基礎(chǔ)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。具體實(shí)施例用于說明目的面并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1質(zhì)粒TH-HGFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-TGFP-I-SceI-41F:5'GCCAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTGGAAAATAAAAAGCTGGATCC3',Y-TGFP-I-SceI-42R5'GAGCTCTAGGGATAACAGGGTAATAGATAAATTTTATATCAACTCGAGTCAGAA3‘(其中TAGGGATAACAGGGTAAT為I-SceI位點(diǎn))。(b)所用模板為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建質(zhì)粒THX-HGFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分:5μ1IOXBuffer(含MgCl2)，1μ1dNTP(IOmM)，1μ1上游弓丨物(10μΜ)，1μ1下游弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase，補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環(huán)35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約1500bp的目的DNA片段HGFP。(g)將回收的目的片段HGFP用HceI在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段HGFP，2y1I-SceI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收UceI酶切后的片段UceI-HGFP-I-SceI。(2)(a)所用引物為Y_th-gfp-61F5'CCGGTCATTACCCTGTTATCCCTATGACTCGAGTTGATATAAAATTTATAAATAT3'，Y_th-gfp_62R:5‘GGCCAGATTACCCTGTTATCCCTACATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'(其中ATTACCCTGTTATCCCTA為I-SceI位點(diǎn))。(b)所用模板為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建質(zhì)粒HSP702-GFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μIlOXBuffer(含MgCl2)，1μ1dNTP(IOmM)，1μ1上游弓丨物(10μΜ)，1μ1下游弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase，補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min;94°C30s,50°C30s,72°C5min循環(huán)35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約4700bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用HceI在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1I-SceI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HceI酶切后的片段HceI-HSP70-25‘UTR-AMP-HSP70-13'UTR-I-SceI。(3)連接(1)步HceI處理得到的的HceI-HGFP-I-SceI片段與(2)步I-SceI處理得到的載體片段HceI-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-I-SceI，16°C過夜連接。(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(5)從中挑取發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(6)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒TH-HGFP。(7)質(zhì)粒TH-HGFP經(jīng)HceI雙酶切在37°C反應(yīng)2小時(shí)，電泳鑒定表明質(zhì)粒TH-HGFP構(gòu)建正確。(8)將經(jīng)酶切鑒定的TH-HGFP質(zhì)粒送往北京華大基因研究中心測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明HGFP序列通過I-keI位點(diǎn)插入至載體中。具體克隆過程見圖3。實(shí)施例2質(zhì)粒pD5H8-HGFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為:M13正反向引物。(b)所用模板為構(gòu)建質(zhì)粒TH-HGFP0(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1“1dNTP(10mM),ly1上游引物(10μM)，1μ1下游弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase，補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C3.5min循環(huán)；35次；72°C延伸IOmin0(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約3400bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用NotI在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ1lOXBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1NotI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收NotI酶切后的約3100bp的片段NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI。(2)將質(zhì)粒pD5H8經(jīng)NotI在37°C酶切10小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer,10口8質(zhì)粒？05!18，5111NotI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。將酶切產(chǎn)物用1.0%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)電泳分離后，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然后用Biospin膠回收試劑盒回收13.Skb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖15中的泳道“2”所示DNA條帶位置。(3)用熱敏磷酸酶對(duì)步驟O)中的13.Skb大片段回收產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理，反應(yīng)在含IX熱敏磷酸酶緩沖液的50μ1體系中進(jìn)行，37°C作用30min，然后65°C5min熱失活。(4)將步驟(1)中回收的3.Ikb小片段NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI與步驟(3)中經(jīng)去磷酸化酶處理后的13.81Λ大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(6)挑取發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(7)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒pD5H8_HGFP。(8)將上步所提取的質(zhì)粒跑電泳看大小，若無其他污染，則大小為16.9kp的質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)的發(fā)綠色熒光的菌落為陽性克隆。電泳圖如圖16中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質(zhì)粒PD5H8-HGFP構(gòu)建正確。挑取其中3個(gè)質(zhì)粒大小正確的克隆測(cè)序結(jié)果均正確。具體克隆過程見圖4。實(shí)施例3質(zhì)粒TH-HIS-HGFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-2gfp(his)-69F5'CCCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTG3'，Y-th-2gfp(his)-70R:5'CCCAAGCTTATGATGATGATGATGGTGCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'(其中AAGCTT為HindIII位點(diǎn))。(b)所用模板為構(gòu)建質(zhì)粒TH-HGFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1“1dNTP(IOmM)，1μ1上游引物(10μΜ)，1μ1下游引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase,補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C6.5min循環(huán)35次；72V延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約6200bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用HindIII在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ1IOXBuffer,30ul回收的目的片段，2μ1HindIII酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HindIII酶切后的片段的HindIII-HIS-HSP70-25‘UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-HindIII。(2)將步驟(1)中帶HindIII接頭的HindIII-HIS-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-HindIII片段2ul用加T4連接酶16°C過夜連接。(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(4)從中挑取發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(5)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒TH-HIS-HGFP。(6)質(zhì)粒TH-HIS-HGFP經(jīng)HindIII酶切在37°C反應(yīng)2小時(shí)，電泳鑒定表明質(zhì)粒TH-HIS-HGFP構(gòu)建正確。(7)將經(jīng)酶切鑒定的TH-HIS-HGFP質(zhì)粒送往北京華大基因研究中心測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明載體中含正向插入的HIS標(biāo)簽序列。具體克隆過程見圖5。實(shí)施例4質(zhì)粒pD5H8-HIS-HGFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為M13正反向引物。(b)所用模板為構(gòu)建質(zhì)粒TH-HIS-HGFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1“1dNTP(IOmM)，1μ1上游引物(10μΜ)，1μ1下游引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase，補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C3.5min循環(huán)；35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約3400bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用NotI在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ1lOXBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1NotI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收NotI酶切后的約3100bp的片段NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI。(2)將質(zhì)粒pD5H8經(jīng)NotI在37°C酶切10小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer,10口8質(zhì)粒？05!18，5111NotI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。將酶切產(chǎn)物用1.0%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)電泳分離后，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然后用Biospin膠回收試劑盒回收13.Skb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖15中的泳道所示DNA條帶位置。(3)用熱敏磷酸酶對(duì)步驟O)中的13.Skb大片段回收產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理，反應(yīng)在含IX熱敏磷酸酶緩沖液的50μ1體系中進(jìn)行，37°C作用30min，然后65°C5min熱失活。(4)將步驟(1)中回收的3.Ikb小片段NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI與步驟(3)中經(jīng)去磷酸化酶處理后的13.8kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(6)挑取發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(7)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒pD5H8_HIS-HGFP。(8)將上步所提取的質(zhì)粒跑電泳看大小，若無其他污染，則大小為16.9kp的質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)的發(fā)綠色熒光的菌落為陽性克隆。電泳圖如圖17中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質(zhì)粒PD5H8-HIS-HGFP構(gòu)建正確。挑取其中3個(gè)質(zhì)粒大小正確的克隆測(cè)序結(jié)果均正確。具體克隆過程見圖6。實(shí)施例5質(zhì)粒TH-GST-HGFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-2gfp-(GST)71F:5'CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC3‘，Y_th_2gfp-(GST)72R5'GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3'(其中AAGCTT為HindIII位點(diǎn)，AGATCT為BglII位點(diǎn))。(b)所用模板為構(gòu)建質(zhì)粒TH-HGFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ1IOXBuffer(含MgCl2)，1μ1dNTP(IOmM)，1μ1上游引物(10μΜ)，1μ1下游引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase，補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min;94°C30s,50°C30s,72°C6.5min循環(huán)；35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約6200bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用HindIII，BglII在37V雙酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1HindIII酶，2μ1BglII酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HindIII，BglII雙酶切后的片段的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII。(2)a)所用引物為Y-GST_73F5‘GGAAGATCTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTA3‘，Y-GST-74R5‘CCCAAGCTTACGCGGAACCAGATCCGAT3'(其中AAGCTT為HindIII位點(diǎn)，AGATCT為BglII位點(diǎn))。(b)所用模板為質(zhì)粒pET23a_GST(湖北大學(xué)馬立新教授所贈(zèng))。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ110\8肚化1~(含]\%(12)，1“1dNTP(IOmM)，1μ1上游引物(10μM)，1μ1下游引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTMTaqDNAPolymerase,補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件:94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環(huán)；35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約680bp的目的DNA片段GST。(g)將回收的目的片段用HindIII，BglII在37°C雙酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ1IOXBuffer,30ul回收的目的片段，2μ1HindIII酶，2μ1BglII酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HindIII，BglII雙酶切后的片段的HindIII-GST-BglII。(3)將步驟(1)中帶HindIII及BglII接頭的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII載體片段與步驟U)中帶HindIII及BglII接頭的GST片段加T4連接酶16°C過夜連接。(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(5)從中挑取發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(6)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒TH-GST-HGFP。(7)質(zhì)粒TH-GST-HGFP經(jīng)HindIII，BglII雙酶切在37°C反應(yīng)2小時(shí)，電泳鑒定表明質(zhì)粒TH-GST-HGFP構(gòu)建正確。(8)將經(jīng)酶切鑒定的TH-GST-HGFP質(zhì)粒送往北京華大基因研究中心測(cè)序，表明載體中含有正向插入的正確的GST標(biāo)簽序列。具體克隆過程見圖7。實(shí)施例6質(zhì)粒pD5H8-GST-HGFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為M13正反向引物。(b)所用模板為構(gòu)建質(zhì)粒TH-GST-HGFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1“1dNTP(IOmM)，1μ1上游引物(10μΜ)，1μ1下游引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase,補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C4min循環(huán)；35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約4000bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用NotI在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ1lOXBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1NotI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收NotI酶切后的約3700bp的片段NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI。(2)將質(zhì)粒pD5H8經(jīng)NotI在37°C酶切10小時(shí)，酶切體系為5μ1lOXBuffer,10口8質(zhì)粒？05!18，5111NotI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。將酶切產(chǎn)物用1.0%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)電泳分離后，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然后用Biospin膠回收試劑盒回收13.Skb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖15中的泳道所示DNA條帶位置。(3)用熱敏磷酸酶對(duì)步驟O)中的13.Skb大片段回收產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理，反應(yīng)在含IX熱敏磷酸酶緩沖液的50μ1體系中進(jìn)行，37°C作用30min，然后65°C5min熱失活。(4)將步驟(1)中回收的3.7kb小片段NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI與步驟(3)中經(jīng)去磷酸化酶處理后的13.8kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(6)挑取發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(7)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒pD5H8-GST-HGFP。(8)將上步所提取的質(zhì)粒跑電泳看大小，若無其他污染，則大小為17.5kp的質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)的發(fā)綠色熒光的菌落為陽性克隆。電泳圖如圖18中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質(zhì)粒PD5H8-GST-HGFP構(gòu)建正確。挑取其中3個(gè)質(zhì)粒大小正確的克隆測(cè)序結(jié)果均正確。具體克隆過程見圖8。實(shí)施例7質(zhì)粒TH-FLAG-HGFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-2gfp-(GST)71F5‘CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC3',Y-th-2gfp-(GST)72R5'GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3‘(其中AAGCTT為HindIII位點(diǎn)，AGATCT為BglII位點(diǎn))。(b)所用模板為構(gòu)建質(zhì)粒TH-HGFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1“1dNTP(IOmM)，1μ1上游引物(10μΜ)，1μ1下游引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase,補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C6.5min循環(huán)35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約6200bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用HindIII，BglII在37°C雙酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ1lOXBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1HindIII酶，2μ1BglII酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收Hindlll，BglII雙酶切后的片段的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII。(2)a)所用引物為Y-FLAG-87F:5‘GGAAGATCTATGGACTACAAAGACCATGACGGTGA3‘，Y-FLAG-88R5‘CCCAAGCTTCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGA3‘(其中AAGCTT為HindIII位點(diǎn)，AGATCT為BglII位點(diǎn))。(b)所用模板為pCDNA3.1-FLAG(湖北大學(xué)馬立新教授所贈(zèng)質(zhì)粒)。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ1lOXBuffer(含MgC12)，1μ1dNTP(IOmM)，1μ1上游弓丨物(10μΜ)，1μ1下游弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIU-MTMTaqDNAPolymerase，補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min;94°C30s,50°C30s,72°CImin循環(huán)35次；72°C延伸IOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約87bp的目的DNA片段FLAG。(g)將回收的目的片段用HindIII，BglII在37°C雙酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1HindIII酶，2μ1BglII酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HindIII，BglII雙酶切后的片段的HindIII-FLAG-BglII。(3)將步驟(1)中帶HindIII及BglII接頭的HindIII-HSP70-25'UTR-AMP-HSP70-13'UTR-HGFP-BglII載體片段與步驟U)中帶HindIII及BglII接頭的FLAG片段加T4連接酶16°C過夜連接。(9)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(10)從中挑取發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(11)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒TH-GST-HGFP。(12)質(zhì)粒TH-FLAG-HGFP經(jīng)HindIII，BglII分別單酶切在37°C反應(yīng)2小時(shí)，電泳鑒定表明質(zhì)粒TH-FLAG-HGFP構(gòu)建正確。(13)將經(jīng)酶切鑒定的TH-FLAG-HGFP質(zhì)粒送往北京華大基因研究中心測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明載體含有正向插入的FLAG標(biāo)簽序列。具體克隆過程見圖9。實(shí)施例8:質(zhì)粒pD5H8-FLAG-HGFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為:M13正反向引物。(b)所用模板為構(gòu)建質(zhì)粒TH-FLAG-HGFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ110\8吐€61~(含]\%(12)，1“1dNTP(IOmM)，1μ1上游引物(10μΜ)，1μ1下游引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTaqDNAPolymerase,補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°C4min循環(huán)；35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約3400bp的目的DNA片段。(g)將回收的目的片段用NotI在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ1lOXBuffer，30ul回收的目的片段，2μ1NotI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收NotI酶切后的約3100bp的片段NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI。(2)將質(zhì)粒pD5H8經(jīng)NotI在37°C酶切10小時(shí)，酶切體系為5μ1lOXBuffer,10口8質(zhì)粒？05!18，5111NotI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。將酶切產(chǎn)物用1.0%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)電泳分離后，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然后用Biospin膠回收試劑盒回收13.Skb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖15中的泳道所示DNA條帶位置。(3)用熱敏磷酸酶對(duì)步驟O)中的13.Skb大片段回收產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理，反應(yīng)在含IX熱敏磷酸酶緩沖液的50μ1體系中進(jìn)行，37°C作用30min，然后65°C5min熱失活。(4)將步驟(1)中回收的3.7kb小片段NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI與步驟(3)中經(jīng)去磷酸化酶處理后的13.8kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(6)挑取發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(7)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒pD5H8-FLAG_HGFP。(8)將上步所提取的質(zhì)粒跑電泳看大小，若無其他污染，則大小為17.5kp的質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)的發(fā)綠色熒光的菌落為陽性克隆。電泳圖如圖19中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質(zhì)粒pD5H8-FLAG-HGFP構(gòu)建正確。挑取其中3個(gè)質(zhì)粒大小正確的克隆測(cè)序結(jié)果均正確。具體克隆過程見圖10。實(shí)施例9質(zhì)粒pD5H8-GFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-gfp-63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3',Y-th-gfp-64R5'CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT3'(其中TAGGGATAACAGGGTAAT為HceI位點(diǎn))。(b)所用模板為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建質(zhì)粒HSP702-GFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ1IOXBuffer(含MgCl2)，1μ1dNTP(IOmM)，1μ1上游弓丨物(10μΜ)，1μ1下游弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTMTaqDNAPolymerase，補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件:94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環(huán)35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約750bp的目的DNA片段GFP。(g)將回收的目的片段GFP用I-keI在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer,30ul回收的目的片段GFP，2y1I-SceI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HceI酶切后的片段HceI-GFP-I-SceI。(2)將質(zhì)粒pD5H8-HGFP經(jīng)HceI在37°C酶切10小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer，10yg質(zhì)粒pD5H8-HGFP，2y1I-SceI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。將酶切產(chǎn)物用1.0%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)電泳分離后，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然后用Biospin膠回收試劑盒回收約15.2kb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖20中的泳道所示DNA條帶位置。(3)將步驟(1)中回收的750bp小片段HceI-GFP-I-SceI與步驟(3)中15.2kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(5)挑取不發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(6)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒pD5H8_GFP。(7)質(zhì)粒pD5H8-GFP用引物Y-th-gfp_63F5‘CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3',TH-GFP-R5'CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3'驗(yàn)證GFP片段及其插入方向。PCR產(chǎn)物用0.8%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳鑒定得到圖M中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質(zhì)粒pD5H8-GFP構(gòu)建正確。(8)將經(jīng)PCR鑒定的pD5H8-GFP質(zhì)粒送往北京華大基因研究中心測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明GFP基因正向正確插入到pD5H8-HGFP。具體克隆過程見圖11。實(shí)施例10質(zhì)粒pD5H8-HIS-GFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-gfp-63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3',Y-th-gfp-64R5'CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT3'(其中TAGGGATAACAGGGTAAT為HceI位點(diǎn))。(b)所用模板為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建質(zhì)粒HSP702-GFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ110\8肚作1~(含]\%(12)，1口1dNTP(10mM)，ly1上游引物(10μM)，1μ1下游引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTMTaqDNAPolymerase，補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環(huán)；35次；72°C延伸IOmin0(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約750bp的目的DNA片段GFP。(g)將回收的目的片段GFP用HceI在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段GFP，2y1I-SceI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HceI酶切后的片段HceI-GFP-I-SceI。(2)將質(zhì)粒pD5H8-HIS-HGFP經(jīng)HceI在37°C酶切10小時(shí)，酶切體系為5μ110父8吐€61~，1(^8質(zhì)粒？05!18-!115-邢？，2“1I-SceI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。將酶切產(chǎn)物用1.0%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)電泳分離后，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然后用Biospin膠回收試劑盒回收約15.2kb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖21中的泳道所示DNA條帶位置。(3)將步驟(1)中回收的750bp小片段HceI-GFP-I-SceI與步驟(3)中15.2kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(5)挑取不發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(6)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒pD5H8_HIS-GFP。(7)質(zhì)粒pD5H8-HIS-GFP用引物Y_th-gfp_63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3‘，TH-GFP-R5‘CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3‘驗(yàn)證GFP片段及其插入方向。PCR產(chǎn)物用0.8%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳鑒定得到圖25中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質(zhì)粒pD5H8-HIS-GFP構(gòu)建正確。(8)將經(jīng)PCR鑒定的pD5H8-HIS-GFP質(zhì)粒送往北京華大基因研究中心測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明GFP基因正向正確插入到pD5H8-HIS-HGFP。具體克隆過程見圖12。實(shí)施例11質(zhì)粒pD5H8-GST-GFP構(gòu)建，其步驟是(1)(a)所用引物為Y-th-gfp-63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3',Y-th-gfp-64R5'CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT3'(其中TAGGGATAACAGGGTAAT為HceI位點(diǎn))。(b)所用模板為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建質(zhì)粒HSP702-GFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ110\8肚作1~(含]\%(12)，1口1dNTP(10mM)，ly1上游引物(10μM)，1μ1下游引物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTMTaqDNAPolymerase，補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環(huán)；35次；72°C延伸IOmin0(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約750bp的目的DNA片段GFP。(g)將回收的目的片段GFP用HceI在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer，30ul回收的目的片段GFP，2y1I-SceI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HceI酶切后的片段HceI-GFP-I-SceI。(2)將質(zhì)粒pD5H8-GST-HGFP經(jīng)HceI在37°C酶切10小時(shí)，酶切體系為5μ110父8吐€61~，1(^8質(zhì)粒？05!18-6511-邢？，2“1I-SceI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。將酶切產(chǎn)物用1.0%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)電泳分離后，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然后用Biospin膠回收試劑盒回收約15.7kb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖22中的泳道所示DNA條帶位置。(3)將步驟(1)中回收的750bp小片段HceI-GFP-I-SceI與步驟(3)中15.7kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(5)挑取不發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(6)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒pD5H8-GST_GFP。(7)質(zhì)粒pD5H8-GST-GFP用引物Y-th-gfp_63F5‘CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3‘，TH-GFP-R5‘CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3‘驗(yàn)證GFP片段及其插入方向。PCR產(chǎn)物用0.8%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳鑒定得到圖沈中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質(zhì)粒pD5H8-GST-GFP構(gòu)建正確。(8)將經(jīng)PCR鑒定的pD5H8-GST-GFP質(zhì)粒送往北京華大基因研究中心測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明GFP基因正向正確插入到pD5H8-GST-HGFP。具體克隆過程見圖13。實(shí)施例12質(zhì)粒pD5H8-FLAG-GFP構(gòu)建，其步驟是(9)(a)所用引物為Y_th-gfp-63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3',Y-th-gfp-64R5'CTCGAGTAGGGATAACAGGGTAATTTTGTATAGTTCATCCATGCCAT3'(其中TAGGGATAACAGGGTAAT為HceI位點(diǎn))。(b)所用模板為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建質(zhì)粒HSP702-GFP。(c)PCR反應(yīng)體系組分5μ110XBuffer(含MgC12)，1μ1dNTP(IOmM),1μ1上游弓丨物(10μΜ)，1μ1下游弓丨物(10μΜ)，1μ1DNA,0.5μ1TITANIUMTMTaqDNAPolymerase，補(bǔ)雙蒸水至50μ1。(d)加樣過程在冰上操作，加完后彈勻管內(nèi)液體，并短暫離心，然后置于PCR儀中。(e)PCR反應(yīng)條件:94°C變性5min；94°C30s,50°C30s,72°CImin循環(huán)35次；72°C延伸lOmin。(f)Axygen膠回收試劑盒回收純化約750bp的目的DNA片段GFP。(g)將回收的目的片段GFP用I-keI在37°C酶切2小時(shí)，酶切體系為5μ110XBuffer,30ul回收的目的片段GFP，2y1I-SceI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。(h)AxygenPCR清潔試劑盒回收HceI酶切后的片段HceI-GFP-I-SceI。(10)將質(zhì)粒pD5H8-FLAG-HGFP經(jīng)HceI在37°C酶切10小時(shí)，酶切體系為5口110\811打61~，1(^8質(zhì)粒？05!18寸1^6-邢？卩，2口1I-SceI酶，補(bǔ)無菌水至50μ1。將酶切產(chǎn)物用1.0%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)電泳分離后，在紫外燈下用刀片切下目的帶，然后用Biospin膠回收試劑盒回收約15.2kb大片段(回收過程參考Biospin膠回收試劑盒說明書)。見圖23中的泳道所示DNA條帶位置。(11)將步驟(1)中回收的750bp小片段I-SceI-GFP-I-SceI與步驟(3)中15.2kb大片段按51的比例混合，加T4連接酶16°C過夜連接。(12)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含50μg/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時(shí)。(13)挑取不發(fā)綠色熒光的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)入含50μg/ml氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(14)用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取構(gòu)建的新質(zhì)粒pD5H8-FLAG_GFP。(15)質(zhì)粒pD5H8-FLAG-GFP用引物Y_th-gfp_63F5'CTGGCCTAGGGATAACAGGGTAATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC3‘,TH-GFP-R5'CTTGCCAATTAAATCAGCTTCA3‘驗(yàn)證GFP片段及其插入方向。PCR產(chǎn)物用0.8%(質(zhì)量比)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳鑒定得到圖27中的泳道所示DNA條帶位置所示，表明質(zhì)粒pD5H8-FLAG-GFP構(gòu)建正確。(16)將經(jīng)PCR鑒定的pD5H8-FLAG-GFP質(zhì)粒送往北京華大基因研究中心測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明GFP基因正向正確插入到pD5H8-FLAG-HGFP。具體克隆過程見圖14。實(shí)施例13利用一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體構(gòu)建的gfp四膜蟲表達(dá)載體pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP轉(zhuǎn)染四膜蟲的步驟是(1)將含有質(zhì)粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8-GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP的菌液轉(zhuǎn)接到含50mlLB(50μg/ml氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。(2)用Ε·Z.N.A.Endo-FreePlasmidMiniKit(Omega公司產(chǎn)品)去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒pD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8-GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP，最后用100μ1IOmMρΗ7·5的H印es緩沖液(Sigma公司產(chǎn)品)洗脫回收柱上的質(zhì)粒。并用Biophotometer分光光度計(jì)(Eppendorf公司產(chǎn)品)測(cè)定提取的質(zhì)粒PD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP的DNA濃度，確認(rèn)提取的質(zhì)粒DNA濃度大于或等于0.4μg/ml，若低于該濃度，則需用3M醋酸鈉加無水乙醇進(jìn)行共沉淀來富集DNA，提高質(zhì)粒DNA濃度(具體操作過程參考J.薩姆布魯克與D.W.拉塞爾著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，黃培堂等譯。2002年8月第三版，北京科學(xué)出版社1688-1689。)。(3)四膜蟲的培養(yǎng)。將不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)B2086與CU^8株系分別轉(zhuǎn)接到50mlSPP培養(yǎng)基于250ml的錐形瓶?jī)?nèi)。在轉(zhuǎn)速為160rpm的搖床上，30°C培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度長(zhǎng)到3_5XIO5個(gè)/ml。SPP培養(yǎng)基配方為1%(質(zhì)量比)Proteosepeptore(Difco公司產(chǎn)品)，0·1%(質(zhì)量比)yeastextract(Oxoid公司產(chǎn)品)，0·2%(質(zhì)量比)glucose(分析純，廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品)，0.003%Ferriccitrate(Sigma公司產(chǎn)品)。Beckman庫爾特細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞密度。(4)四膜蟲的清洗。將50ml四膜蟲轉(zhuǎn)到50ml離心管內(nèi)，用水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)(湘儀TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，本發(fā)明中所有四膜蟲細(xì)胞的離心均用此離心機(jī))800-1500g在30°C離心2min，倒去上清。用50ml于30°C溫育過的Tris緩沖液清洗四膜蟲2次。(5)四膜蟲的饑餓處理。清洗后向離心管中加入少量IOmMpH7.530°C溫育的Tris緩沖液，輕緩振蕩開沉淀四膜蟲，然后將管內(nèi)液體及四膜蟲全部轉(zhuǎn)移到無菌錐形瓶中，并于30°C恒溫水浴靜置2小時(shí)后計(jì)數(shù)，最后用IOmMpH7.530°C溫育的Tris緩沖液調(diào)整四膜蟲密度至3XIO5個(gè)/ml。(6)不同交配型的四膜蟲配對(duì)。將第(5)步中不同交配型的野生型嗜熱四膜蟲B2086與⑶4按11四膜蟲細(xì)胞數(shù)目在2L容量的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)混合，使瓶?jī)?nèi)液體在80IOOml之間。2L錐形瓶置于30°C水浴搖床160rpm振蕩18小時(shí)后停止。停止振蕩4小時(shí)后，取出0.5ml四膜蟲，計(jì)算配對(duì)效率。若配對(duì)效率在80%以上，有利于提高后續(xù)的電穿孔實(shí)驗(yàn)效率。停止振蕩10小時(shí)后，取25ml混合的配對(duì)四膜蟲于50ml離心管中，800_1500g在30°C離心2min。小心倒去上清，然后加入IOmMpH7.530°C溫育的H印es緩沖液(Sigma公司產(chǎn)品)清洗四膜蟲一次。再次于800-1500g在30°C離心aiiin，棄去上清液，富集四膜蟲至125μ1。(7)質(zhì)粒pD5H8-GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP通過電穿孔法進(jìn)入四膜蟲。將富集的125μ1四膜蟲與50yg相同體積的30°C溫育的質(zhì)粒HSP702-GFP-pD5H8在滅菌離心管中混勻，并迅速轉(zhuǎn)移到30°C溫育的0.2cm電擊杯(Bio-Rad公司產(chǎn)品)中，然后立即放入電穿孔儀(Bio-Rad公司產(chǎn)品)進(jìn)行電擊，電擊參數(shù)為300V，25μF，50Ω，電擊后的電擊杯于室溫靜置Imin。實(shí)施例14轉(zhuǎn)染后四膜蟲的培養(yǎng)及篩選本發(fā)明中的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8-GFP或pD5H8_HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲培養(yǎng)、篩選過程必須無菌操作，四膜蟲的培養(yǎng)、篩選環(huán)境為30°C恒溫箱內(nèi)。具體步驟如下(1)將電擊杯內(nèi)的四膜蟲用粗口吸管輕緩轉(zhuǎn)移到30°C溫育的裝有2細(xì)1SPP培養(yǎng)基的錐形瓶中，接著在30°C恒溫箱靜置1小時(shí)，然后均勻分裝到M孔一次性培養(yǎng)皿中。(2)電擊1216小時(shí)后加巴龍霉素(Sigma公司產(chǎn)品)，使每孔內(nèi)的巴龍霉素濃度達(dá)到100μg/ml。(3)電擊后第3天，觀察培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取20μ1生長(zhǎng)良好的四膜蟲轉(zhuǎn)移至新的96孔一次性培養(yǎng)皿中，加200μ1SPP于其內(nèi)，并且將巴龍霉素濃度提高到200μg/mlο(4)電擊后第4天，取20μ1含巴龍霉素濃度為200μg/ml的四膜蟲至新的96孔一次性培養(yǎng)皿，加200μ1SPP于其內(nèi)，并且將巴龍霉素濃度提高到400μg/ml。(5)電擊后第5天，取20μ1含巴龍霉素濃度為400μg/ml的四膜蟲至新的96孔一次性培養(yǎng)皿，加200μ1SPP于其內(nèi)，并且將巴龍霉素濃度提高到600μg/ml。(6)電擊后第6天，取20μ1含巴龍霉素濃度為600μg/ml的四膜蟲至新的96孔一次性培養(yǎng)皿，加200μ1SPP于其內(nèi)，并且將巴龍霉素濃度提高到800μg/ml。(7)電擊后第7天，取20μ1含巴龍霉素濃度為800μg/ml的四膜蟲至新的96孔一次性培養(yǎng)皿，加200μ1SPP于其內(nèi)，并且將巴龍霉素濃度提高到1000μg/ml。(8)電擊后第8天，在解剖鏡(kiss)下，從含巴龍霉素濃度為1000μg/ml的四膜蟲培養(yǎng)液中，用微毛細(xì)吸管(Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品)挑取單個(gè)四膜蟲到96孔一次性培養(yǎng)皿(CellMar公司產(chǎn)品)中，每孔內(nèi)含一個(gè)四膜蟲細(xì)胞和1000μg/ml巴龍霉素的200μ1SPP培養(yǎng)基。(9)單細(xì)胞挑選3天后，從96孔一次性培養(yǎng)皿內(nèi)選取長(zhǎng)勢(shì)良好的四膜蟲轉(zhuǎn)移到含有200μ1SPP培養(yǎng)基的96孔一次性培養(yǎng)皿中30°C恒溫培養(yǎng)，保持培養(yǎng)基內(nèi)巴龍霉素濃度為ΙΟΟΟμg/ml。實(shí)施例15WholeCellPCR鑒定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8_GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或PD5H8-FLAG-GFP的四膜蟲。(1)24孔一次性培養(yǎng)皿培養(yǎng)用巴龍霉素篩選至ΙΟΟΟμg/ml的轉(zhuǎn)染四膜蟲單克隆至對(duì)數(shù)期。(2)WholeCellPCR驗(yàn)證、篩選陽性克隆a.收集150_200ul轉(zhuǎn)染四膜蟲細(xì)胞與1.5ml的離心管中，以最大的轉(zhuǎn)速離心6-10分鐘或更長(zhǎng)，倒掉上清。b.加SO-IOOulIXBufferK(2mMMg2+)到細(xì)胞中，用吸管吹散將其懸浮起來，并轉(zhuǎn)移到0.5ml的離心管中，使用PCR儀在55°C孵育1小時(shí)，99°C變性20分鐘。c.將上述裂解物置于冰上，做PCR，每25ul的體系中20ul上述裂解物，0.5ul10XPCRBuffer,1.4ulMgC12(25mM)(Final3mM)，0.5uldNTP(IOuM)，lulY_th-gfp-63F(IOuM)，IulY_th-gfp_64R(IOuM)，0.2ulTaq,0.4ulH2O0PCR條件:condition-M°C2min,94°C30sec,50°Clmin,68°Clmin,25-35cycles,68°CIOmin0(3)以Y-th-gfp_63F，Y_th-gfp-64R為引物，能擴(kuò)增得到約750bp的gfpPCR產(chǎn)物則說明相應(yīng)的培養(yǎng)皿孔內(nèi)篩選到的四膜蟲轉(zhuǎn)染成功，對(duì)應(yīng)四膜蟲含有質(zhì)粒PD5H8-GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP(鑒定結(jié)果如圖28)。實(shí)施例16Westernblotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pD5H8_GFP或pD5H8-HIS_GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8-FLAG-GFP四膜蟲中的GFP蛋白質(zhì)的表達(dá)。(1)將轉(zhuǎn)染成功的四膜蟲轉(zhuǎn)接至裝有50mlSPP培養(yǎng)基的錐形瓶中于30°C培養(yǎng)，巴龍霉素濃度為ΙΟΟΟμg/ml。待四膜蟲密度長(zhǎng)至3XIO5個(gè)/ml，39°C熱激，處理1小時(shí)。(2)4"C，1800rpm離心3min，收集細(xì)胞。(3)加入PBS，重懸細(xì)胞，1800rpm離心5min，棄上清。(4)加入PBS，稀釋細(xì)胞至5XIO7個(gè)/ml，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，超聲破細(xì)胞。破細(xì)胞參數(shù)frequency:22%,Time:60S,Pause:lsecond，lsecond破至菌體懸液由渾濁變?yōu)槌吻濉?5)按比例加入5X蛋白電泳緩沖液，在沸水中煮:3min，離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。(6)蛋白質(zhì)電泳完成，將分離膠從玻璃板上取下，于電轉(zhuǎn)液中平衡半小時(shí)，與凝膠同樣大小的NC膜和3mm濾紙按海綿墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿墊的結(jié)構(gòu)裝入轉(zhuǎn)印夾。轉(zhuǎn)印時(shí)凝膠接負(fù)極，NC膜接正極。電轉(zhuǎn)移條件恒壓90V，電轉(zhuǎn)池。(7)轉(zhuǎn)印結(jié)束，將NC膜至于PBST中洗滌三次，每次5min。(8)將NC膜至于封閉液中封閉l_2h，然后用PBST中洗滌三次，每次5min。(9)將NC膜與適當(dāng)稀釋的對(duì)應(yīng)第一抗體(GFP抗體、HIS抗體、GST抗體或FLAG抗體)，在37°C反應(yīng)Ih，然后用PBST中洗滌三次，每次5min。(10)將NC膜與適當(dāng)稀釋的第二抗體，在37°C反應(yīng)lh，然后用PBST中洗滌6次，每次5min。(11)將NC膜至于顯色液中顯色5min，用UVP冷光C⑶爆光檢測(cè)。免疫印記檢測(cè)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的四膜蟲中的GFP蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖四所示。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PD5H8-GFP或PD5H8-HIS-GFP或pD5H8_GST_GFP或pD5H8_FLAG_GFP四膜蟲的westernblotting中用相應(yīng)的抗體均分別能檢測(cè)到約27KD，27KD，52KD，27KD的條帶(見表1)，則說明對(duì)應(yīng)四膜蟲中均有GFP蛋白表達(dá)。表1:ffesternblotting檢測(cè)結(jié)果權(quán)利要求1.一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PD5H8-HGFP，其序列為SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PD5H8-HIS-HGFP，其序列為SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。3.一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PD5H8-GST-HGFP，其序列為SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。4.一種一步法引入外源基因的四膜蟲轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體PD5H8-FLAG-HGFP，其序列為SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。5.權(quán)利要求1至4項(xiàng)所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體含有可替代的綠色熒光篩選標(biāo)記HGFP。6.權(quán)利要求1至4項(xiàng)所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體的盒式結(jié)構(gòu)HGFP兩側(cè)含有反向的HceI稀有酶切位點(diǎn)，一步引入外源基因時(shí)用于克隆的外源片段的正反向引物接頭中含有相應(yīng)的反向互補(bǔ)^ceI酶切位點(diǎn)。7.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其步驟是(1)利用引物Y-TGFP-I-SceI-41F；·5‘GCCAGTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTGGAAAATAAAAAGCTGGATCC3‘Y-TGFP-I-SceI-42R；·5'GAGCTCTAGGGATAACAGGGTAATAGATAAATTTTATATCAACTCGAGTCAGAAT3'；以質(zhì)粒THX-HGFP為模板擴(kuò)增獲得兩端帶HceI識(shí)別序列接頭的HGFP片段，并用I-SceI處理；(2)利用引物Y-th-gfp-61F·5‘CCGGTCATTACCCTGTTATCCCTATGACTCGAGTTGATATAAAATTTATAAATAT3‘；Y-th-gfp-62R·5‘GGCCAGATTACCCTGTTATCCCTACATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3‘；以質(zhì)粒HSP702-GFP為模板反擴(kuò)載體，并用HceI處理；(3)連接步驟(1)I-SceI處理的HGFP片段與步驟O)I-SceI處理的載體片段得到重組質(zhì)粒TH-HGFP；(4)利用M13正反向引物，以TH-HGFP為模板，PCR擴(kuò)增獲得NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段，然后NotI處理該P(yáng)CR片度；(5)將質(zhì)粒pD5H8經(jīng)NotI單酶切后，回收單切片段，并用熱敏磷酸酶對(duì)該回收片段進(jìn)行去磷酸化處理；(6)將步驟(4)中NotI處理后的NotI-HSP70-25'UTR-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段與步驟(5)中經(jīng)去磷酸化酶處理后得到載體連接，得到所述表達(dá)載體PD5H8-HGFP。(7)利用引物Y-th-2gfp(his)-69F·5‘CCCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATTCTCTG3‘Y-th-2gfp(his)-70R.5‘CCCAAGCTTATGATGATGATGATGGTGCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3‘以質(zhì)粒TH-HGFP為模板反擴(kuò)載體，并用HindIII處理；(8)將步驟(7)HindIII處理過的的載體片段用連接酶處理，使其自連得到重組質(zhì)粒TH-HIS-HGFP；(9)利用M13正反向引物，以TH-HIS-HGFP為模板，PCR擴(kuò)增獲得NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段，然后NotI處理該P(yáng)CR片度；(10)將步驟(10)中NotI處理后的NotI-HSP70-25'UTR-HIS-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段與步驟(5)中經(jīng)去磷酸化酶處理后得到載體連接，得到所述表達(dá)載體PD5H8-HIS-HGFP；(11)利用引物Y-th-2gfp-(GST)71F.5‘CCCAAGCTTTAGGGATAACAGGGTAATATCCCGCGAAATTAATACGAC3‘Y-th-2gfp-(GST)72R.5‘GGAAGATCTCATTTTTGTAAACTTTTTTAATTATTTGTT3‘以質(zhì)粒TH-HGFP為模板反擴(kuò)載體，并用HindIII和BglII雙酶切處理；(12)利用引物Y-GST-73F5'GGAAGATCTTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTA3'Y-GST-74R5'CCCAAGCTTACGCGGAACCAGATCCGAT3'以質(zhì)粒pET23a-GST為模板擴(kuò)增獲得GST片段，并用HindIII和BglII雙酶切處理；(13)連接步驟(12)HindIII和BglII雙酶切處理后的GST片段與步驟(Il)HindIII和BglII雙酶切處理后的載體片段得到重組質(zhì)粒TH-GST-HGFP；(14)利用M13正反向引物，以TH-GST-HGFP為模板，PCR擴(kuò)增獲得NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段，然后NotI處理該P(yáng)CR片度；(15)將步驟(14)中NotI處理后的NotI-HSP70-25'UTR-GST-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段與步驟(5)中經(jīng)去磷酸化酶處理后得到載體連接，得到所述表達(dá)載體PD5H8-GST-HGFP；(16)利用引物Y-FLAG-87F5‘GGAAGATCTATGGACTACAAAGACCATGACGGTGA3‘Y-FLAG-88R5‘CCCAAGCTTCTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCGA3‘以質(zhì)粒ρ⑶NA3.I-FLAG為模板擴(kuò)增獲得FLAG片段，并用HindIII和BglII雙酶切處理；(17)連接步驟(16)HindIII和BglII雙酶切處理后的FLAG片段與步驟(Il)HindIII和BglII雙酶切處理后的載體片段得到重組質(zhì)粒TH-FLAG-HGFP；(18)利用M13正反向引物，以TH-FLAG-HGFP為模板，PCR擴(kuò)增獲得NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段，然后NotI處理該P(yáng)CR片度；(19)將步驟(14)中NotI處理后的NotI-HSP70-25'UTR-FLAG-HGFP-HSP70-13'UTR-NotI片段與步驟(5)中經(jīng)去磷酸化酶處理后得到載體連接，得到所述表達(dá)載體PD5H8-FLAG-HGFP。8.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體在表達(dá)外源蛋白GFP中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種一步法引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體及構(gòu)建方法和應(yīng)用。利用質(zhì)粒HSP702-GFP和THX-HGFP，通過PCR和酶切連接等方法構(gòu)建中間載體TH-HGFP；利用質(zhì)粒TH-HGFP、PET23a-GST和pCDNA3.1-FLAG，通過PCR和酶切連接等方法分別構(gòu)建中間載體TH-HIS-HGFP、TH-GST-HGFP和TH-FLAG-HGFP；利用上述中間載體分別與質(zhì)粒pD5H8，通過PCR和酶切連接等方法構(gòu)建四膜蟲表達(dá)載體pD5H8-HGFP，pD5H8-HIS-HGFP，pD5H8-GST-HGFP，pD5H8-FLAG-HGFP。該系列載體均含有綠色熒光篩選標(biāo)記HGFP，可用于重組子的高通量篩選；該系列載體可替代盒式結(jié)構(gòu)HGFP兩側(cè)均含反向的I-SceI稀有酶切位點(diǎn)，引入外源基因時(shí)，將帶I-SceI接頭的外源基因片段與用I-SceI處理后的該系列載體一步連接，即可得到含外源基因的四膜蟲表達(dá)載體。本發(fā)明操作方便快捷，引入外源基因的四膜蟲表達(dá)載體轉(zhuǎn)染四膜蟲后可實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)。文檔編號(hào)C07K14/435GK102286530SQ20111016265公開日2011年12月21日申請(qǐng)日期2011年6月16日優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日發(fā)明者繆煒,袁冬霞申請(qǐng)人:中國科學(xué)院水生生物研究所