專利名稱：培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
長春花(Caz^ara/7^ iAsros"ei/50是夾竹桃科(Apocynaceae)長春花屬植物，含長春堿(Vinblastine)、長春新堿(Vincristine)、文朵靈(Vindoline)、阿嗎堿(Ajmalicine)、蛇根堿(Serpentine)等100多種萜類吲哚生物堿(Terpenoid indole alkaloids, TIAs)。這些生物堿多數(shù)具有藥理活性，尤其是長春堿和長春新堿是目前應(yīng)用最廣泛的天然抗腫瘤藥物。然而正常情況下在植物體中雙萜類吲哚生物堿(長春堿和長春新堿)的含量極其微少，而且毛狀根和細(xì)胞培養(yǎng)只能產(chǎn)生單萜類吲哚生物堿。目前國內(nèi)外大多是通過先提取長春花中含量相對較多的文多靈和長春質(zhì)堿，再在此基礎(chǔ)上通過化學(xué)半合成長春堿和長春新堿。但由于生物堿結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成難度大、產(chǎn)量低、成本高，使得長春花生物堿大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。因此提高植物生物堿含量對于開發(fā)出低成本、高效的抗腫瘤藥物具有非常重要的意義，并且具有非常廣闊的市場前景。近年來隨著植物代謝工程技術(shù)的快速發(fā)展和對長春花生物堿合成途徑的逐漸明晰，采用基因工程手段為提高長春花TIAs含量提供了一個(gè)簡單有效的途徑。
在植物基因工程研究中，目前普遍認(rèn)為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是一種較為理想的途徑，并在許多植物中獲得了成功。Choi PS等在2004年報(bào)道了發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花遺傳轉(zhuǎn)化方法，但由于長春花的發(fā)根中不含有長春堿和長春新堿，所以其應(yīng)用價(jià)值受到限制。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花的遺傳轉(zhuǎn)化，僅在對長春花
懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化上有報(bào)道，然而細(xì)胞培養(yǎng)在代謝產(chǎn)物和遺傳方面并不具有穩(wěn)定性，并且轉(zhuǎn)基因長春花細(xì)胞在繼代過程中TIAs的含量逐漸降低。
超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Sonication assisted Agrobacterium-mediatedtransformation, SAAT)是一種將農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和超聲波直接轉(zhuǎn)導(dǎo)法相結(jié)合的遺傳轉(zhuǎn)化方法。近年來這種技術(shù)己經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蠶豆、蘿卜、亞麻等不同植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，該方法可以顯著提高轉(zhuǎn)化效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法。本發(fā)明建立了穩(wěn)定的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花遺傳轉(zhuǎn)化體系。
本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟步驟一，取長春花無菌苗，獲取無菌苗的下胚軸；
步驟二，制備根癌農(nóng)桿菌菌液，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)長春花下胚軸的轉(zhuǎn)化；步驟三，取下胚軸，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得愈傷組織；步驟四，將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得綠色愈傷組織；步驟五，將綠色愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得不定芽；步驟六，取不定芽，置入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得長春花轉(zhuǎn)基因植株。
步驟一中，所述長春花無菌苗的獲得具體為取長春花種子，消毒后接種于MS培養(yǎng)基上，25士2。C，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度2，0001x，培養(yǎng)3 4d。
步驟二中，所述根癌農(nóng)桿菌為攜帶pCAMBIA2300-6K5"表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌。
步驟二中，所述制備根癌農(nóng)桿菌菌液具體為取攜帶pCAMBIA2300-6KS"表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌，在添加100mg/L卡那霉素、100mg/L利福平和40rag/L鏈霉素的固體LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH為7. 0;挑取單菌落接種到添加100mg/L卡那霉素、100mg/L利福平和40mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的pH為7.0，培養(yǎng)至對數(shù)期，菌液濃度0D,值為0.8;將菌液以轉(zhuǎn)速5, 000 rpm/min離心8 min，然后用含100Wnol/L乙酰丁香酮的1/2 MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD,值為0. 4，28'C下100rpm搖床振蕩培養(yǎng)2h，得菌液。
步驟二中，所述轉(zhuǎn)化具體為將長春花下胚軸放入無菌的EP管中，加入含100Mraol/L的乙酰丁香酮的1/2 MS液體培養(yǎng)基將其懸浮，超聲波處理80 W，處理10min，之后將下胚軸浸入0D,為0. 4的根癌農(nóng)桿菌菌液中，100 rpm搖床震蕩培養(yǎng)，30min后棄去菌液，用無菌濾紙將表面菌液吸干；將下胚軸平鋪于添加100Mmol/L乙酰丁香酮的1/2 MS培養(yǎng)基上，在26'C遮光的恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2d。
步驟三中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 0. lmg/L 2， 4-二氯苯氧乙酸+ 0. lmg/L a-萘乙酸+頭孢霉素500 mg/L+卡那霉素40mg/L +150 mg/L水解乳蛋白+250 mg/L脯氨酸+3。/。蔗糖+3g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5. 8。；
步驟四中，所述分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2. 5 mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 25 mg/La -萘乙酸+頭孢霉素500 mg/L+卡那霉素70 mg/L+150 mg/L水解乳蛋白+250 mg/L脯氨酸+ 3%蔗糖+ 3g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5. 8。
步驟五中，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1 mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 1mg/L 3-吲哚乙酸+頭孢霉素500mg/L+卡那霉素90 mg/L+150 mg/L水解乳蛋白+250 mg/L脯氨酸+3y。蔗糖+3g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5. 8。
步驟六中，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+頭孢霉素500 mg/L+O. 3 mg/L a -萘乙酸+ 3。/。蔗糖+3g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5. 8。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明建立了穩(wěn)定的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步研究代謝途徑調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和提高TIAs的含量奠定了基礎(chǔ)，能進(jìn)一步應(yīng)用到生產(chǎn)TIAs代謝產(chǎn)物的基因工程育種中。


圖1為質(zhì)粒pCAMBIA 2300-GW 的T-DNA區(qū)域圖譜；圖2為長春花根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化；圖3為6K 基因在長春花再生植株根和葉中的表達(dá)；圖4為轉(zhuǎn)Gi/5基因長春花的PCR檢測結(jié)果。
本發(fā)明技術(shù)方案中涉及的MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基的具體組分可分別見Murashige T和Skoog F在《Physiologia Plantarum》(植物生理學(xué))1962年第15巻第3期473 497頁上發(fā)表的題為《A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue cultures》(一禾中用于煙草組織培養(yǎng)物快速生長和生物分析的改進(jìn)培養(yǎng)基)和TangK等在《Plant Science》(植物科學(xué))2001年第160巻第6期1035 1042頁上發(fā)表的題為((Transgenic rice plantsexpressing the ferredoxin-like protein (API) from sweet pepper showenhanced resistance to yfe/7Z:/ 。/z7。/7S51 or"se pv. 。2yzae》(表達(dá)來源于舌甘椒的鐵氧環(huán)類蛋白API的轉(zhuǎn)基因水稻顯示出對白葉枯病具有增強(qiáng)的抗性)。細(xì)良，田云龍，郭萍，朱昌雄；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的哈茨木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究，中國生物工程雜志，2008，28(3): 38-43》文獻(xiàn)中公開。根癌農(nóng)桿菌EHA105可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號(hào)為Gambarl。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。如無特別說明，各種培養(yǎng)基配方中的百分?jǐn)?shù)均為重量體積百分?jǐn)?shù)(w/v)。
實(shí)施例
(1) 長春花無菌苗的培養(yǎng)
本發(fā)明所采用的長春花種子購自PanAmerican Seed公司，太平洋系列櫻桃紅色(Pacifica Cherry Red, PCR)。長春花種子經(jīng)75%酒精消毒lmin, 20% NaClO消毒5min，無菌水沖洗3次，用濾紙吸干多余的水分，然后接種于MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 4d，剪取獲得5mm長無菌苗下胚軸。
培養(yǎng)室條件溫度(25 ± 2)°C，光照時(shí)間16 h /d，光照強(qiáng)度2,000 lx。
(2) 根癌農(nóng)桿菌菌液制備植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-6K (如圖1)做為供試材料，材料由上海交通大
學(xué)植物生物技術(shù)研究中心保存。該表達(dá)載體可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，載體編號(hào)為pCAMBIA2301。
用移液器取50 ix L攜帶pCAMBIA2300-^^表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌(-7(TC冰箱保存)，在添加卡那霉素(100mg/L)、利福平(IOO mg/L)和鏈霉素(40呢/L)的固體LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)并保存。轉(zhuǎn)化前挑取單菌落接種到lOraL添加添加卡那霉素(100mg/L)、利福平(100 mg/L)和鏈霉素(40mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于28'C振蕩培養(yǎng)(180 200 rpm)至對數(shù)期，菌液濃度OD,值為0.8。侵染前將菌液以轉(zhuǎn)速5,000 rpm/min離心8 min，然后用含10O陶ol/L乙酰丁香酮(AS)的1/2 MS液體培養(yǎng)基(1/2 MS培養(yǎng)基+3%蔗糖，培養(yǎng)基的pH為5. 8)稀釋至ODe。。值為0. 4，然后置于28。C搖床振蕩培養(yǎng)(100rpm) 2h。(3) 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)化將剪好的長春花下胚軸放入無菌的EP管中，加入含AS (100 u mol/L)的1/2 MS
液體培養(yǎng)基將其懸浮，無菌密封后，超聲波處理功率80W，處理時(shí)間10min。而后將超聲處理后的下胚軸浸入稀釋好的0D6。。為0.4的農(nóng)桿菌菌液中，100rpm搖床震蕩培養(yǎng)，30min后棄去菌液，用無菌濾紙將表面菌液吸干；最后將下胚軸平鋪于添加了 10Oumol/L AS的1/2 MS培養(yǎng)基上，在26。C遮光的恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2d。
(4) 長春花愈傷組織的誘導(dǎo)將共培養(yǎng)后的長春花下胚軸以平臥方式接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，見圖
2。圖2為長春花根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，圖中，(A)長春花再生(l:播種，2:愈傷組織誘導(dǎo)，3, 4:在2種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽)；(B)誘導(dǎo)的愈傷組織以及再
生芽；(C)生根的幼苗；(D)發(fā)育完全的幼苗；(E)移栽到土壤中的幼苗；(F)開花。
所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0. lmg/L2， 4-二氯苯氧乙酸+0. 1mg/L a -萘乙酸+頭孢霉素500 mg/L+卡那霉素40 mg/L +150 mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3%蔗糖+3 g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5. 8;培養(yǎng)溫度為25土1。C，每天光照16h，經(jīng)過10 12 d的光照培養(yǎng)，可在外植體的剪切處形成愈傷組織；
將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25土rC，每天光照16h，經(jīng)過10 12 d的光照培養(yǎng)，愈傷組織被誘導(dǎo)成為具有分化不定芽能力的綠色愈傷細(xì)胞；所述分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2.5 mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 25 mg/L a-萘乙酸+頭孢霉素500 mg/L+卡那霉素70 mg/L+150 rag/L水解乳蛋白+250 mg/L脯氨酸+3%蔗糖+ 3g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5. 8;
(5) 長春花不定芽的分化選取綠色愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 2代，每代12 14 d，
培養(yǎng)溫度為25士rC,每天光照16h，經(jīng)過20d左右的培養(yǎng)，愈傷組織上先形成大量芽點(diǎn)，繼而芽點(diǎn)生長并分化形成不定芽(如圖2);所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1 mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 1 mg/L 3-吲哚乙酸+頭孢霉素500 mg/L+卡那霉素90 mg/L+150mg/L水解乳蛋白+ 250mg/L脯氨酸+3呢蔗糖+3g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5.8;
(6) 長春花不定芽的生根切取從長春花下胚軸分化的不定芽，置入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25±1 °C，每天光照16 h，經(jīng)過15 20d的光照培養(yǎng)，可從不定芽基部分化出根，從而 形成再生的植株；所述生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+頭孢霉素500mg/L+0.3mg/L a -萘乙酸+ 3°/。蔗糖+3 g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5. 8。
(7) 長春花再生植株的快速繁殖 選取生長健壯的長春花再生植株，通過切割增殖手段在快速繁殖培養(yǎng)基中進(jìn)
行培養(yǎng)，形成長春花再生植株；所述快速繁殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+3 g/L 植物凝膠。
(8) 長春花再生植株的移栽
選取生長健壯、繁殖系數(shù)高的植株，移栽到裝有移栽基質(zhì)的花盆中，所述的 移栽基質(zhì)成分為蛭石珍珠巖泥炭土為2:1:6 (體積比)。培養(yǎng)溫度為25±1 °C，每天光照12 h，通過馴化可獲得生長正常的長春花植株。
(9) 轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學(xué)活性檢測 本發(fā)明中用于長春花遺傳轉(zhuǎn)化的載體含有葡萄糖苷酶基因，可采用
X-Gluc作為底物，通過顯色反應(yīng)可直接觀察到組織器官中6K9基因的表達(dá)活性。 取移栽到土里2個(gè)月以上的再生植株新生葉片和根尖組織，加入GUS顯色液(2 mM X-gluc， 100raM磷酸緩沖液pH7.0， 0. 5% Triton X-100， 2 mM K3[Fe(CN)6] ， 2 mM K4[Fe(CN)6])，抽真空幾分鐘，37。C恒溫培養(yǎng)箱中過夜。以pCAMBIA2300-^/S農(nóng) 桿菌作為陽性對照，非轉(zhuǎn)化長春花植株的葉片和根尖作為陰性對照。染色后將材 料轉(zhuǎn)入70%乙醇中脫色2 3次至去除色素后觀察。結(jié)果如圖3所示。圖3為"ff 基因在長春花再生植株根和葉中的表達(dá)
A， C:轉(zhuǎn)^S"基因長春花的根和葉；B， D:非轉(zhuǎn)基因長春花的根和葉對照. 檢測結(jié)果用攜帶^^基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染長春花下胚軸，通過卡那
霉素篩選獲得了 32株再生植株。這些再生植株包括已導(dǎo)入^^基因的轉(zhuǎn)基因植株 和未導(dǎo)入外源基因的非轉(zhuǎn)基因植株。GUS組織化學(xué)染色有9株再生植株顯色，認(rèn) 為有GUS蛋白表達(dá)，初步認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因植株。
(10) 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR分子檢測
根據(jù)6K 基因的編碼序列設(shè)計(jì)正反向引物，檢測T-DNA是否整合到長春花基 因組中。用GUS-F(AGTAAAGTAGAACGGTTTGTGGTTA)和GUS-R來檢測pCAMBIA2300-GUS
9(CAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTA)中T-DNA在長春花基因組的整合情況，PCR的目 標(biāo)產(chǎn)物大小為402 bp。
PCR反應(yīng)體系為:
長春花基因組總DNA1.5 nL
10 X PCR Buffer (Mg2+ Free)2.5 uL
MgCl2(25 mM)1.5 ixL
dNTP (2. 5 mM each)1.5 "
上游引物(10 uM)0.5
下游引物(10 uM)0. 5 uL
/^ 3<7 DNA聚合酶0.3 iiL
ddH20Up to 25 u L
PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3 min; 94。C變性30 s， 54。C退火30 s， 72°C 延伸l min， 30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸8 min。
PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在UVP凝膠成像系統(tǒng)(Transillumi-nator White/UV， UVP， inc., USA)紫外光下拍照。能擴(kuò)增出目標(biāo)大小特異DNA片 段的植株即為轉(zhuǎn)基因植株。
檢測結(jié)果見圖4，擴(kuò)增結(jié)果表明其中7株轉(zhuǎn)基因再生植株中能夠擴(kuò)增出402 bp 的目的條帶，證明這7株是獨(dú)立的轉(zhuǎn)化GUS基因的轉(zhuǎn)基因再生植株。圖4為轉(zhuǎn)"/5" 基因長春花的PCR檢測結(jié)果
M: DNA Marker DL2000; 5 32:卡那霉素抗性植株；陰性對照(緩沖液)； CK:對照(非轉(zhuǎn)基因植株)；+:陽性對照(pCAMBIA2300-^Z5"質(zhì)粒)。
權(quán)利要求
1、一種培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，取長春花無菌苗，獲取無菌苗的下胚軸；步驟二，制備根癌農(nóng)桿菌菌液，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)長春花下胚軸的轉(zhuǎn)化；步驟三，取下胚軸，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得愈傷組織；步驟四，將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得綠色愈傷組織；步驟五，將綠色愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得不定芽；步驟六，取不定芽，置入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得長春花轉(zhuǎn)基因植株。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法， 其特征是，步驟一中，所述長春花無菌苗的獲得具體為取長春花種子，消毒后 接種于MS培養(yǎng)基上，25±2°C，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度2，0001x，培養(yǎng)3 4d。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法， 其特征是，步驟二中，所述根癌農(nóng)桿菌為攜帶pCAMBIA2300-6K 表達(dá)載體的根癌 農(nóng)桿菌。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法， 其特征是，步驟二中，所述制備根癌農(nóng)桿菌菌液具體為取攜帶pCAMBIA2300-6Z/S 表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌，在添加100mg/L卡那霉素、100mg/L利福平和40mg/L鏈 霉素的固體LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH為7.0;挑取單菌落接種到添加 100mg/L卡那霉素、100mg/L利福平和40mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基 的pH為7. 0，培養(yǎng)至對數(shù)期，菌液濃度0De。。值為0. 8;將菌液以轉(zhuǎn)速5， 000 rpm/min 離心8 min，然后用含100陶ol/L乙酰丁香酮的1/2 MS液體培養(yǎng)基稀釋至OD,值 為0.4， 28'C下100rpm搖床振蕩培養(yǎng)2h，得菌液。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法， 其特征是，步驟二中，所述轉(zhuǎn)化具體為將長春花下胚軸放入無菌的EP管中，加 入含100Wnol/L的乙酰丁香酮的1/2 MS液體培養(yǎng)基將其懸浮，超聲波處理80 W， 處理10min，之后將下胚軸浸入0De。。為0. 4的根癌農(nóng)桿菌菌液中，100 rpm搖床震 蕩培養(yǎng)，30min后棄去菌液，用無菌濾紙將表面菌液吸干；將下胚軸平鋪于添加lOOWnol/L乙酰丁香酮的1/2 MS培養(yǎng)基上，在26'C遮光的恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng) 2d。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法， 其特征是，步驟三中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ 0. lmg/L 2， 4-二氯苯氧乙酸+ 0. lmg/L a-萘乙酸+頭孢霉素500 mg/L+卡那霉素40mg/L +150 mg/L水解乳蛋白+250 mg/L脯氨酸+3y。蔗糖+3g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5. 8。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法， 其特征是，步驟四中，所述分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2. 5 mg/L 6-芐基腺嘌呤+0. 25 mg/L a-萘乙酸+頭孢霉素500 mg/L+卡那霉素70 mg/L+150 mg/L水解乳蛋白+250 mg/L脯氨酸+ 3%蔗糖+ 3g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5. 8。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法， 其特征是，步驟五中，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1 rag/L 6-芐基腺嘌 呤+0. 1 mg/L 3-吲哚乙酸+頭孢霉素500mg/L+卡那霉素90 mg/L+150 mg/L水解乳 蛋白+ 250 mg/L脯氨酸+3。/。蔗糖+3g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5. 8。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法， 其特征是，步驟六中，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+頭孢霉素500mg/L+0.3 mg/L (1-萘乙酸+ 3。/。蔗糖+3g/L植物凝膠；培養(yǎng)基的pH為5.8。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的培育根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括如下步驟取長春花無菌苗，獲取無菌苗的下胚軸；制備根癌農(nóng)桿菌菌液，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)長春花下胚軸的轉(zhuǎn)化；取下胚軸，置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得愈傷組織；將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得綠色愈傷組織；將綠色愈傷組織接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得不定芽；取不定芽，置入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得長春花轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明建立了穩(wěn)定的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的長春花遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步研究代謝途徑調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和提高TIAs的含量奠定了基礎(chǔ)，能進(jìn)一步應(yīng)用到生產(chǎn)TIAs代謝產(chǎn)物的基因工程育種中。
文檔編號(hào)C12N15/84GK101665804SQ20091019577
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者刑世海, 唐克軒, 潘琪芳, 荃 王, 王國豐, 芳 袁, 趙靜雅 申請人:上海交通大學(xué)