一種重組呼腸孤病毒、其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，特別涉及一種能夠表達乙肝表面抗原或抗原表位的重 組呼腸孤病毒、其制備方法及其在制備HBV疫苗中的應用。
【背景技術】
[0002] 我國是乙型肝炎流行區(qū)，乙肝表面抗原（HBsAg)攜帶率平均約10%，全國人群乙型 肝炎感染率更高達60%，由其引起的肝硬化和肝癌更是全世界尚未攻克的難題。目前臨床使 用的乙型肝炎疫苗以生物工程生產的HBsAg為抗原，必須肌肉注射激活機體的體液免疫系 統。既不方便也不經濟，人們一直期盼口服型乙型肝炎疫苗。美國科學家首先在土豆中成功 表達了 HBsAg，國內學者跟進在水稻中表達HBsAg，試圖研發(fā)植物型口服乙型肝炎疫苗。但 最終未能通過臨床試驗的檢驗，未能成為成熟的產品。
[0003] 呼腸孤病毒是一種雙鏈RNA病毒，具有穩(wěn)定而裸露的二十面體外殼。通常可存在 于人的呼吸道和胃腸道，并不引起任何已知的疾病，自愿者人體感染實驗研究結果也顯示 一般呼腸孤病毒感染并無臨床癥狀。正因為呼腸孤病毒的這些生物學特性和生物學上的 相對安全性，使我們嘗試改造呼腸孤病毒基因組結構使之成為載體，用于基因治療和生產 新型疫苗。Roner等成功將CAT(Chloramphenicalacetyltransferase)插入呼腸孤病毒 Sigma-2基因片段，穩(wěn)定表達Sigma2-CAT炭合蛋白。本項目將利用呼腸孤病毒作為載體研 發(fā)口服型HBV疫苗，基本的設想是通過口服表達HBV抗原蛋白的重組呼腸孤病毒，后者感 染腸粘膜后進入淋巴結和血液激發(fā)機體的粘膜和體液免疫反應。
[0004] 本發(fā)明是利用基因工程技術將編碼具有較強免疫原性和抗原性的HBsAg基因插 入呼腸孤病毒的外層或非結構蛋白的基因組，最終經篩選建立穩(wěn)定復制、穩(wěn)定表達HBV抗 原的重組病毒株，通過口服重組病毒刺激機體的粘膜和全身體液免疫。
【發(fā)明內容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠表達乙肝表面抗原或抗原表位的重組呼腸孤病毒、 其制備方法及其在制備HBV疫苗中的應用。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的提供一種重組呼腸孤病毒，其特征在于所述重組呼腸孤病毒 能夠表達乙肝表面抗原或抗原表位。
[0007] 優(yōu)選的,所述重組呼腸孤病毒逆轉錄得到的cDNA具有SEQIDN0 :2所示的DNA序 列。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的提供一種重組呼腸孤病毒的制備方法，其特征在于將編碼 HBsAg的124-147位氨基酸(表1)的基因片段克隆入編碼呼腸孤病毒的外層蛋白Sigma-3 的DNA (表2)的開放閱讀框架中，采用逆向轉錄系統產生所述的重組呼腸孤病毒，產生表 達HBsAg抗原表位的Sigma3融合蛋白（圖la、lb)。
[0009] 表1. HBsAg全長DNA序列，編碼226個氨基酸，下劃線部分編碼"A"決定簇 (110-168)的中和免疫表位（124-147位氨基酸)。
[0010]
[0011] 表2. Sigma3的編碼區(qū)cDNA序列(下劃線部分編碼其抗原決定簇）
[0012]
【主權項】
1. 一種重組呼腸孤病毒，其特征在于：所述重組呼腸孤病毒能夠表達乙肝表面抗原或 抗原表位。
2. 如權利要求1所述的重組呼腸孤病毒，其特征在于：所述重組呼腸孤病毒逆轉錄得 到的cDNA具有SEQIDNO : 2所示的DNA序列。
3. -種如權利要求1或2所述的重組呼腸孤病毒的制備方法，其特征在于將編碼 HBsAg的124-147位氨基酸的基因片段克隆入編碼呼腸孤病毒的外層蛋白Sigma-3的DNA 的開放閱讀框架中，采用逆向轉錄系統產生所述的重組呼腸孤病毒。
4. 一種如權利要求1或2所述的重組呼腸孤病毒的應用，其特征在于：所述重組呼腸 孤病毒用于制備HBV疫苗。
5. -種HBV疫苗，其特征在于：含有如權利要求1或2所述的重組呼腸孤病毒和輔料。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組呼腸孤病毒，特別涉及一種能夠表達乙肝表面抗原或抗原表位的重組呼腸孤病毒、其制備方法及其在制備HBV疫苗中的應用。本發(fā)明利用基因工程技術將編碼具有較強免疫原性和抗原性的HBsAg的中和表位的DNA插入呼腸孤病毒的外層或非結構蛋白的基因組，最終經篩選建立穩(wěn)定復制、穩(wěn)定表達HBV抗原的重組病毒株，與目前使用的肌肉注射型乙型肝炎病毒（HBV）疫苗相比較，口服型疫苗既方便，又經濟，更利于推廣。
【IPC分類】A61P31-20, A61K39-15, C12N7-01
【公開號】CN104651321
【申請?zhí)枴緾N201310578140
【發(fā)明人】孫逸武, 馬洪寶
【申請人】孫逸武
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2013年11月18日