一種禾谷鐮刀菌低毒病毒FgHV2/JS16及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種禾谷鐮刀菌低毒病毒FgHV2/JS16 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum Schw.)是鐮刀菌中重要的一個(gè)種，能引起田 間禾本科作物病害。如有小麥赤霉病。侵染麥?；蛴衩缀?，生出白色絮狀或絨狀菌絲，后呈 白色至玫瑰色、白色至粉紅色或白色至磚紅色。有性態(tài)為Gibberella zeae Schw. petch屬 半知菌亞門(mén)真菌。無(wú)性態(tài)屬子囊菌亞門(mén)真菌。在培養(yǎng)基中白色氣生菌絲茂密，基內(nèi)菌絲分 泌紅褐色色素。生活史包括有性世代和無(wú)性世代。有性世代產(chǎn)生子囊殼，梨形有口。棒狀 子囊叢生與子囊殼，每個(gè)子囊里有八個(gè)子囊孢子，子囊孢子紡錘形，通常有三個(gè)隔膜。無(wú)性 世代產(chǎn)生分生孢子，呈鐮刀狀，通常有三到五個(gè)隔膜。
[0003] 禾谷鐮刀菌的寄主范圍廣泛，可侵染谷類作物小麥、大麥和玉米（Bluhm et al. 2007)，并且可以分泌一些毒素物質(zhì)--單端孢霉稀族毒素類（Trichothecenes)和霉菌 毒素雌激素（Oestrogenic mycotoxin)、玉米微菌毒素（Zearelanone)，含有一定水平毒素 的谷物被人畜使用后會(huì)引起明顯的中毒癥狀，包括惡心、嘔吐甚至流產(chǎn)等。近年來(lái)，不同地 區(qū)和不同品種上引起麥類赤霉病的優(yōu)勢(shì)種菌為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum schw) 目前，禾谷鐮刀菌引起的麥類赤霉病的防治主要以化學(xué)防治為主，多使用廣譜性殺菌劑如 阿米西達(dá)、噻菌靈和多菌靈等?；瘜W(xué)藥劑對(duì)赤霉病的防治效果較差，難以挽回?fù)p失。在發(fā)病 嚴(yán)重的田塊，會(huì)引起大量的減產(chǎn)。而大劑量頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥又會(huì)對(duì)自然環(huán)境包括土壤、地 下水等造成嚴(yán)重的污染。藥物殘留會(huì)隨著食物鏈逐漸聚集到人體內(nèi)。土壤和地下水的污染 會(huì)造成自然環(huán)境的不斷惡化，影響人類的生存條件。第二種防治方法主要為農(nóng)事管理。如 要輪作栽培，防止因連作引起病原菌的積累。進(jìn)行土壤、栽培基質(zhì)消毒；栽培時(shí)發(fā)現(xiàn)病株應(yīng) 及時(shí)拔除并銷毀，減少病菌的進(jìn)一步擴(kuò)散。還有掌握好植株栽培密度，加強(qiáng)通風(fēng)透氣，降低 濕度，控制好土壤或基質(zhì)的含水量，宜選用排水良好的基質(zhì)。這些措施能夠一定程度的防治 赤霉病的大爆發(fā)及流行。
[0004] 防治病害比較有效的辦法為培育抗病品種。但截至目前，還沒(méi)有商品化的完 全抗病或完全免疫的小麥品種。小麥對(duì)赤霉病的抗性分為五類，分別為一型抗侵入、二 型抗擴(kuò)展、三型抗毒素積累、四型籽?？骨秩炯拔逍湍筒⌒臀鍌€(gè)類型〃 (Mesterhazy et al.，1995)。目前，單基因轉(zhuǎn)化小麥培育轉(zhuǎn)基因小麥品種在技術(shù)上已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)（Dahleen et al. 2001)。將一些已經(jīng)鑒定的抗赤霉病基因轉(zhuǎn)入優(yōu)良小麥品種中能夠有效的提高對(duì)赤 霉病的抗性。小麥等寄主抗赤霉病基因鑒定數(shù)量有限限制了抗病品種的培育。已鑒定的抗 性基因包括葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶等降解酶以及一些甜蛋白和阻礙脫氧雪腐鐮刀菌烯醇聚 集的蛋白（Anand et al.2003)〇
[0005] 真菌病毒存在于所有的主要類群真菌中。自1962年第一例真菌病毒被報(bào)道以后， 大量的真菌病毒被發(fā)現(xiàn)并研宄。但是真菌病毒的研宄還沒(méi)有得到足夠的重視，并且表現(xiàn)出 一定的滯后性。主要原因包括，第一，真菌病毒侵染不表現(xiàn)出明顯的癥狀，因此不容易被人 所發(fā)掘和重視，而且大部分的真菌學(xué)家在接觸到菌落異常的菌株時(shí)不會(huì)想到可能是由于真 菌病毒侵染導(dǎo)致的。第二，研宄真菌病毒的病毒學(xué)家比較少。當(dāng)前的研宄熱點(diǎn)主要集中在 能減弱寄主致病性的真菌病毒，探索這些病毒的復(fù)制機(jī)制、蛋白功能以及在農(nóng)業(yè)真菌病害 生物防治上的應(yīng)用。至今為止的真菌病毒系統(tǒng)中，僅栗疫菌低毒病毒CHV1/EP713被成功用 于生物防治，它在意大利發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，拯救了因栗疫病危害而瀕臨絕滅的歐洲栗樹(shù)林?，F(xiàn) 階段植物真菌病害的防治是一個(gè)難題，隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量施用，在病害防治的同時(shí)給環(huán) 境造成巨大的污染，包括土壤污染、食品污染、大氣污染和水污染。真菌病毒作為一項(xiàng)生物 防治資源，將會(huì)為真菌病害的防治提供一個(gè)新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種在減弱禾谷鐮刀菌致病性方面具有顯著效 果的禾谷鐮刀菌低毒病毒FgHV2/JS16。
[0007] 一種禾谷鐮刀菌低毒病毒FgHV2/JS16,其全基因組序列如序列表中SEQ ID NO:l 所示。
[0008] 本發(fā)明所述的禾谷鐮刀菌低毒病毒FgHV2/JS16在減弱禾谷鐮刀菌致病性的應(yīng) 用。
[0009] 一種菌株，其含有本發(fā)明所述的禾谷鐮刀菌低毒病毒FgHV2/JS16。
[0010] 本發(fā)明所述的菌株，保藏號(hào)CGMCC NO. 10323,保藏日期：2015年1月20日。
[0011] 本發(fā)明禾谷鐮刀菌低毒病毒FgHV2/JS16與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于：本發(fā)明所述 的禾谷鐮刀菌JS16菌株是本實(shí)驗(yàn)室從江蘇省發(fā)生赤霉病的小麥穗上分離的，已經(jīng)于2015 年1月20日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)進(jìn)行了保藏，登 記入冊(cè)編號(hào)保藏號(hào)CGMCC NO. 10323。本實(shí)驗(yàn)室已成功從JS16菌株鑒定到低毒病毒科病毒 FgHV2/JS16,其可以減弱禾谷鐮刀菌致病性的功能研宄，具有在生物防治中的應(yīng)用潛能，并 具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0012] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的禾谷鐮刀菌低毒病毒FgHV2/JS16作進(jìn)一步說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為本發(fā)明中禾谷鐮刀菌菌株JS16中所提取的雙鏈RNA ;泳道M，DNA marker ; 泳道1，菌株JS16分離到的dsRNA ;泳道2,菌株HN10提取dsRNA作為陽(yáng)性對(duì)照；泳道2,菌 株JS16-F提取dsRNA作為陰性對(duì)照；
[0014] 圖2為本發(fā)明中菌株JS16提取病毒FgHV2/JS16的基因組結(jié)構(gòu)圖，gRNA為病毒基 因組結(jié)構(gòu)圖，D-RNA為病毒所含有缺陷型RNA的結(jié)構(gòu)圖；
[0015] 圖3為本發(fā)明中菌株JS16-F用Northern雜交證實(shí)脫毒情況；gRNA為病毒基因組 RNA，D-RNA為病毒的缺陷型RNA，Probl是地高辛標(biāo)記的病毒基因組RNA 5'端cDNA探針， Prob2是地高辛標(biāo)記的病毒基因組RNA 3'端cDNA探針，JS16是帶毒菌株，JS16-F是脫毒 菌株；
[0016] 圖4為本發(fā)明中菌株JS16和JS16-F在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)JS16是帶毒菌 株，JS16-F是脫毒菌株；
[0017] 圖5為本發(fā)明中菌株JS16和JS16-F在PDA培養(yǎng)基上的菌落直徑（A)、生長(zhǎng)速度 (B)和在PDB培養(yǎng)基上生物量（C) JS16是帶毒菌株，JS16-F是脫毒菌株；
[0018] 圖6為本發(fā)明中菌株JS16和JS16-F的分生孢子產(chǎn)量比較。JS16是帶毒菌株， JS16-F是脫毒菌株；
[0019] 圖7為本發(fā)明中菌株JS16和JS16-F的DON毒素產(chǎn)量比較JS16是帶毒菌株， JS16-F是脫毒菌株；
[0020] 圖8為本發(fā)明中菌株JS16和JS16-F的致病性比較，A是每麥穗發(fā)病小穗數(shù)統(tǒng)計(jì)， B是麥穗發(fā)病情況，C是發(fā)病小穗的籽粒品質(zhì)情況；JS16是帶毒菌株，JS16-F是脫毒菌株。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1禾谷鐮刀菌JS16菌株病毒dsRNA提取
[0022] 先將甘油管中凍存的鐮刀菌菌株進(jìn)行活化。挑取已活化菌株的菌餅，放置于覆蓋 有一層玻璃紙的PDA培養(yǎng)基上平板的中央位置，25°C培養(yǎng)96h。病毒基因組提取方法參照 植物病毒dsRNA提取的方法。RNA提取的過(guò)程中盡量使用一次性塑料器皿，若用器皿如研 磨棒、玻璃器皿等應(yīng)在使用前按下列方法進(jìn)行處理看，用〇. 1% DEPC(焦碳酸二乙酯）水溶 液在37°C下處理12小時(shí)，然后在120°C下高壓滅菌30分鐘以除去殘留的DEPC。實(shí)驗(yàn)操 作的主要步驟如下：①將菌絲已長(zhǎng)滿整個(gè)PDA平板的玻璃紙揭下，輕輕卷曲后放入2ml離 心管內(nèi)，用研磨棒液氮研磨均勻，加入2倍體積（w/v)的1XSTE緩沖液、2倍體積的（v/v) Tris飽和苯酚和2%的10% SDS，室溫?cái)嚢鑜h ;②10,000rpm離心20min后取上清，加入 等體積的氯仿，室溫?cái)嚢鑜〇min ;③12, OOOrpm離心10min后取上清，加入乙醇至終濃度為 16% (v/v)，再加入 4%的 CF-11 纖維素（w/v)。室溫?cái)嚢?30min;④ 12,000，印111離心3111；[11 倒掉上清留沉淀，加入含16%乙醇的IX STE緩沖液，劇烈震蕩lmin，沉淀用含16%乙醇的 1 X STE緩沖液重復(fù)洗滌三次；⑤12, 000, rpm離心3min留沉淀，加入1 X STE緩沖液，劇烈 震蕩lmin，12, 000, rpm離心3min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管內(nèi)，沉淀用1 X STE緩沖液重復(fù) 溶解一次。合并兩次所得的洗脫液；⑥加入1/10體積的NaAc (3mol/L，pH 5. 2)，再加入2. 5 倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后，置于_80°C冰箱lh ;⑦4°C，12, OOOrpm離心15min，棄上清留沉 淀，用70冷乙醇洗滌兩次，吹干后溶于30ul的DEPC處理的ddH20 ;⑧DNA酶消化。加入lul RNase-Free 的 DNase I 和 3. 44ul 的 lOXDNase I buffer 后，37°C消化 30min ;⑨ 1%瓊脂 糖凝膠電泳。
[0023] 結(jié)果：帶毒菌株JS16及其所攜帶的dsRNA病毒經(jīng)DNase消化后的1 %瓊脂糖凝膠 電泳如圖1所不，病毒含有2條dsRNA，一條大于10kb，一條大小5kb左右。
[0024] 本發(fā)明帶毒菌株JS16已經(jīng)于2015年1月20日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心（CGMCC)進(jìn)行了保藏，登記入冊(cè)編號(hào)保藏號(hào)CGMCC NO. 10323。
[0025] 實(shí)施例2禾谷鐮刀菌低毒病毒FgHV2/JS16基因組的cDNA克隆及序列分析
[0026] (1)菌株JS16病毒基因組隨機(jī)引物cDNA克隆
[0027] 隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄：模板為提取菌株JS16的dsRNA，反轉(zhuǎn)錄酶為promega的M-MLV， 所用引物為 Random Primer (26-mer) (5' -GACGTCCAGATCGCGAAITCNNNNNN-3'）。
[0028] PCR擴(kuò)增：取上一步合成的cDNA產(chǎn)物為模板，利用單引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為 Random Primer (20-mer) (5'-GACGTCCAGATCGCGAAITC-3'）。擴(kuò)增所用的酶為全式金公司的 2XTrans